JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол для анализа средне высокой производительностью событий фосфорилирование белков на клеточном уровне. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.

Аннотация

Сигнализации аберрантных клеток играет центральную роль в развитии рака и прогрессии. Наиболее Роман целевой терапии действительно направлены на белки и функций белков, и клетки сигнализации аберраций поэтому может служить в качестве биомаркеров для обозначения персонализированные лечения. В отличие от анализа ДНК и РНК изменения в активности белка может более эффективно оценить механизмы лекарственной чувствительности и сопротивления. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощным средством, что меры события фосфорилирование белков на клеточном уровне, важной особенностью, которая отличает этот метод от других подходов, основанных на антитела. Этот метод позволяет одновременный анализ нескольких сигнальных белков. В сочетании с люминесцентные клеток штриховое кодирование большие наборы данных средне высокой производительностью могут быть приобретены по стандартным цитометр оборудования в короткие сроки. Фосфоресцентный проточной цитометрии имеет приложений как в исследованиях по вопросам базовой биологии, так и в клинических исследованиях, в том числе сигнального анализа, обнаружения биомаркеров и оценки фармакодинамика. Здесь для анализа потока фосфористой очищенный периферической крови мононуклеаров, с использованием клеток хронического лимфолейкоза в качестве примера приводится подробный экспериментальный протокол.

Введение

Фосфоресцентный проточной цитометрии используется для анализа уровня фосфорилирование белка одноклеточных разрешением. Общая цель метода является сопоставление клеточных сигналов шаблоны при определенных условиях. Эксплуатируя многопараметрических потенциала проточной цитометрии, несколько сигнальных путей может быть одновременно исследовано в разных подмножеств населения гетерогенных клеток периферической крови. Эти черты предлагают преимущества перед другими технологиями на основе антител, иммуногистохимия, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA), блок протеина и обратной фазы белка массив (RPPA)1. Фосфоресцентный проточной цитометрии может сочетаться с люминесцентные клеток штриховое кодирование (FCB), что означает, что образцы отдельные клетки помечены с уникальными подписями флуоресцентных красителей, так что они могут быть смешаны вместе, витражи и проанализированы как единого образца2. Это уменьшает потребление антител, повышает надежность данных через сочетание управления и обработанные образцы и повышает скорость приобретения. Численностью населения FCB затем можно разделить на меньшие образцов и окрашивали до 35 различных фосфо специфические антитела, в зависимости от количества исходного материала. Таким образом, большие профилирования эксперименты выполняется с стандартным цитометр оборудования. Фосфоресцентный проточной цитометрии был применен к профилю, сигнальные пути в пациентов образцов из нескольких гематологических рака, включая хронического лимфолейкоза (ХЛЛ)3,4,5, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) 6 и неходжкинских лимфом7. Таким образом, фосфористой проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.

Здесь оптимизированный протокол для анализа ХЛЛ пациентов образцов подачей cytometry фосфористой предоставляется (рис. 1A). Приведены примеры базальной сигнализации характеристика, стимуляции рецепторов клеток anti-IgM/B и наркотиков возмущений. Приводится подробное описание FCB матрицы. Протокол может быть легко адаптирована для других типов клеток подвеска.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Образцы крови были получены после письменного информированного согласия от всех доноров. Исследования была утверждена региональным комитетом для медицинских и здравоохранения исследовательской этики Юго-Восточной Норвегии и исследования крови человека была проведена в соответствии с Хельсинкской декларации8.

Примечание: Шаги 1-3 должны выполняться в стерильных условиях в культуре ткани капюшоном.

1. изоляция мононуклеаров периферической крови (получения) из образцов крови пациента ХЛЛ

Предупреждение: Кровь человека должны обрабатываться согласно правилам для 2-го уровня биобезопасности.

  1. Разбавления крови 1:1 с фосфат амортизированное saline (PBS: 136.9 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10.1 мм Na2HPO4 x 2 H2O, 1.8 мм х2PO4, рН 7,4) и передачи в 50 мл трубки (30 мл).
  2. Тщательно слой 10 мл градиента плотности среды (например, Lymphoprep) в нижней части трубки с помощью пипетки 10 мл.
  3. Центрифуга на 800 x g 20 мин при 4 ° C. Получения теперь видны на вершине плотность градиента среднего слоя.
  4. Использование пипетки Пастера перевести клетки на две новые трубы 50 мл. Мыть дважды с PBS (заполнить трубы).
  5. Центрифуга на 350 g x 15 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте в 3 мл ФСБ.
  6. Подсчет количества ячеек с использованием предпочтительного метода.
  7. Центрифуга клетки на 350 x g для 5 минут удалить супернатант. Примечание: 1.8 в 3.2 шаги являются необязательными. Это позволяет перейти непосредственно к шагу 3.3.
  8. Ресуспензируйте клетки плода бычьим сывороточным (ФБС) с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и заморозить вниз в подходящих аликвоты, используя крио трубы.
    Примечание: ДМСО токсичны для клеток. Работе быстро, когда клетки смешивают с FBS/ДМСО. Клетки могут быть хранимой долгосрочной перспективе в жидком азоте.

2. отогрева клетки

  1. Быстро разморозить клетки в ванну воды 37 ° C.
    Примечание: ДМСО токсичны для клеток. Работе быстро, чтобы ограничить воздействие ДМСО.
  2. Вымойте клетки один раз с 10 мл холодной среды Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI 1640 с дополнительной GlutaMAX, смотрите Таблицу материалы).
  3. Центрифуга на 300 x g 5 мин отбросить супернатант.
  4. Ресуспензируйте клеток в среде RPMI 1640, дополненная пируват натрия, MEM несущественные аминокислот и пенициллин/стрептомицина (Добавлено при разбавлении 1 x согласно инструкции) и 10% FBS. Клетки перехода к колбе культуры мелкоклеточный и оставить в инкубаторе в 5% CO2, 37 ° C в течение 1 часа, чтобы позволить клетки для калибровки.

3. Подготовка клеток

  1. Количество жизнеспособных клеток с использованием предпочтительного метода.
  2. Клетки перехода к 50 мл трубки и центрифуги на 300 x g для 5 минут удалить супернатант.
  3. Ресуспензируйте клеток в среде RPMI 1640 (шаг 2.2) дополнен с 1% FBS не более чем 50 x 106 клеток/мл.
  4. Передать необходимое количество суспензию клеток скважин в 96 хорошо V-днище.
    Примечание: Количество скважин соответствует количество условий для проверки. Образцы для стимуляции-курс взяты из одной скважины. Вычислите 50 мкл пример в момент времени + 50 мкл мертвого объема. Сохранение образцов для компенсации элементов управления (один безупречный образец + один образец за штриховое кодирование краситель).
  5. Передача пластину 96 хорошо разогретую 37 ° C водяной бане. Остальные клетки за 10 мин.

4. стимулирование и фиксации клеток

Примечание: Выполните шаги 4-8 на стенде лаборатории (т.е., не стерильный).

Предупреждение: Основной ингредиент исправить буфера я это параформальдегида, который является токсичным (вдыхании и контакте с кожей). Обращаться с осторожностью.

  1. Подготовить 96 хорошо V-днище с 60 мкл буфера исправить я за хорошо на сэмпл. Оставьте в водяной бане 37 ° C.
    Примечание: Ячейки: Исправление буфера должно быть 1:1. Чтобы на испарение при 37 ° C, исправить буфер — первоначально в изобилии.
  2. При необходимости лечения клетки с наркотиками до стимуляции.
  3. Передача 50 мкл пример управления к пластине исправить. Смешайте закупорить вверх и вниз.
  4. При необходимости Начните стимуляции время курс, добавив 10 мкг/мл anti-IgM к клеткам. Смешайте закупорить вверх и вниз.
  5. Передача 50 мкл пример пластины исправить в каждый момент времени. Смешайте закупорить вверх и вниз.
    Примечание: Anti-IgM индуцированной сигнализации обычно начинается рано (в минутах).
  6. Оставьте пластины исправить при 37 ° C в течение 10 минут после того, как последний пример был добавлен.

5. люминесцентные клеток штриховое кодирование (FCB)

Примечание: Приведена Таблица 1 список штриховое кодирование реагентов.

  1. Мыть фиксированные клетки 3 x с PBS (заполнение скважины).
  2. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
  3. Подготовьте 96 хорошо V-днище с реагентами штриховое кодирование. Накапайте 5 мкл Реагента каждого штриховое кодирование на скважину в количество комбинаций, необходимых для пятно все образцы после окрашивания матрицы, например, на рисунке 1B. Каждый образец будет иметь уникальную комбинацию концентраций различных штриховое кодирование.
  4. Ресуспензируйте клетки в 190 мкл PBS и передачи пластину штриховое кодирование. Тщательно перемешать.
    Примечание: Пятно один образец компенсации с самой высокой концентрацией окончательный, используемые для каждого реагента штриховое кодирование и сохранить один безупречный пример.
  5. Оставьте клетки для 20 мин при комнатной температуре, в темноте.
  6. Мыть окрашенные клетки 2 x с потоком мыть (PBS, 1% FBS, азид натрия 0,09%) (заполнить скважин).
  7. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
  8. 190 мкл потока мыть в клетки и объединить перепутываются образцов в одной тубе 15 мл. Передача управления каждого компенсации в отдельном 1,7 мл трубку.
  9. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.

