酸化浸渍法评价全肾肾素数

摘要

对整个肾肾的估计在临床和实验上都很重要, 因为肾周数与肾脏和心血管疾病的风险增加之间存在反比关系。在此, 说明了酸浸渍法的应用, 该方法为整个肾肾数目提供了快速可靠的估计。

摘要

肾禀赋是指一个人出生时的肾总数, 因为人类的肾生成在怀孕36周后完成, 出生后没有形成新的肾。肾数是指出生后任何时间测量的肾总数。遗传和环境因素都影响肾的禀赋和数量。了解特定的基因或因素如何影响肾生成和肾功能丧失或死亡的过程很重要, 因为肾天赋或数量较低的个体被认为患肾脏或心血管疾病的风险较高。了解一个人一生中的环境接触如何影响肾数, 对于确定未来的疾病风险也至关重要。因此, 快速可靠地评估整个肾肾数目的能力是一个基本的实验要求, 以更好地了解有助于或促进肾生成或肾肾丢失的机制。在这里, 我们描述了酸浸渍方法的整个肾肾数的估计基础上的程序描述的达马迪安, 沙韦里和布里克, 稍作修改。酸浸渍方法提供了快速和可靠的估计肾数 (评估计数肾小球), 是5% 的那些确定使用更先进的, 虽然昂贵的方法, 如磁共振成像。此外, 酸浸渍法是一种很好的高通量方法, 用于评估大量样品或实验条件下的肾数。

引言

肾既是肾脏的基本结构单位, 也是肾¹的功能单位。在结构上, 肾由位于鲍曼胶囊内的肾小球 (毛细血管和足细胞) 和肾小管组成, 由近端小管、亨勒的环状和终止到收集管道中的远端小管组成。在功能上, 肾的作用是过滤和再吸收水和电解质以及废物的分泌。一般来说, 肾生成是在人类怀孕36周时完成的, 在出生后不久就在老鼠和老鼠2等几个物种中完成.肾禀赋是指一个人出生时的肾总数, 而肾数是出生后任何时候测量的肾的总数 3.肾素数和肾小球数这一术语经常互换使用。由于每个肾只有一个肾小球, 肾小球数的评估是估计肾数目的重要替代因素。

对肾育和肾数的评估具有临床意义, 因为研究表明, 肾原禀赋与心血管疾病发病率增加的肾数减少^之间存在联系 ^{, 6,7,8,9,10, 11, 12,13,14,15}. 根据尸体解剖时的肾脏调查结果, brenner 观察到, 高血压个体的肾总数低于正常人¹⁶。因此, 布伦纳假设, 肾数与以后患高血压的风险之间存在反比关系。布伦纳还推测, 肾数的减少是由剩下的肾补偿的。为了保持肾脏的正常过滤速率, 残留的肾通过增加肾小球表面积 (肾小球肥大) 来补偿, 从而减轻肾功能丧失的 ^{任何不利影响4,16}。

虽然在短期的保护, 肾小球肥大, 在长期, 导致钠和液体的保留增加, 细胞外液体体积增加, 并增加动脉血压, 导致恶性循环的进一步增加肾小球毛细血管压力、肾小球超滤、肾小球疤痕 (硬化症) 和损伤^4,16。

获取肾数的估计或计数提供了几个实验优势: 1) 它提供了有关肾生成过程的信息, 然后可以与胚胎或母婴环境中的特定基因或因素联系在一起; 2)有一个与心血管疾病的联系, 因此, 有可能是肾数的估计可以用来预测未来的心血管风险^{2,17, 18,19,20,21,22}. 除了母婴环境外, 还有几种疾病直接影响肾数目和肾功能, 包括动脉粥样硬化、糖尿病、高血压, 甚至正常衰老^{2, 9, 10、11、12、22、23}。因此, 对整个肾肾肾数的评估对于了解影响肾生成 (即肾后代禀赋) 的遗传和环境因素以及一个人一生中的肾数及其产生的影响都很重要对肾功能和心血管健康的影响。

