単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

要約

ここでは、細胞レベルでのタンパク質のリン酸化イベントの媒体-高スループット分析のためのプロトコルが表示されます。リン フローサイトメトリーは、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。

要約

異常な細胞シグナル伝達は、癌の発生と進展に中心的な役割を果たしています。最も新しい目標とされた療法は確かにタンパク質とタンパク質機能に向け、細胞シグナル伝達異常したがって個別の治療オプションを示すバイオ マーカーとして役立つかもしれない。DNA および RNA の解析ではなくタンパク質活性の変化はより効率的に薬剤感受性および抵抗性のメカニズムを評価できます。リン フローサイトメトリーは、細胞レベル、他の抗体に基づくアプローチからこのメソッドを区別する重要な特徴でタンパク質リン酸化イベントを測定する強力な手法です。メソッドは、複数のシグナル伝達タンパク質の同時解析できます。蛍光セル バーコードと組み合わせると、短い時間で標準の cytometer ハードウェアによって大きな - ハイスループット データ セットを取得できます。リン フローサイトメトリーは、基礎生物学の研究と臨床研究、信号解析、バイオ マーカーの探索と薬理学の評価などの両方のアプリケーションを持ってください。ここでは、例として慢性リンパ性白血病細胞を用いて精製した末梢血単核細胞のリン流れ解析のため詳細な実験的プロトコルが提供されます。

概要

リン フローサイトメトリーを使用して、単一セルの解像度でタンパク質リン酸化レベルを分析します。メソッドの全体的な目標は、指定された条件の下で携帯電話の信号パターンをマップすることです。フローサイトメトリーの多項目の能力を悪用し, 末梢血など異種細胞集団のさまざまなサブセットでいくつかのシグナル伝達経路を同時に分析できます。これらの特徴は、免疫組織化学、酵素免疫測定法 (ELISA)、蛋白質のアレイ、逆相蛋白質配列 (セルシグナル)¹など他の抗体に基づく技術上の利点を提供しています。リン フローサイトメトリーの併用蛍光セル バーコード (FCB) を混ぜ合わせた、ステンド グラスおよび単一のサンプル²として分析できるように、個々 のセルのサンプルが蛍光染料の独特な特徴と分類されることを意味することができます。これは抗体の使用量を削減、コントロールと扱われたサンプルの組み合わせによるデータ保全性を向上、習得のスピードを向上します。合計 FCB 人口の小さいサンプルに分割および開始材料の量に応じて、最大 35 の異なるリン酸化型特異抗体で染色できます。大型プロファイル実験は、標準の cytometer ハードウェアで、それにより実行できます。リン フローサイトメトリーは、慢性リンパ性白血病 (CLL)^3,4、5、急性骨髄性白血病 (AML) を含むいくつかの血液がんの患者サンプルのシグナルのプロファイルに適用されています。⁶非ホジキン リンパ腫⁷。リン フローサイトメトリー、シグナル伝達異常を特徴付ける、識別およびバイオ マーカーの検証し、薬効学を評価する強力なアプローチです。

ここでは、CLL 患者サンプル リン フローサイトメトリーによる解析のための最適化されたプロトコルは、(図 1 a) を提供しています。基底の信号特性評価、抗 IgM/B 細胞受容体刺激薬摂動の例のとおりです。FCB マトリックスの詳細な説明が提供されます。プロトコルは他の懸濁液の細胞型に適応できます。

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プロトコル

血液サンプルは、すべてのドナーから次の書面によるインフォームド コンセントを受信しました。研究は、医療と健康研究倫理の南東ノルウェーの地域委員会によって承認された、人間の血液の研究はヘルシンキ宣言⁸に従って行われました。

注:手順 1-3 は、ティッシュ文化フードの無菌条件下で行わなければなりません。

1. 末梢血単核球 (PBMCs) CLL 患者の血液サンプルからの分離

注意: ヒトの血液バイオ セーフティ レベル 2 の規則に従って処理されます。

1. 1:1 リン酸緩衝生理食塩水で血液を希釈 (PBS: 136.9 mM NaCl、KCl、2.7 mM 10.1 mM ナ₂HPO₄ x 2 H₂O、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.4) と 50 mL チューブ (30 mL/チューブ) に移転。
2. 10 mL のピペットを使用してチューブの底に層の密度勾配媒体 (例えばLymphoprep) 10 mL の慎重に。
3. 800 x g で 4 ° C で 20 分間遠心PBMCs は密度勾配中のレイヤーの上に表示されます。
4. パスツール ピペットを使用して、2 つの新しい 50 mL チューブにセルを転送します。PBS (チューブいっぱい) で 2 回洗浄します。
5. 350 x g で 15 分間破棄上澄みで遠心し、3 mL の PBS に再懸濁します。
6. 最寄りのメソッドを使用してセルをカウントします。
7. 350 x g で 5 分間破棄で細胞培養上清を遠心分離機します。注:3.2 1.8 の手順は省略可能です。ステップ 3.3 に直接進むため不可能です。
8. 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を添加したウシ胎児血清 (FBS) で細胞を再懸濁します、クライオ チューブを使用して適切な因数でフリーズします。
   注:DMSO は、細胞に有毒です。セルは FBS/DMSO と混合されて一度高速動作します。細胞は液体窒素で長期保存をすることができます。

2. 細胞の融解

1. すぐに雪解けの 37 ° C の水浴のセル。
   注:DMSO は、細胞に有毒です。DMSO への露出を制限するために高速動作します。
2. 冷たいロズウェル パーク記念研究所媒体 (補足 GlutaMAX で RPMI 1640 参照テーブルの材料) の 10 mL で一度セルを洗います。
3. 300 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
4. ピルビン酸ナトリウム、MEM 非必須アミノ酸とペニシリン/ストレプトマイシン (指示に従って 1 倍希釈に追加)、10% 添加 RPMI 1640 培地で細胞を再懸濁します FBS。小細胞培養用フラスコにセルを転送し、5% CO₂、調整する細胞を許可する 1 時間の 37 ° C の定温器に残します。

3. 細胞の調製

1. 最寄りのメソッドを使用して実行可能なセルを数えます。
2. 50 mL のチューブにセルを転送し、300 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
3. 1% 添加 RPMI 1640 培地 (手順 2.2) で細胞を再懸濁します以上 50 x 10⁶セル/mL に FBS。
4. 96 ウェル V 底プレートの井戸に細胞懸濁液の必要量を転送します。
   注:井戸の数は、テストする条件の数に対応します。刺激の時間コースのサンプルは、単一の井戸から描かれています。時間ポイント + デッド ボリュームの 50 μ L あたり 50 μ L のサンプルを計算します。補正コントロール (1 つの無染色サンプル + バーコード色素あたり 1 つのサンプル) のサンプルを保存します。
5. 96 ウェル プレートを予熱の 37 ° C の水浴に転送します。10 分間細胞を休ませます。

4. 刺激と細胞の固定

注:研究室のベンチ (すなわち、ない滅菌) に 4-8 の手順を実行します。

注意: バッファーの修正の主な成分私は有毒であるパラホルムアルデヒド (吸入および皮膚の接触)。取り扱いに注意。

1. バッファーの修正の 60 μ L で 96 ウェル V 底プレートを準備サンプルあたりよく当り。37 ° C の水浴のままにします。
   注:細胞: 修正プログラム バッファーは 1:1 にする必要があります。37 ° C で蒸発のために、修正プログラム バッファーは当初豊富です。
2. 必要に応じて、刺激前に薬剤とセルを扱います。
3. 固定プレートに 50 μ L コントロール サンプルを転送します。上下にピペッティングで混ぜます。
4. 必要に応じて、10 μ g/mL 抗 IgM をセルに追加することによって刺激の時間コースを開始します。上下にピペッティングで混ぜます。
5. 各時点で、50 μ L のサンプルを固定プレートに転送します。上下にピペッティングで混ぜます。
   注:抗 IgM 誘導は通常早期開始シグナル伝達 (分)。
6. 最後のサンプルが追加された後は、10 分の 37 ° C で固定プレートを残します。

5. 蛍光セル バーコード (FCB)

注:バーコード化試薬の一覧については表 1を参照してください。

1. 3 固定セルを洗浄して x は PBS (井戸を埋める)。
2. 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
3. バーコード化試薬を用いる 96 ウェル V 底プレートを準備します。ピペット 5 μ L の組み合わせ染色染色マトリックス、例えば図 1 bで、次のすべてのサンプルに必要な数の井戸あたり各バーコードの試薬。各サンプルでお越しの際にも異なるバーコード濃度のユニークな組み合わせ。
4. 190 μ L の PBS とバーコード プレートに伝達の細胞を再懸濁します。ミックス徹底的。
   注:各バーコードの試薬に使用される最終的な濃度が最も高い 1 つの補正サンプルを染色し、1 無染色標本を保存します。
5. 暗闇の中、室温で 20 分間細胞を残します。
6. ステンド グラスのセル 2 を洗う流れ洗う (PBS、1 %fbs、0.09% アジ化ナトリウム) と x (井戸を埋める)。
7. 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
8. セルに流洗浄の 190 μ L を追加し、1 つ 15 mL チューブにバーコードのサンプルを組み合わせた。別の 1.7 mL チューブに各補償制御を転送します。
9. 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。

6. 透過をセル細胞内抗原染色

注意: パーマ バッファー III の主な成分は毒性 (吸入および皮膚の接触)、可燃物であるメタノールです。取り扱いに注意。

1. パーマ バッファー III の 2 mL を 15 mL チューブに転送します。それは使用時に冷たいので、-20 ° C で残します。
   注:パーマ バッファーは、実験開始から-20 ° C で残すことができます。
2. 冷たいパーマ バッファー (15 mL チューブ) でバーコード セル人口の 1.5 mL と 100 μ L 各コントロールに追加補償 (1.7 mL の管) の drop-wise 細胞の凝集を避けるためにボルテックス中。
3. -80 ° C に直接セルを転送します。30 分の最小値のままにします。
   注:この時点でテストを一時停止するは当然です。パーマ バッファー内セルは-80 ° C で長期保存をすることができます。

7. 抗体の汚損

注:報告されたリン酸化特異的抗体のリストについては材料の表を参照してください。

1. -80 ° C から氷のボックスにセルを転送します。
2. 流れ洗浄で 3 x を洗ってください。
   注:細胞ペレットにして過剰に洗浄フローを追加することが重要だなど各補償制御フロー洗ってバーコード細胞集団に、1 mL の 3 mL を加えます。
3. 500 x g で 4 ° C で 5 分間遠心上清を捨てます。
4. リン抗体染色あたり 25 μ L の細胞懸濁液を可能にするフロー洗浄のボリュームでバーコードの細胞を再懸濁します。流れ洗浄 200 μ L で補正コントロールを再懸濁します。
5. 96 ウェル V 底プレートの汚損のための抗体を準備します。最終巻を 50 μ L/ウェルとなります。好評につき、10 μ、15 μ L と細胞懸濁液を 25 μ l 添加の最終巻に流れ洗浄に希釈表面マーカーの最終巻に流れ洗浄で希釈したリン酸化型特異抗体を追加します。
   注:抗体希釈液は、実験前に滴定する必要があります。アイソタイプ コントロールが含まれます。
6. 暗闇の中、室温で 30 分間細胞を残します。
7. 洗浄染色セル 2 x フロー洗浄 (井戸を埋める)。
8. 500 x g で 5 分間遠心上清を破棄します。
9. 流れ洗浄の 150 μ L で細胞を再懸濁します。

8. 補正コントロールの準備

1. 抗体の汚損と並行して標識抗体螢の補正コントロールを準備します。ベンダーの指示に従って補償ビーズを使用します。

9. フローサイトメトリー解析

注:実験は、流れの cytometer で高スループットのサンプラー (HTS) で実行できます。

1. 無染色のコントロールと光電子増倍管 (PMT) 電圧を最適化します。
2. 補正コントロールを実行し、補償行列を計算します。
3. サンプルを実行します。イベント発生率は、装置の仕様に従ってする必要があります。

10. ゲート戦略およびデータ分析

1. FlowJo または Cytobank (https://cellmass.cytobank.org) のような流動フローサイトメトリー解析ソフトを実験から FCS ファイルをインポートします。
2. ゲートの戦略
   1. 対SSC のプロットによってリンパ球を選択密度ドット プロットで FSC A。
   2. リンパ球を表示し、印刷対SSC の FSC - w. によって、シングレットを選択
   3. セルを SSC の対表面マーカー プロットすることによって入力単一細胞およびゲートを表示します。
   4. パシフィック ブルー対SSC の密度プロットでセル型人口を表示し、パシフィック ・ ブルー染色に基づいて別の FCB 集団を選択 (図 1A参照)。
   5. リン抗体チャネル FCB チャネルまたはヒートマップとしてプロット リン酸化イベントを表示する (参照してください図 1 a)。
3. アイソタイプ コントロール対リン信号の MFI (平均蛍光強度) の双曲線逆正弦 (arcsinh) を用いたリン信号を計算 (基底のリン酸化レベルは、図 1を参照)、または刺激対の非刺激細胞 (図 1E参照)。

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結果

図 1 aにリン流れの cytometry のプロトコルの主な手順を示します。提示の例では、CLL 細胞は 4 希釈でパシフィック ・ ブルー バーコード化試薬で染色しました。三次元バーコードは、図 1 bに示すように 3 つのバーコードの染料を組み合わせることで実行できます。個々 のサンプルは、各バーコード試薬対SSC A (

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ディスカッション

リン フローサイトメトリーは、単一細胞におけるタンパク質リン酸化レベルを測定する強力な手法です。メソッドは、抗体で染色に依存しているので、リン フローサイトメトリーは抗体の可用性によって制限されます。さらに、信頼性の高い結果を得るために全ての抗体滴定、使用する前に検証します。リン酸化型特異抗体の滴定のための詳しいプロトコルがされている¹²...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Cell culture medium
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10270169	Additive to cell culture medium
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039	Additive to cell culture medium
MEM non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additive to cell culture medium
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Density gradient medium
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	For stimulation of the B cell receptor
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Fixation buffer
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Permeabilization buffer
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Barcoding reagent
Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Barcoding reagent
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt	ThermoFisher Scientific	P30253	Barcoding reagent
Compensation beads	Defined by user		Correct species reactivity
Falcon tubes	Defined by user
Eppendorf tubes	Defined by user
96 well V-bottom plates	Defined by user		Compatible with the flow cytometer
Centrifuges	Defined by user		For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates
Water bath	Defined by user		Temperature regulated
Flow cytometer	Defined by user		With High Throughput Sampler (HTS)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
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Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone: 24a/BTK (Y551)  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)	Cell Signaling Technologies	9716	Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone: 4/LCK-Y505  Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
NF-κB p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
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p53 (pS20)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)	Cell Signaling Technologies	NN	Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96
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STAT5 (pY694)	Beckton Dickinson Pharmingen	612599	Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)	Beckton Dickinson Pharmingen	612601	Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SYK (pY525/Y526)	Cell Signaling Technologies	12081	Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)	Beckton Dickinson Pharmingen	557817	Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770