Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal

Özet

Burada, hücresel düzeyde protein fosforilasyon olayların orta-yüksek performans analizi için bir protokol sunulmuştur. Fosfo akış sitometresi sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.

Özet

Anormal hücre sinyallemesi kanser gelişme ve ilerleme içinde merkezi bir rol oynar. En yeni hedefli tedaviler gerçekten de protein ve protein işlevleri yönlendirilir ve hücre sinyal aberasyonları bu nedenle kişiselleştirilmiş tedavi seçenekleri belirtmek için biyolojik hizmet verebilir. DNA ve RNA analizleri aksine, protein aktivite değişiklikleri ilaç duyarlılığı ve direnç temel mekanizmaları daha verimli bir şekilde değerlendirebilir. Fosfo akış sitometresi protein fosforilasyon olaylar hücresel düzeyde, bu yöntem diğer antikor tabanlı yaklaşımlardan ayıran önemli bir özelliği ölçer güçlü bir tekniktir. Yöntemi aynı anda birden çok sinyal proteinleri analiz için sağlar. Floresan cep barkod ile birlikte, daha büyük orta-yüksek performans veri setleri kısa sürede standart sitometresi donanım tarafından elde edilebilir. Fosfo akış sitometresi uygulamaları temel biyoloji çalışmalarda ve klinik araştırmada, sinyal analizi, biyomarker keşif ve özellikler bir değerlendirme de dahil olmak üzere var. Burada, detaylı bir deneysel protokol Fosfo akışı analizi arıtılmış periferik kan mononükleer hücre, kronik lenfositik lösemi hücreleri örnek olarak kullanarak sağlar.

Giriş

Fosfo akış sitometresi protein fosforilasyon düzeyleri tek hücreli çözünürlükte analiz etmek için kullanılır. Genel yöntem belirtilen koşullar altında hücresel sinyal desenleri eşlemek için hedeftir. Akış Sitometresi multiparameter kapasitesi sömürerek, birkaç sinyal yollar aynı anda periferik kan gibi türdeş olmayan hücre nüfusunun farklı alt kümeleri olarak analiz edilebilir. Bu özellikler diğer antikor tabanlı teknolojileri immünhistokimya, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), protein dizi ve ters faz protein dizi (RPPA)¹gibi avantajlar sunuyor. Fosfo akış sitometresi floresan cep Barkod (FCB), böylece onlar birlikte karışık olabilir, lekeli ve tek örnek²olarak analiz tek hücre örnekleri floresan boyalar benzersiz imzaları ile etiketlenir anlamına gelir ile kombine edilebilir. Bu antikor tüketimini azaltır veri sağlamlık, kontrol ve tedavi örnekleri birleşimiyle artar ve edinme hızını artırır. Kombine FCB nüfus daha küçük örnekleri bölünmüş ve malzeme başlayan miktarına bağlı olarak 35 farklı Fosfo-özel antikorlar ile lekeli. Büyük profil oluşturma deneyler böylece, standart sitometresi donanım ile çalıştırabilirsiniz. Fosfo akış sitometresi yollar hasta numuneleri kronik lenfositik lösemi (CLL)^3,4,5, akut miyeloid lösemi (AML) dahil olmak üzere birçok hematolojik kanserlerin sinyal profil uygulandı ⁶ ve non-Hodgkin lenfomalarin bazilarinin⁷. Fosfo akış sitometresi böylece sinyal aberasyonları karakterize, tanımlamak ve biyolojik doğrulamak ve Özellikler değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır.

Burada, analiz Fosfo akış sitometresi tarafından CLL hasta örnekleri için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı (Şekil 1A) sağlanır. Bazal sinyal karakterizasyonu, anti-IgM/B hücre reseptörü stimülasyon ve uyuşturucu pertürbasyon örnekleri gösterilir. Bir FCB matris ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Protokol kolayca diğer süspansiyon hücre tipleri için adapte edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Yazılı onam tüm bağış takip kan örnekleri alındı. Tıp ve sağlık araştırma etik ve Güney-Doğu Norveç için çalışma bölge Komitesi tarafından kabul edildi ve insan kanı üzerinde araştırma Helsinki Bildirgesi⁸uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Not: 1-3 adımları bir doku kültürü başlıklı steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.

1. yalıtım periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) CLL hasta kan örnekleri

Dikkat: İnsan kanı seviye 2 için düzenlemelere göre ele alınmalıdır.

1. Kan fosfat tamponlu tuz ile 1:1 oranında seyreltin (PBS: 136.9 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10,1 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) ve 50 mL tüpler (30 mL/tüp) aktarmak.
2. Dikkatli bir yoğunluk gradient Orta (Örneğin, Lymphoprep) 10 mL tüp 10 mL pipet kullanarak alt katman.
3. 4 ° C'de 20 dk için 800 x g, santrifüj PBMCs şimdi yoğunluğu üzerinde gradyan orta katmanı görülebilir.
4. Pasteur pipet hücreleri iki yeni 50 mL tüpler içine aktarmak için kullanın. PBS (tüpler doldurmak) iki kez yıkayın.
5. 15 dk. atma süpernatant 350 x g, santrifüj kapasitesi ve PBS 3 mL resuspend.
6. Tercih edilen bir yöntem kullanarak hücreleri saymak.
7. 350 x g 5 dk. atmak için de hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi. Not: 1.8-3.2 isteğe bağlı adımlardır. Doğrudan 3.3 tutamaçlarından mümkündür.
8. % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş fetal Sığır serum (FBS) hücrelerde resuspend ve aşağı cryo borular kullanarak uygun aliquots dondurma.
   Not: DMSO hücrelere toksiktir. Hızlı hücreleri FBS/DMSO ile karışınca iş. Hücreler sıvı azot içinde saklı uzun süreli olabilir.

2. hücreleri çözme

1. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu hücrelerde çözülme.
   Not: DMSO hücrelere toksiktir. Hızlı DMSO maruz sınırlamak için çalışırlar.
2. Bir kez 10 mL soğuk Roswell Park Memorial Enstitüsü Orta (RPMI 1640 tamamlayıcı GlutaMAX ile bkz: Malzemeler tablo) içeren hücreleri yıkayın.
3. 5 dakika süreyle 300 x g, santrifüj süpernatant atmak.
4. Sodyum pyruvate, MEM esansiyel olmayan amino asitler ve penisilin/streptomisin (1 x seyreltme talimatlara göre ekledi) ve % 10 RPMI 1640 orta hücrelerde resuspend FBS. Hücreleri bir küçük hücreli kültür şişesi aktarmak ve bir kuluçka %5 CO₂, 37 ° C hücrelere ayarlamak izin vermek 1 saat bırakın.

3. hücre hazırlanması

1. Tercih edilen bir yöntem kullanarak canlı hücreleri saymak.
2. Hücreleri bir 50 mL tüp aktarmak ve 5 dakika süreyle 300 x g, santrifüj süpernatant atın.
3. %1 ile desteklenmiş RPMI 1640 Orta (adım 2.2) hücrelerde resuspend FBS en fazla 50 x 10⁶ hücre/ml.
4. Hücre süspansiyon gerekli miktarda 96 iyi V-alt plaka wells aktarın.
   Not: Kuyu sayısı koşulları test edilecek sayısına karşılık gelir. Bir stimülasyon zamanlı kurs için örnekleri tek bir kuyudan çizilir. Zaman noktası + 50 µL ölü biriminin başına 50 µL örnek hesaplayın. Örnekleri için tazminat denetimleri (bir günahı örnek + barkod boya başına bir örnek) kaydedin.
5. Transfer 96 iyi plaka önceden ısıtılmış 37 ° C su banyosu. Hücreler için 10 dk bekletin.

4. stimülasyon ve hücreleri fiksasyonu

Not: 4-8 (Yani, değil steril) laboratuvar bankta adımları.

Dikkat: Arabellek düzeltmek ana madde ben olduğunu zehirli paraformaldehyde (solunum yolu ve deri temas). Özenle hallederim.

1. 96 iyi V-alt plaka düzeltmek arabelleği 60 µL ile hazırlamak ben iyi örnek başına ücret. 37 ° C su banyosu içinde bırakın.
   Not: Hücreler: Düzeltme arabellek 1:1 olmalıdır. 37 ° C'de buharlaşma için izin vermek için düzeltme arabellek başlangıçta bolluk içinde olur.
2. İsteğe bağlı olarak, uyuşturucu stimülasyon önce hücrelerle tedavi.
3. 50 µL denetimi örneğini düzeltme plakasına aktarın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
4. İsteğe bağlı olarak, stimülasyon zamanlı kurs 10 µg/mL anti-IgM hücrelere ekleyerek başlayın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
5. 50 µL örnek her zaman-nokta düzeltme plakasına aktarın. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
   Not: Anti-indüklenen genellikle erken başlatılır sinyal IgM (dakika).
6. Son örnek eklendikten sonra 10 dk 37 ° C'de düzeltme plaka bırakın.

5. floresan cep Barkod (FCB)

Not: Barkodlama reaktifler bir listesi için bkz. Tablo 1 .

1. Sabit hücreleri 3 yıkama x PBS (kuyuları doldurmak) ile.
2. 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.
3. 96 iyi V-alt plaka barkodlama reaktifleri ile hazırlayın. Damlalıklı 5 µL her barkod reaktif boyama matris, Örneğin, Şekil1B takip tüm örneklerini leke için gerekli kombinasyon kuyuda başına. Her örnek farklı tedarikçilerden konsantrasyonları benzersiz bir kombinasyonu gerekir.
4. PBS ve aktarma barkodlama plaka 190 µL hücrelerde resuspend. İyice karıştırın.
   Not: Her barkod reaktif için kullanılan en yüksek son konsantrasyon ile bir tazminat örnek leke ve bir günahı örnek kaydedin.
5. Hücre içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dakika bırakın.
6. Lekeli hücreleri 2 yıkama ile akış yıkama (PBS, %1 FBS, %0,09 sodyum azid) x (kuyuları dolgu).
7. 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.
8. Akış yıkama 190 µL hücrelere ekleme ve bir 15 mL tüp barkodlu örneklerinde birleştirir. Her tazminat ayrı 1.7 mL tüp aktaracağım.
9. 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.

6. hücre Permeabilization hücre içi antijen boyama için

Uyarı: Toksik (solunum yolu ve deri temas) ve yanıcı olan metanol perma arabellek III ana madde olduğunu. Özenle hallederim.

1. Perm arabellek III 2 mL 15 mL tüp aktarın. Yani üye olmakla kullanım buz gibi-20 ° C'de bırakın.
   Not: Perm arabellek-20 ° C'de deneme başından itibaren bırakılabilir.
2. Barkodlu hücre nüfus (15 mL tüp içinde) buz gibi perma arabelleğe 1,5 mL ve 100 µL her tazminat denetimi (1.7 mL tüpler) drop-wise vortexing hücreleri birlikte yığın önlemek için ekleyin.
3. Hücreleri doğrudan-80 ° C'ye aktarma En az 30 dk için bırakın.
   Not: Bu noktada deneme duraklatmak için doğaldır. Perm arabellek hücrelerde-80 ° C'de saklı uzun vadeli olabilir

7. antikor boyama

Not: Malzemeler tablo bildirilen Fosfo-özel antikorlar bir listesi için bkz:.

1. Hücreleri-80 ° C'den bir buz kutusuna aktarın.
2. 3 x akışı yıkama ile yıkayın.
   Not: Hücre Pelet görmek için fazla akışı yıkama eklemek önemlidir, Örneğin, her tazminat denetim akışı yıkama barkodlu hücre nüfus ve 1 mL 3 mL ekleyin.
3. 4 ° C'de 5 min için 500 x g, santrifüj Süpernatant atmak.
4. Barkodlu hücre nüfus Fosfo-antikor leke hücre süspansiyon, 25 µL sağlayan akış yıkama hacmi resuspend. Tazminat denetim akışı yıkama 200 µL içinde resuspend.
5. Antikorlar 96 iyi V-alt plaka içinde boyama için hazırlayın. Son hacim 50 µL/iyi olacak. İyi 10 µL, yüzey marker son hacmi 15 µL ve hücre süspansiyon, 25 µL yıkamaya akışı içinde seyreltilmiş son hacmi yıkamaya akışı içinde seyreltilmiş Fosfo özgü antikor ekleyin.
   Not: Antikor dilutions deneme önce titre. İzotip kontrol içerir.
6. Karanlık oda sıcaklığında 30 dk için hücreleri bırakın.
7. Lekeli hücreleri 2 yıkama x akışı yıkama (kuyuları doldurmak) ile.
8. 5 dakika süreyle 500 x g, santrifüj süpernatant atmak.
9. Akış yıkama 150 µL hücrelerde resuspend.

8. tazminat denetimleri hazırlanması

1. Tazminat denetimleri antikor boyama paralel olarak antikor Birleşik fluorochromes için hazır olun. Tazminat boncuk göre için satıcının yönergelerini kullanın.

9. Akış Sitometresi Analizi

Not: Deneme bir akış sitometresi bir yüksek üretilen iş örnekleyici (HTS) ile çalıştırılabilir.

1. Photomultiplier tüp (PMT) gerilim günahı kontrol ile en iyi duruma getirme.
2. Tazminat denetimleri çalıştırmak ve tazminat matris hesaplayın.
3. Çalışma örnekleri. Olay oranı uygun olarak araç özellikleri olmalıdır.

10. geçişi strateji ve veri analizi

1. Akış Sitometresi Analizi Yazılım deneme alma FCS dosyaları FlowJo veya Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) gibi.
2. Perdeleme strateji
   1. SSC-A karşı komplo tarafından lenfositler seçin FSC-A bir yoğunluk nokta arsa.
   2. Lenfosit görüntüleyip SSC-A karşı FSC -W. komplo tarafından gömlek seçin
   3. Tek hücre ve hücre yazın SSC-A karşı yüzey işaretçiyi komplo tarafından kapı görüntüler.
   4. Hücre türü nüfus Pasifik mavi karşı SSC-A yoğunluğu plan yaptığını görüntülemek ve onların Pasifik yoğunluğu boyama mavi üzerinde dayalı farklı FCB nüfus seçin ( Şekil 1A' ya bakınız).
   5. Fosfo antikor kanal FCB kanal karşı veya bir heatmap olarak arsa (şekil 1Afosforilasyon olaylarını görüntülemek için'ya bakınız).
3. Fosfo-sinyalleri Fosfo-sinyal karşı izotip kontrol MFI (medyan floresan yoğunluğu) ters hiperbolik sinüsü (arcsinh) kullanarak hesaplamak (bazal fosforilasyon, bkz: düzeyleri Şekil 1 d), ya da uyarılmış karşı unstimulated hücre popülasyonlarının (bkz. Şekil 1E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Fosfo akış sitometresi Protokolü ana adımları Şekil 1A' gösterilmiştir. Sunulan örnekte CLL hücreleri ile dört dilutions, Pasifik mavi barkodlama reaktif lekeli. Üç boyutlu barkod Şekil 1Badımında gösterildiği gibi üç barkodlama boya, birleştirerek gerçekleştirilebilir. Bireysel örnekleri sonra sonraki her barkod reaktif karşı üzerinde SSC-A (Şekil 1 c) çoğunlu?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Fosfo akış sitometresi tek hücrelerdeki protein fosforilasyon düzeyleri ölçmek için güçlü bir tekniktir. Antikorlar ile boyama yöntemi kullanır beri Fosfo akış sitometresi göre antikor miktarı sınırlıdır. Ayrıca, güvenilir sonuçlar elde etmek için tüm antikor olmalı titre ve kullanmadan önce doğrulanmadı. Titrasyon Fosfo özgü antikorların için detaylı bir protokol oldu başka bir bölümünde¹². Panel Tasarım sırasında sinyal-gürültü oranı göz önüne alı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Cell culture medium
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10270169	Additive to cell culture medium
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039	Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additive to cell culture medium
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Density gradient medium
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt	ThermoFisher Scientific	P30253	Barcoding reagent
Compensation beads	Defined by user		Correct species reactivity
Falcon tubes	Defined by user
Eppendorf tubes	Defined by user
96 well V-bottom plates	Defined by user		Compatible with the flow cytometer
Centrifuges	Defined by user		For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bath	Defined by user		Temperature regulated
Flow cytometer	Defined by user		With High Throughput Sampler (HTS)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)	Beckton Dickinson Pharmingen	564846	Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
IκBα	Cell Signaling Technologies	5743	Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κB p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)	Cell Signaling Technologies	4375	Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p53 (pS15)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS20)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759)	Beckton Dickinson Pharmingen	558498	Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
Rb (pS807/pS811)	Beckton Dickinson Pharmingen	558590	Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Cell Signaling Technologies	4851	Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)	Cell Signaling Technologies	9257	Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)	Beckton Dickinson Pharmingen	558438	Clone: J141-668.36.58  Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)	Beckton Dickinson Pharmingen	612597	Clone: 4a  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)	Beckton Dickinson Pharmingen	557815	Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)	Zymed/ThermoFisher Scientific	71-7900	Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770