目前, 有几种方法可用于确定和量化肾数, 每种方法都有其各自的优点和局限性 24^{、25、26、27、28 ,29,30}。确定整个肾肾肾数的复杂方法包括立体方法, 如分解分门器方法和磁共振成像^25,26。通常被认为是确定整个肾肾数的黄金标准, 分解器法既昂贵又耗时。最近在磁共振成像和处理方面的进展和改进为单独计算每一个肾提供了工具。然而, 磁共振成像不仅耗时, 而且极其昂贵。此外, 部门分动仪方法和磁共振成像都需要先进的技术专长, 从而限制了大多数研究实验室使用这种方法。

大多数确定肾素数量的方法都是根据肾小球的识别来计算或估计的, 因为它们在结构上很容易被识别。本文介绍并论证了测定全肾肾数目的酸浸渍方法.酸浸渍法快速、可靠, 比其他方法、分解分馏塔法、磁共振成像法、方法便宜得多。此外, 酸浸渍法提供了高度可重复的估计肾数, 据报告, 这些肾数在使用磁共振成像²⁶确定的范围内。

研究方案

下面列出的用品和试剂是用来测定一只老鼠的整个肾肾号码, 即两个肾脏。用星号表示了对大鼠使用酸浸渍法的改进。所有实验规程都符合国家实验室动物护理和使用健康研究所的规定, 并得到了密西西比大学医学中心动物护理和使用机构委员会的批准。

1. 肾隔离程序

1. 称重小鼠 (或其他物种) 并使用异氟醚对其进行安乐死 (5%-8%)过量或戊巴比妥 (150 mg/kg 腹腔内注射)。
2. 一旦老鼠被安乐死, 用精细的手术剪刀沿着中线打开它的腹腔。
3. 小心地将肠道和生殖脂肪抬到腹腔的右侧。通过严重解剖, 隔离左肾。使用精细的手术剪刀, 切断左肾动脉和静脉, 并小心地取出左肾, 把肾脏适当标记 (小鼠数字标识符) 称重船含有磷缓冲盐水 (PBS)。
4. 对正确的肾脏重复该过程。
5. 将每个肾脏从其各自的称重船中取出, 并将其放置在用 PBS 预先润湿的外科纱布上。
6. 将肾脏留在手术纱布上, 迅速切除任何粘附的非肾脏组织 (如肾周脂肪或肾上腺), 然后取出肾胶囊。分别称重每个肾脏, 在实验室笔记本中分别记录左、右肾的重量。

2. 均质化、孵化和培训程序

1. 一旦每个肾脏被称重, 将 PBS 的每艘称重船排出, 并将肾脏放回贴有适当标签的称重船中。使用干净的剃须刀片, 将肾脏切成两半, 纵向。将每个肾脏的一半朝下, 并将每半切割成2毫米或更小的碎片。
2. 使用相同的剃须刀片, 仔细收集切碎的肾块, 并将其放入标记为15毫升的锥形管 (小鼠数字标识符; 左肾与右肾)。
3. 对相反的肾脏重复这个过程, 使用新的剃须刀片。将切碎的肾脏放入单独标记的15-mL 锥形管中。
4. 在通风良好的烟罩中, 在每个15-mL 锥形管中加入5毫升6M 盐酸 (HCl)。
5. 将盖更换为锥形管, 轻轻搅拌肾阴间混合物, 并将15-mL 锥形管放入37°c 设置的预热水浴中 90分钟 (* 大鼠肾脏 120分钟)。
6. 在孵育过程中每隔15分钟对每个15毫升管进行一次简单搅拌, 以确保所有组织都暴露在 HCl 酸中。
7. 将18-G 针头插入5-mL 注射器 (* 10 毫升大鼠注射器), 并小心取出注射器柱塞。将注射器放入50毫升锥形管 (管 #1) 的烟罩中。
8. 从水浴中取出肾/hcl 溶液, 将组织溶液倒入注射器的开口端, 并将15毫升锥形管放在试管架上。小心更换柱塞, 慢慢推动柱塞, 以便通过针头挤出溶液并进入管 #1。
9. 用5毫升的 PBS 溶液清洗15-mL 锥形管。在15-mL 锥形管中旋转 PBS, 以溶解任何剩余的肾脏组织。
10. 再次, 小心地从包含18-G 针的5毫升注射器上取出柱塞, 并将装药从15-mL 锥形管中倒入注射器的开口端。小心地更换柱塞, 然后轻轻推入柱塞, 进入管 #1, 冲洗注射器。重复此过程 2倍 (总共执行 3倍)。
11. 将 21 g 针插入新的5-mL 注射器 (* 10 毫升大鼠注射器), 并小心取出注射器柱塞。将注射器与 21 g 针连接到一个新的50毫升锥形管 (管 #2)。
12. 将 #1 的管中的内容物倒进含有 21 g 针头的注射器的开口端。小心插入柱塞并冲洗注射器, 轻轻按下注射器柱塞, 将挤出的溶液放入管中 #2。
13. 用5毫升的 PBS 溶液清洗管 #1。在管 #1 中旋转 PBS, 以溶解任何剩余的肾脏组织。
14. 再次, 小心地从含有18-G 针头的5毫升注射器上取出柱塞, 然后将内装物从管中 #1 倒进注射器的开口端。小心地更换柱塞, 然后通过轻轻推倒柱塞冲洗注射器, 将溶液挤出到管中 #2。重复此过程 2倍 (总共执行 3倍)。
15. 通过添加额外的 PBS, 使管道 #2 的总体积达到50毫升, 最高可达管 #2 上的50毫升线。
16. 将 #2 的输卵管, 将肾脏组织溶液放在冰箱内的摇杆上, 在 4°C (至少8-10 小时) 的摇杆上。