6. клетки Permeabilization для окрашивания внутриклеточных антигена

Предупреждение: Основной ингредиент Пермь буфера III является метанола, который горючих и токсичных (вдыхании и контакте с кожей). Обращаться с осторожностью.

  1. Передать 15 мл 2 мл Пермь буфера III. Оставьте при-20 ° C, так что это ледяной после использования.
    Примечание: В Перми буфер можно оставить в-20 ° C с самого начала эксперимента.
  2. Добавьте 1,5 мл ледяной Пермь буфера перепутываются клеток населению (15 мл) и 100 мкл каждого компенсации элемента управления (в 1,7 мл трубки) каплям при vortexing, чтобы избежать, что клетки слипаются.
  3. Напрямую передавать клетки-80 ° C. Оставьте как минимум 30 мин.
    Примечание: Это естественно для приостановки эксперимент на данный момент. Клетки в Перми буфера может быть хранимой в долгосрочной перспективе при температуре-80 ° C.

7. антитело пятная

Примечание: Приведена Таблица материалов список зарегистрированных фосфо специфических антител.

  1. Передача клетки от-80 ° C к коробке льда.
  2. Вымойте 3 x с потоком мыть.
    Примечание: Важно добавить поток мыть в избыток, чтобы увидеть ячейки Пелле, например, добавить 3 мл потока мыть популяции клеток перепутываются и 1 мл на каждый элемент управления компенсации.
  3. Центрифуга на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
  4. Ресуспензируйте перепутываются популяции клеток в объеме потока мыть, что позволяет 25 мкл суспензии клеток на пятно фосфо антитела. Ресуспензируйте компенсации управления в 200 мкл потока мыть.
  5. Подготовка антител для пятнать в 96 хорошо V-днище. Окончательный объем будет 50 мкл/хорошо. На хорошо добавьте фосфо специфические антитела, разбавленных в поток мыть в окончательный объем 10 мкл, поверхности маркер, разбавленных в поток мыть в окончательный объем 15 мкл и 25 мкл суспензии клеток.
    Примечание: Разбавления антитела должны быть титруют до эксперимента. Включите изотипа управления.
  6. Оставьте клетки для 30 мин при комнатной температуре, в темноте.
  7. Мыть окрашенные клетки 2 x с потоком мыть (заполнение скважины).
  8. Центрифуга на 500 x g 5 мин отбросить супернатант.
  9. Ресуспензируйте клетки в 150 мкл потока мыть.

8. Подготовка компенсации элементов управления

  1. Подготовьте элементы компенсации конъюгированных антител флуорохромов параллельно с Пятнать антитела. Используйте шарики компенсации согласно инструкциям производителя.

9. поток Cytometry анализ

Примечание: Эксперимент может быть выполнен на проточный цитометр с высокой пропускной способностью сборники (HTS).

  1. Оптимизируйте фотоэлектронный умножитель напряжения трубки (ПЛТ) с неокрашенных управления.
  2. Запуск управления компенсации и рассчитать компенсацию матрицы.
  3. Запуск образцов. Частота событий должно соответствовать спецификации инструмента.

10. стробирования стратегии и анализа данных

  1. Импорт файлов FCS из эксперимента для потока cytometry анализ программного обеспечения как FlowJo или Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
  2. Шлюзовые стратегия
    1. Выберите лимфоцитов путем построения SSC-A по сравнению с FSC-A в участке плотность точка.
    2. Лимфоциты и выберите фуфайки путем построения SSC-A по сравнению с FSC -W.
    3. Отображение единичных клеток и ворота ячейки типа путем построения SSC-A по сравнению с поверхности маркер.
    4. Отображение типа популяции клеток в Pacific Blue сюжет по сравнению SSC-A плотность и выберите различные популяции FCB, основанный на их Pacific Blue пятнать интенсивности (см. рис. 1A).
    5. Участок канала фосфористой антитела против FCB канала, или как heatmap (см. рис. 1A) для отображения событий фосфорилирования.
  3. Рассчитать фосфо сигналы, используя обратный гиперболический синус (arcsinh) МФО (средней интенсивности флуоресценции) фосфо сигнал против изотипа управления (уровень базальной фосфорилирование, см. Рисунок 1 d), или стимулировали против кератоз клеточных популяций (см. Рисунок 1E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Основные этапы протоколом cytometry потока фосфористой приведены на рисунке 1A. В примере представлены клетки CLL окрашивали с реактивом штриховое кодирование, Pacific Blue на четыре разведениях. Трехмерные штриховое кодирование может выполняться путем объедине...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Фосфоресцентный проточной цитометрии – это мощный метод для измерения уровней фосфорилирование белков в одиночных клетках. Поскольку этот метод опирается на окрашивание с антителами, фосфористой проточной цитометрии ограничено наличием антител. Кроме того для того чтобы получить н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа проводилась в лаборатории профессора Kjetil Taskén и была поддержана норвежского общества рака и Стифтельсен Кристиан Gerhard Jebsen. Йоханнес Ландскрон и Марианна Enger признал критических чтении рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 GlutaMAXThermoFisher Scientific61870-010Cell culture medium
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10270169Additive to cell culture medium
Sodium pyruvateThermoFisher Scientific11360-039Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acidsThermoFisher Scientific11140-035Additive to cell culture medium
LymphoprepAlere Technologies AS1114547Density gradient medium
Anti-IgMSouthern Biotech2022-01For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer IBD557870Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer IIIBD558050Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFPThermoFisher ScientificA30005Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl EsterThermoFisher ScientificP10163Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium SaltThermoFisher ScientificP30253Barcoding reagent
Compensation beadsDefined by userCorrect species reactivity
Falcon tubesDefined by user
Eppendorf tubesDefined by user
96 well V-bottom platesDefined by userCompatible with the flow cytometer
CentrifugesDefined by userFor Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bathDefined by userTemperature regulated
Flow cytometerDefined by userWith High Throughput Sampler (HTS)
NameCompanyCatalog NumberComments
Antigen
AKT (pS473)Cell Signaling Technologies4075Clone: D9E
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)Santa Cruz Biotechnologysc-8398Clone: F-1
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)Beckton Dickinson Pharmingen558443Clone: J117-1278
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)Beckton Dickinson Pharmingen564846Clone: N35-86
Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551)Beckton Dickinson Pharmingen558129Clone: 24a/BTK (Y551) 
Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)Beckton Dickinson Pharmingen558134Clone: 24a/BTK (Y551) 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)Beckton Dickinson Pharmingen558489Clone: K25-407.69
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)Cell Signaling Technologies9716Clone: D2C8
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
IκBαCell Signaling Technologies5743Clone: L35A5
Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171)Beckton Dickinson Pharmingen558518Clone: I58-1169
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)Beckton Dickinson Pharmingen558577Clone: 4/LCK-Y505 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)Beckton Dickinson Pharmingen560043Clone: J114-64
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529)Beckton Dickinson Pharmingen558422Clone: K10-895.12.50
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κB p65 (pS536)Cell Signaling Technologies4887Clone: 93H1
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)Cell Signaling Technologies4552Clone: 28B10
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)Cell Signaling Technologies4375Clone: E10
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)Cell Signaling TechnologiesNNClone: 16G8
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)Cell Signaling TechnologiesNNClone: Polyclonal
Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759)Beckton Dickinson Pharmingen558498Clone: K86-689.37
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)Beckton Dickinson Pharmingen558590Clone: J112-906
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)Cell Signaling Technologies4851Clone: D57.2.2E
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)Cell Signaling Technologies9257Clone: G9
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)Beckton Dickinson Pharmingen558438Clone: J141-668.36.58 
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)Beckton Dickinson Pharmingen612597Clone: 4a 
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)Beckton Dickinson Pharmingen557815Clone: 4/P-STAT3
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)Zymed/ThermoFisher Scientific71-7900Clone: Polyclonal
Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)Beckton Dickinson Pharmingen612599Clone: 47/Stat5(pY694)
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)Beckton Dickinson Pharmingen612601Clone: 18/P-Stat6
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)Cell Signaling Technologies12081Clone: C87C1
Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)Beckton Dickinson Pharmingen557817Clone: 17A/P-ZAP70
Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770

Ссылки

  1. Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
  2. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  3. Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
  4. Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
  5. Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478(2012).
  6. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  7. Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
  8. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  9. Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
  10. Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
  11. Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61(2017).
  12. Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
  13. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  14. Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
  15. Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
  16. Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
  17. Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).
  18. Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).
  19. Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140FCB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены