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摘要

在这里, 提出了一种中-高通量分析在细胞级蛋白质磷酸化事件的协议。磷流式细胞术是表征信号畸变、识别和验证生物标志物、评估药效学的有力手段。

摘要

异常细胞信号在肿瘤的发展和进展中起着重要的作用。大多数新颖的靶向疗法确实是针对蛋白质和蛋白质功能, 细胞信号畸变可能因此作为标志物, 以表明个性化的治疗方案。与 DNA 和 RNA 分析相反, 蛋白质活动的变化可以更有效地评估药物敏感性和耐药性的机制。磷流式细胞术是一种功能强大的技术, 用于测量细胞水平的蛋白质磷酸化事件, 这是区别于其他基于抗体的方法的一个重要特征。该方法允许同时分析多种信号蛋白。结合荧光细胞条形码, 在短时间内, 标准细胞仪硬件可以获得较大的中、高吞吐量数据集。磷流式细胞术在基础生物学研究和临床研究中都有应用, 包括信号分析、生物标志物发现和药效学评价。以慢性淋巴细胞白血病细胞为例, 为纯化外周血单个核细胞磷流分析提供了详细的实验协议。

引言

磷流式细胞仪用于分析单细胞分辨率下蛋白质磷酸化水平。该方法的总体目标是在特定条件下映射细胞信号模式。利用流式细胞仪的多参数容量, 可以同时在不同的非均匀细胞群 (如外周血) 中同时分析几种信号通路。这些特性比其他基于抗体的技术具有优势, 如免疫组化、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、蛋白质阵列和反相蛋白阵列 (RPPA)1。磷流式细胞术可与荧光细胞条形码 (FCB) 相结合, 这意味着单个细胞样本被标记为具有独特的荧光染料特征, 使它们可以混合在一起, 染色和分析为单个样品2。这降低了抗体的消耗, 提高了数据的鲁棒性, 通过组合控制和处理样本, 并提高了获取速度。组合 FCB 人口可以被分成较小的样本和染色多达35种不同的磷特定的抗体, 取决于数量的起始材料。因此, 大型分析实验可以使用标准的细胞仪硬件运行。磷流式细胞术应用于多例血液肿瘤患者样本中的特征信号通路, 包括慢性淋巴细胞白血病3、4、5、急性髓系白血病 (AML)6和非霍奇金淋巴瘤7。磷流式细胞术是一种有效的方法来表征信号畸变, 识别和验证生物标志物, 并评估药效学。

给出了磷流式细胞仪分析慢性淋巴细胞白血病患者标本的优化方案 (图 1A)。以基底信号特征、抗 IgM/B 细胞受体刺激和药物摄动为例。提供了一个 FCB 矩阵的详细描述。该协议可以很容易地适应其他悬浮细胞类型。

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研究方案

根据所有捐助者的书面知情同意, 收到了血样。这项研究得到了挪威东南医学和健康研究伦理学区域委员会的批准, 并根据8赫尔辛基宣言进行了人体血液研究。

注:步骤1-3 应在无菌条件下进行组织培养罩。

1. 外周血单个核细胞 (PBMCs) 与慢血症患者血液样本的分离

注意: 人体血液应按照安全等级2的规定进行处理。

  1. 稀释血液1:1 与磷酸盐缓冲盐水 (PBS: 136.9 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 10.1毫米 Na2HPO4 x 2H2O, 1.8 毫米的 PO2, pH 4) 和转移到7.4 毫升管子 (50 毫升/管)。
  2. 小心10毫升的密度梯度介质 (例如, Lymphoprep) 到管底部使用10毫升吸管。
  3. 离心机在 800 x g 20 分钟在4摄氏度。PBMCs 现在可见于密度梯度介质层的顶端。
  4. 使用巴斯德吸管将细胞转化为两个新的50毫升管。用 PBS 洗两次 (填满管子)。
  5. 离心机在 350 x g 的15分钟, 丢弃上清和并用重悬3毫升的 PBS。
  6. 使用首选方法对单元格进行计数。
  7. 离心细胞在 350 x g 5 分钟丢弃上清。注:步骤1.8 到3.2 是可选的。可以直接进行步骤3.3。
  8. 并用重悬胎牛血清中的细胞, 辅以10% 二甲基亚砜 (亚砜), 并在适当的整除数中冷冻使用冷冻管。
    注:亚砜对细胞是有毒的。一旦细胞与血清/亚砜混合, 就能快速工作。细胞可以长期储存在液氮中。

2. 细胞解冻

  1. 在37摄氏度的水浴中迅速解冻细胞。
    注:亚砜对细胞是有毒的。快速工作以限制对亚砜的接触。
  2. 用10毫升的冷罗斯威尔公园纪念研究所培养基 (RPMI 1640 与补充 GlutaMAX, 见材料表) 洗涤细胞一次。
  3. 离心机以 300 x g 为5分钟, 丢弃上清液。
  4. 并用重悬 RPMI 1640 培养基中的细胞补充丙酮酸钠, 记忆非必需氨基酸和青霉素/链霉素 (根据指示加1x 稀释) 和10% 的血清。将细胞转移到小细胞培养瓶中, 在 5% CO2、37°c 1 小时内离开孵化器, 允许细胞校准。

3. 细胞的制备

  1. 使用首选方法计数可行的单元格。
  2. 将细胞转移到50毫升管和离心机在 300 x g 5 分钟。
  3. 并用重悬细胞在 RPMI 1640 培养基 (步骤 2.2) 补充1% 的血清不超过 50 x 106细胞/毫升。
  4. 将所需的细胞悬浮量转移到96井 V 型底板的井中。
    注:井数对应于要测试的条件的数量。刺激时间的样本是从一个井中抽取的。计算50µL 样品每时间点 + 50 µL 的死容量。保存用于补偿控制的样本 (一个无瑕样本 + 每条形码染料一个样本)。
  5. 将96井板转移到预热的37°c 水浴中。把细胞休息10分钟。

4. 细胞的刺激和固定

注:在实验室的长凳上执行步骤 4-8 (即不育)。

注意: 固定缓冲 I 的主要成分是多聚甲醛, 这是有毒的 (吸入和皮肤接触)。小心处理。

  1. 准备一个96井 V 底板与60µL 的固定缓冲 I 每井样品。离开在37°c 水浴。
    注:单元格: 修复缓冲区应为1:1。为了使蒸发在37摄氏度, 固定缓冲最初是丰富的。
  2. 或者, 在刺激前用药物治疗细胞。
  3. 将50µL 控制样品转移到固定板上。吹打上下混合。
  4. 或者, 启动刺激时间-路线通过增加10µg/毫升抗 IgM 细胞。吹打上下混合。
  5. 在每个时间点将50µL 样品转移到固定板上。吹打上下混合。
    注:抗 IgM 诱导信号通常是早期启动的 (分钟)。
  6. 在添加最后一个样品后, 将固定板保持在37°c 10 分钟。

5. 荧光细胞条形码 (FCB)

注:见表 1列出的条形码试剂。

  1. 用 PBS 冲洗固定单元 3x (填好井)。
  2. 离心机以 500 x g 为5分钟, 丢弃上清液。
  3. 用条形码试剂制备96井 V 型底板。吸管5µL 每个条形码试剂每井的数量的组合所需的染色后的所有样品染色矩阵,如图 1B。每个样品将有一个独特的组合不同的条形码浓度。
  4. 并用重悬190µL 的细胞, 并转移到条形码板。完全混合。
    注:染色一个补偿样品与最高的最终浓度用于每个条形码试剂和保存一个无瑕样品。
  5. 在室温下, 在黑暗中, 让细胞保持20分钟的温度。
  6. 用流动洗涤 (PBS, 1% 血清, 0.09% 叠氮化钠) 清洗染色的细胞 (填充水井)。
  7. 离心机以 500 x g 为5分钟, 丢弃上清液。
  8. 添加190µL 的流动洗涤细胞, 并结合条形码样品在一个15毫升管。将每个补偿控制转移到一个单独的1.7 毫升管。
  9. 离心机以 500 x g 为5分钟, 丢弃上清液。

6. 细胞通透胞内抗原染色

注意: 烫发缓冲 III 的主要成份是甲醇, 有毒 (吸入和皮肤接触) 和易燃。小心处理。

  1. 将2毫升的烫发缓冲器 III 转至15毫升管。留在摄氏-20 摄氏度, 所以它是冰后使用。
    注:烫发缓冲器可以留在-20 摄氏度从实验开始。
  2. 添加1.5 毫升的冷烫发缓冲到条形码细胞 (在15毫升管) 和100µL 到每个补偿控制 (在1.7 毫升管) 下降明智的, 而涡流, 以避免细胞聚集在一起。
  3. 将细胞直接转移到-80 摄氏度。最少30分钟。
    注:在这一点上暂停实验是很自然的。烫发缓冲器中的细胞可以长期储存在-80 摄氏度。

7. 抗体染色

注:请参阅资料表, 列出报告的磷抗体。

  1. 将细胞从-80 °c 转移到一盒冰上。
  2. 洗涤3x 与流动洗涤。
    注:重要的是增加流洗涤, 以看到细胞颗粒,例如,增加3毫升的流动洗涤到条形码细胞的人口和1毫升的每个补偿控制。
  3. 离心机在 500 x g 5 分钟在4摄氏度。放弃上清。
  4. 并用重悬条形码细胞数量的流量洗涤, 这允许25µL 细胞悬浮每磷抗体染色。并用重悬200µL 流洗的补偿控制。
  5. 准备96井 V 底板染色抗体。最后的音量将是50µL/好。每一个井, 添加磷特定的抗体稀释在流动洗涤到最后的容量10µL, 表面标记稀释在流动洗涤到最后容量15µL 和25µL 细胞悬浮。
    注:抗体稀释应在实验前滴定。包括同种控件。
  6. 在室温下, 在黑暗中, 让细胞保持30分钟的温度。
  7. 用流动洗涤 (填好井) 洗涤染色的细胞2x。
  8. 离心机以 500 x g 为5分钟, 丢弃上清液。
  9. 并用重悬细胞在150µL 的流动洗涤。

8. 编制补偿管制

  1. 在抗体染色的同时, 为抗体共轭荧光准备补偿控制。根据供应商的指示使用补偿珠。

9. 流式细胞仪分析

注:该实验可以运行在流式细胞仪与高通量取样器 (高温超导)。

  1. 利用无瑕控制优化光电倍增管 (PMT) 电压。
  2. 运行补偿控制并计算补偿矩阵。
  3. 运行示例。事件率应符合仪器规格。

10. 门控策略及数据分析

  1. 将 FCS 文件从实验中导入到流式细胞仪分析软件, 如 FlowJo 或 Cytobank (https://cellmass.cytobank.org)。
  2. 浇注策略
    1. 通过在密度点图中绘制 SSC-a与FSC-a 来选择淋巴细胞。
    2. 显示淋巴细胞和选择汗衫通过绘制 SSC与FSC-W。
    3. 通过绘制 SSC-A与曲面标记, 显示单个单元格并浇下单元格类型。
    4. 显示太平洋蓝与SSC 的细胞类型种群-密度图并根据其太平洋蓝染色强度选择不同的 FCB 种群 (见图 1A)。
    5. 在 FCB 通道上绘制磷抗体通道, 或作为热图 (参见图 1A) 显示磷酸化事件。
  3. 使用磷的逆双曲正弦 (arcsinh) (中值荧光强度) 计算磷信号与同种控制 (基底磷酸化水平, 见图 1D), 或刺激与静态细胞数量 (见图 1E)。

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结果

磷流式细胞术协议的主要步骤如图 1A所示。在所提出的例子中, 条形码试剂蓝在四稀释染色的慢性淋巴细胞白血病细胞。三维条形码可以通过组合三条形码染料进行, 如图 1B所示。然后, 每个条形码试剂与SSC (图 1C) 上的后续浇口 deconvoluted 单个样本。表 1列出了有关条形码试剂的详细信息...