3. 肾小球计数和肾素数外推

1. 从冰箱中取出管 #2, 并通过多次轻轻倒置管, 重新悬浮颗粒组织, 以创建一个均匀的溶液。我们建议在加工后在5d 范围内计数肾小球。
2. 小心地将500μl 的肾脏溶液放入12孔板的单井中。重复这个 2倍, 把每个放在一个单独的井里, 这样每个肾就有三口井的肾脏溶液, 进行一式两份分析。
3. 在含有肾脏溶液的三口井中, 每口都加入500μl 的 PBS, 进行1:1 稀释。
4. 使用倒置显微镜, 计算每口井的肾小球数。计数是通过使用放置在每口井底部的16个单独部分的网格来帮助进行计数的。计算每个网格部分的肾小球数, 然后对每个网格的计数进行求和, 以获得每口井的肾小球总数。肾小球很容易通过其球状结构来识别。其他识别资料包括由于充血毛细血管而产生的红色, 以及仍然附着在个别肾小球体上的前或动脉后 (图 1)。
5. 添加三个井中每一口井的肾小球总数, 然后将每500μl 的肾溶液的肾小球平均数除以三个。如果每口井肾小球平均数量的方差大于 10%, 请重复肾计数程序, 密切关注肾脏溶液的均匀性。将每井计算的肾小球数乘以 100, 以计算每个肾肾小球的平均数量。肾总数可以表示每个肾脏或, 使用肾脏重量, 每毫克或克的组织。

结果

以下是来自高血压的既定小鼠模型和与年龄有关的慢性肾病的遗传大鼠模型的全肾肾数的代表性估计。肾小球的关键识别特征, 如有或没有附着在动脉前或动脉后或管状结构的球形结构, 突出显示了那些新的酸浸渍方法 (图 1)。

在第一个实验例子中, 在注入车辆 (盐水) 或血管紧张素 II 的小鼠 (雄性 c57bl6, 6?...

讨论

酸浸渍法具有良好的实验技术, 是评价全肾肾数目的理想方法。虽然肾脏溶解在酸中, 肾小球在很大程度上保持完整, 很容易识别, 使单个肾小球的计数相对容易和直接。酸浸渍技术特别有利, 原因有几个。首先, 酸浸渍法是一种快速方便的方法, 在费用和体力方面所需的工作量相对较小。执行酸浸渍方法所需的所有试剂和消耗品在大多数基本实验室都很容易获得, 唯一的主要要求是获得倒置显微镜进...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable