Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לניתוח בינוני - כדי תפוקה גבוהה של חלבון זרחון אירועים ברמה התאית. Cytometry זרימה פוספו היא גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

Abstract

איתות התא סוטה משחקת תפקיד מרכזי סרטן התפתחות והתקדמות. טיפולים ממוקדים ביותר הרומן מכוונים אכן חלבונים ופונקציות חלבון, שיבושים איתות התא עשוי לשמש לכן סמנים כדי לציין אפשרויות טיפול אישי. לעומת ניתוח DNA ו- RNA, שינויים בפעילות חלבון יכול להעריך בצורה יעילה יותר את המנגנונים שבבסיס תרופות רגישות והתנגדות. Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה המודד אירועים זירחון חלבונים ברמה התאית, תכונה חשובה שמבדיל שיטה זו לבין גישות אחרות נוגדן מבוסס. השיטה מאפשרת ניתוח בו זמנית של מספר חלבונים איתות. בשילוב עם פלורסנט תא barcoding, ניתן לרכוש גדול בינוני - כדי בתפוקה גבוהה-ערכות נתונים על-ידי cytometer סטנדרטי חומרה תוך זמן קצר. Cytometry זרימה פוספו יש יישומים בלימודי ביולוגיה בסיסית והן במחקר קליני, כולל מערכת אזעקה ניתוח, סמן גילוי והערכה של pharmacodynamics. כאן, פרוטוקול נסיוני מפורט מסופק עבור ניתוח תזרים פוספו תאי תאי דם היקפיים מטוהרים, תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית כדוגמא.

Introduction

Cytometry זרימה פוספו משמש כדי לנתח את רמות זרחון החלבון ברזולוציה תא בודד. המטרה הכוללת של השיטה הוא למפות את דפוסי איתות סלולרי בתנאים שצוינו. על ידי ניצול הקיבולת multiparameter של cytometry זרימה, מספר איתות המסלולים ניתן לנתח בו-זמנית בקבוצות משנה שונות של אוכלוסיה הטרוגנית התא כגון דם היקפיים. תכונות אלה מציעות יתרונות אחרים נוגדן מבוססי טכנולוגיות כגון אימונוהיסטוכימיה, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), מערך חלבון שלב הפוכה חלבון מערך (RPPA)¹. ניתן לשלב cytometry זרימה פוספו barcoding תא פלורסנט (FCB), מה שאומר כי דגימות תאים בודדים מסומנות עם חתימות ייחודיות של צבעי פלורסנט כך שהם יכולים להיות מעורבבים יחד, צבעונית נותחו מדגם יחיד². זה מפחית את צריכת נוגדן, מגביר את החוסן נתונים באמצעות השילוב של שליטה ושל דגימות שטופלו ומגביר את המהירות של רכישה. האוכלוסיה FCB יכול להיות לאחר מכן לחלק דוגמיות קטנות יותר, צבעונית עם נוגדנים ספציפיים פוספו ברורים עד 35, בהתאם לכמות החומר מתחיל. ניסויים פרופיל גדולה, ובכך, ניתן להפעיל עם חומרה cytometer רגיל. Cytometry זרימה פוספו הוחלה על פרופיל איתות המסלולים בדגימות החולה של מספר סוגי סרטן hematological, כולל לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL)^3,4,5, לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ⁶ ו שאינה הודג'קין לימפומה⁷. Cytometry זרימה פוספו היא לפיכך בגישה רב-עוצמה כדי לאפיין את סטיות איתות, לזהות, לאמת סמנים ביולוגיים, ולהעריך pharmacodynamics.

. הנה, פרוטוקול ממוטב עבור ניתוח של CLL דגימות מטופלים על ידי פוספו cytometry זרימה מסופק (איור 1 א'). דוגמאות של אפיון איתות הבזליים, אנטי-IgM/B תא קולטן לגירוי סמים ההפרעות מוצגים. תיאור מפורט של מטריקס FCB מסופק. הפרוטוקול בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים ההשעיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

דגימות דם התקבלו בעקבות בכתב הסכמה מדעת מתורמים כל. המחקר היה מאושר על ידי הועדה המחוזית הרפואי, בריאות מחקר אתיקה של דרום-מזרח נורבגיה, המחקר דם אדם היתה מתבצעת על פי הצהרת הלסינקי⁸.

הערה: שלבים 1-3 צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה.

1. בידוד של תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) של דגימות דם החולה CLL

התראה: דם אנושי צריך להיות מטופל על פי תקנות אבטחה ברמה 2.

1. לדלל את הדם 1:1 עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS: 136.9 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10.1 מ מ נה₂HPO₄ x 2 H₂O, מ מ 1.8 ח'₂PO₄, pH 7.4), העברת צינורות 50 מ ל (30 מ ל/צינור).
2. בזהירות שכבה 10 מ"ל של דחיסות צבע בינוני (למשל, Lymphoprep) לתחתית הצינור באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
3. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 20 דקות ב 4 º C. PBMCs גלויים כעת על גבי השכבה הדרגתיות צפיפות בינונית.
4. השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר את התאים לתוך שני צינורות 50 מ ל חדש. לשטוף פעמיים עם PBS (מילוי את הצינורות).
5. צנטריפוגה-350 גרם x עבור 15 דקות להשליך תגובת שיקוע, resuspend ב 3 מ"ל של PBS.
6. לספור את התאים בשיטה המועדפת.
7. Centrifuge התאים ב 350 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע. הערה: צעדים 1.8 ל 3.2 הן אופציונליות. זה אפשרי להמשיך ישירות אל שלב 3.3.
8. Resuspend את התאים העובריים בסרום שור (FBS) בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ומקפיאים למטה ב- aliquots מתאים באמצעות צינורות הקפאה.
   הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר. ברגע התאים מעורבבים עם FBS/דימתיל סולפוקסיד. התאים יכולים להיות מאוחסנים לטווח ארוך חנקן נוזלי.

2. הפשרתו של תאים

1. במהירות להפשיר את התאים בתוך אמבט מים 37 º C.
   הערה: דימתיל סולפוקסיד רעיל לתאים. לעבוד מהר כדי להגביל את החשיפה דימתיל סולפוקסיד.
2. לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של מדיום רוזוול פארק אנדרטת מכון קר (1640 RPMI עם GlutaMAX משלימה, ראה טבלה של חומרים).
3. צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
4. Resuspend התאים RPMI 1640 בינוני עם נתרן פירובט, חומצות אמינו MEM שאינם חיוניים, פניצילין/סטרפטומיצין (נוסף ב- 1 x דילול בהתאם להוראות), 10% FBS. העבר את התאים בקבוקון התרבות תאים קטנים ולהשאיר באינקובטור ב- 5% CO₂, 37 º C למשך שעה לאפשר את התאים לכיול.

3. הכנה של תאים

1. לספור את התאים קיימא באמצעות שיטה מועדפת.
2. להעביר את התאים שפופרת 50 מ ל וזורקים צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דק את תגובת שיקוע.
3. Resuspend תאי RPMI 1640 בינוני (שלב 2.2) בתוספת 1% FBS לא יותר מ 50 x 10⁶ תאים/מ ל....
4. להעביר את הסכום הנדרש של השעיה תא בארות בצלחת V-התחתון טוב 96.
   הערה: מספר בארות מקביל מספר תנאים כדי להיבדק. דוגמאות עבור זמן-קורס גירוי נמשכים מבאר יחיד. חישוב מדגם µL 50 לכל נקודת זמן + 50 µL נפח מת. לשמור את דוגמאות לפקדים פיצוי (דוגמא אחת וללא רבב + דוגמא אחת לכל barcoding צבע).
5. להעביר את הצלחת היטב 96 באמבט מים מחומם מראש-37 מעלות צלזיוס. שאר התאים למשך 10 דקות.

4. גירוי, קיבוע תאים

הערה: בצע שלבים 4-8 על הספסל מעבדה (קרי, לא סטרילי).

התראה: המרכיב העיקרי של מאגר לתקן אני הוא paraformaldehyde, אשר הוא רעיל (שאיפת והעור קשר). . לטפל.

1. להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם 60 µL לתקן את המאגר אני לכל טוב עבור דגימה. יוצאים באמבט מים 37 º C.
   הערה: תאים: מאגר תיקון צריך להיות 1:1. על מנת לאפשר אידוי ב 37 מעלות צלזיוס, המאגר תיקון יש בתחילה בשפע.
2. באופן אופציונלי, פנקו את התאים עם סמים לפני גירוי.
3. דגימת הבקרה 50 µL להעביר הצלחת לתקן. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
4. באופן אופציונלי, להתחיל המסלול-הזמן גירוי על-ידי הוספת 10 µg/mL אנטי-IgM לתאים. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
5. העברה מדגם µL 50 הצלחת לתקן בכל זמן-נקודה. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
   הערה: אנטי-IgM המושרה איתות בדרך כלל מתחילה מוקדם (דקות).
6. להשאיר את הצלחת תיקון 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר הדגימה האחרונה נוספה.

5. פלורסנט תא Barcoding (FCB)

הערה: לקבלת רשימה של barcoding ריאגנטים, ראה טבלה 1 .

1. לשטוף את התאים קבוע 3 x עם PBS (למלא בהם הבארות).
2. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
3. להכין צלחת 96 V-התחתון טוב עם ריאגנטים barcoding. Pipet 5 µL של כל ריאגנט barcoding לכל טוב במספר שילובים הנדרש כדי להכתים את כל הדגימות בעקבות המטריצה מוכתמים, למשל, באיור 1B. כל מדגם יהיה שילוב ייחודי של ריכוזים barcoding שונים.
4. Resuspend תאי µL 190 של PBS ולהעביר לצלחת barcoding. מערבבים ביסודיות.
   הערה: כתם אחד פיצויים לדוגמה עם הריכוז הסופי הגבוה ביותר המשמש עבור כל ריאגנט barcoding ולשמור על דוגמא אחת וללא רבב.
5. להשאיר את התאים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
6. לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם שטיפת זרימה (PBS, 1% FBS, אזיד הנתרן 0.09%) (למלא את הבארות).
7. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
8. להוסיף µL 190 של זרימה שטיפת התאים ולשלב את הדגימות לבר-קוד בשפופרת אחת 15 מ"ל. העברת כל פקד פיצוי צינור mL 1.7 נפרדים.
9. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.

6. תא Permeabilization עבור צביעת אנטיגן תאיים

התראה: המרכיב העיקרי של פרם מאגר השלישי הוא מתנול רעיל (שאיפת והעור קשר) וזה דליק. . לטפל.

1. 2 מ"ל של פרם מאגר השלישי להעביר צינור 15 מ"ל. יוצאים ב-20 ° C, אז זה קרה כקרח על השימוש.
   הערה: ניתן יהיה להשאיר את המאגר פרם ב-20 ° C מתחילת הניסוי.
2. להוסיף 1.5 mL המאגר הקר פרם באוכלוסייה תא לבר-קוד (בשפופרת 15 מ"ל) ו- 100 µL לכל פקד פיצויים (ב מ ל 1.7 צינורות) drop-wise בעת vortexing כדי למנוע התאים להתאחד.
3. העבר את התאים ישירות ל-80 מעלות צלזיוס. להשאיר מינימום של 30 דקות.
   הערה: זה טבעי כדי להשהות את הניסוי בשלב זה. תאים במאגר פרם יכול להיות מאוחסנת לטווח ארוך ב-80 מעלות צלזיוס.

7. נוגדן מכתים

הערה: ראה טבלה של חומרים עבור רשימה של נוגדנים ספציפיים פוספו המדווחת.

1. העבר את התאים מ-80 מעלות צלזיוס קופסה של קרח.
2. לשטוף 3 x עם זרימה לשטוף.
   הערה: זה חשוב להוסיף זרימת שטיפת עודף לראות בגדר תא, למשל, להוסיף 3 מ"ל של שטיפת זרימה באוכלוסייה תא לבר-קוד ו- 1 מ"ל כל פקד פיצוי.
3. צנטריפוגה ב 500 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
4. Resuspend האוכלוסייה תא לבר-קוד באמצעי אחסון של שטיפת זרימה, אשר מאפשר µL 25 של השעיה תא לכל כתם פוספו-נוגדן. Resuspend את הפקדים פיצוי ב 200 µL של זרימה לשטוף.
5. להכין נוגדנים מכתים בצלחת V-התחתון טוב 96. עוצמת הקול הסופי יהיה µL 50/טוב. לכל טוב, מוסיפים נוגדן ספציפי פוספו מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של µL 10, סמן משטח מדולל בכביסה זרימה לאמצעי הסופי של 15 µL, 25 µL של התא השעיה.
   הערה: נוגדן דילולים, צריך להיות טיטרציה לפני הניסוי. כוללים שליטה isotype.
6. להשאיר את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
7. לשטוף את התאים מוכתם 2 x עם זרימה השטיפה (למלא בהם הבארות).
8. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע.
9. Resuspend תאי µL 150 של זרימה לשטוף.

8. הכנת פיצוי שולט

1. היכונו פקדים פיצוי fluorochromes מצומדת נוגדנים במקביל ההכתמה נוגדן. השתמש חרוזים פיצוי לפי הוראות הספק.

9. לזרום Cytometry ניתוח

הערה: הניסוי ניתן להפעיל על cytometer של זרימה עם גבוהה תפוקה סמפלר (HTS).

1. למטב את המתח צינור (PMT) האופטיקה עם הפקד וללא רבב.
2. להפעיל פקדי פיצוי ולחשב את המטריקס פיצוי.
3. הפעל את הדגימות. הקצב אירוע צריך להיות בהתאם למפרטים כלי.

10. gating אסטרטגיה וניתוח נתונים

1. לייבא את הקבצים FCS מהניסוי לתוכנת ניתוח cytometry זרימה כמו FlowJo או Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. אסטרטגיה חסימה
   1. בחר לימפוציטים על ידי התוויית האס-A לעומת FSC-A במגרש נקודה צפיפות.
   2. להציג לימפוציטים ולבחור ללבישה על ידי האס-A לעומת FSC -ו
   3. להציג את תאים בודדים ושער התא להקליד על-ידי התוויית האס-A נגד דה מרקר משטח.
   4. להציג את האוכלוסייה סוג התא פסיפיק בלו לעומת צפיפות האס-A מגרש ובחר האוכלוסיה FCB השונות בהתבסס על שלהם פסיפיק בלו מכתים בעוצמה (ראה איור 1 א').
   5. מגרש בערוץ נוגדן פוספו נגד הערוץ FCB, או כמו של heatmap (ראה איור 1A) כדי להציג את האירועים זירחון.
3. לחשב באמצעות הסינוס ההיפרבולי ההופכי (arcsinh) של MFI (חציון פלורסנט בעוצמה) השליטה isotype ' פוספו-האות לעומת פוספו-אותות (רמות זרחון הבזליים, ראה איור 1D), או של מגורה לעומת אוכלוסיות תאים unstimulated (ראה איור 1E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השלבים העיקריים של פרוטוקול cytometry זרימה פוספו מומחשים איור 1A. בדוגמה שהוצגו, תאים CLL היו מוכתמים הכימית barcoding פסיפיק בלו-דילולים ארבע. Barcoding תלת מימדי יכול להתבצע על-ידי שילוב שלושה צבעים barcoding, כמופיע ב איור 1B. הדגימות בודדים הם deconvoluted אז על ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Cytometry זרימה פוספו היא טכניקה חזקה כדי למדוד רמות זרחון החלבון בתאים בודדים. מאז השיטה מסתמכת על צביעת עם נוגדנים, cytometry זרימה פוספו מוגבל על ידי נוגדנים זמינות. יתר על כן, על מנת לקבל תוצאות אמינות, לכל הנוגדנים צריך להיות טיטרציה ונבדקה לפני השימוש. פרוטוקול מפורט עבור טיטור של נוגדנים ספצי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Cell culture medium
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10270169	Additive to cell culture medium
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039	Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additive to cell culture medium
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Density gradient medium
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt	ThermoFisher Scientific	P30253	Barcoding reagent
Compensation beads	Defined by user		Correct species reactivity
Falcon tubes	Defined by user
Eppendorf tubes	Defined by user
96 well V-bottom plates	Defined by user		Compatible with the flow cytometer
Centrifuges	Defined by user		For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bath	Defined by user		Temperature regulated
Flow cytometer	Defined by user		With High Throughput Sampler (HTS)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)	Beckton Dickinson Pharmingen	564846	Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
IκBα	Cell Signaling Technologies	5743	Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κB p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Cell Signaling Technologies	4375	Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759)	Beckton Dickinson Pharmingen	558498	Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Cell Signaling Technologies	4851	Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)	Cell Signaling Technologies	9257	Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770