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讨论

磷流式细胞术是测定单细胞蛋白质磷酸化水平的一种强有力的技术。由于该方法依赖于抗体的染色, 磷流式细胞术受抗体可用性的限制。此外, 为了获得可靠的结果, 所有抗体应在使用前滴定和验证。磷特定抗体的滴定详细的协议在别处被描述了12。在面板设计中, 考虑信噪比是至关重要的。在这个例子中, 所有的磷抗体被共轭到 Alexa 647。这种荧光通常提供低与高含量的磷蛋白

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作是在谢蒂尔·保尔森 Taskén 教授实验室进行的, 并得到了挪威癌症协会和 Stiftelsen 克里斯蒂安·卡尔森捷成的支持。约翰. Landskron 和玛丽安客运被承认对手稿的批判性阅读。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 GlutaMAXThermoFisher Scientific61870-010Cell culture medium
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10270169Additive to cell culture medium
Sodium pyruvateThermoFisher Scientific11360-039Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acidsThermoFisher Scientific11140-035Additive to cell culture medium
LymphoprepAlere Technologies AS1114547Density gradient medium
Anti-IgMSouthern Biotech2022-01For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer IBD557870Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer IIIBD558050Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFPThermoFisher ScientificA30005Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl EsterThermoFisher ScientificP10163Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium SaltThermoFisher ScientificP30253Barcoding reagent
Compensation beadsDefined by userCorrect species reactivity
Falcon tubesDefined by user
Eppendorf tubesDefined by user
96 well V-bottom platesDefined by userCompatible with the flow cytometer
CentrifugesDefined by userFor Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bathDefined by userTemperature regulated
Flow cytometerDefined by userWith High Throughput Sampler (HTS)
NameCompanyCatalog NumberComments
Antigen
AKT (pS473)Cell Signaling Technologies4075Clone: D9E
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ATF-2 (pT71)Santa Cruz Biotechnologysc-8398Clone: F-1
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BLNK (pY84)Beckton Dickinson Pharmingen558443Clone: J117-1278
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Histone H3 (pS10)Cell Signaling Technologies9716Clone: D2C8
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IκBαCell Signaling Technologies5743Clone: L35A5
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LAT (pY171)Beckton Dickinson Pharmingen558518Clone: I58-1169
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Lck (pY505)Beckton Dickinson Pharmingen558577Clone: 4/LCK-Y505 
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MEK1 (pS298)Beckton Dickinson Pharmingen560043Clone: J114-64
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NF-κB p65 (pS529)Beckton Dickinson Pharmingen558422Clone: K10-895.12.50
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NF-κB p65 (pS536)Cell Signaling Technologies4887Clone: 93H1
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p38 MAPK (pT180/Y182)Cell Signaling Technologies4552Clone: 28B10
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p44/42 MAPK (pT202/Y204)Cell Signaling Technologies4375Clone: E10
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p53 (pS20)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
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p53 (pS37)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
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PLCγ2 (pY759)Beckton Dickinson Pharmingen558498Clone: K86-689.37
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Rb (pS807/pS811)Beckton Dickinson Pharmingen558590Clone: J112-906
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S6-Ribos. Prot. (pS235/236)Cell Signaling Technologies4851Clone: D57.2.2E
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SAPK/JNK (pT183/Y185)Cell Signaling Technologies9257Clone: G9
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STAT3 (pY705)Beckton Dickinson Pharmingen557815Clone: 4/P-STAT3
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STAT4 (pY693)Zymed/ThermoFisher Scientific71-7900Clone: Polyclonal
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STAT5 (pY694)Beckton Dickinson Pharmingen612599Clone: 47/Stat5(pY694)
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Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)Beckton Dickinson Pharmingen612601Clone: 18/P-Stat6
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)Cell Signaling Technologies12081Clone: C87C1
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ZAP70/SYK (pY319/Y352)Beckton Dickinson Pharmingen557817Clone: 17A/P-ZAP70
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