Estimation du nombre de néphron dans le rein entier à l’aide de la méthode de macération acide

Résumé

Les estimations du nombre de néphron de rein entier sont importantes cliniquement et expérimentalement, car il y a une association inverse entre le nombre de néphron et un risque accru de maladie rénale et cardiovasculaire. Dans les présentes, l’utilisation de la méthode de macération acide, qui fournit des estimations rapides et fiables du nombre de néphron du rein entier, est démontrée.

Résumé

La dotation de néphron fait référence au nombre total de néphrons dont naît une personne, car la néphrogenèse chez l’homme est complétée par 36 semaines de gestation et aucun nouveau néphrons n’est formé après la naissance. Le nombre de néphron se rapporte au nombre total de néphrons mesurés à tout moment après la naissance. Les facteurs génétiques et environnementaux influencent à la fois la dotation en néphron et le nombre. Comprendre comment des gènes ou des facteurs spécifiques influencent le processus de la néphrogenèse et de la perte ou de la disparition de néphron est important car les individus ayant une dotation ou un nombre de néphron inférieur sont considérés comme étant à un risque plus élevé de développer une maladie rénale ou cardiovasculaire. Comprendre comment les expositions environnementales au cours de la vie d’une personne affectent le nombre de néphron sera également vital pour déterminer le risque futur de la maladie. Ainsi, la capacité d’évaluer le nombre de néphron de rein entier rapidement et de manière fiable est une exigence expérimentale de base pour mieux comprendre les mécanismes qui contribuent à ou favorisent la néphrogenèse ou la perte de néphron. Ici, nous décrivons la méthode de macération acide pour l’estimation du nombre de néphron de rein entier basé sur la procédure décrite par Damadian, Shawayri, et Bricker, avec de légères modifications. La méthode de macération acide fournit des estimations rapides et fiables du nombre de néphron (tel qu’évalué par le comptage des glomérules) qui sont à moins de 5% de ceux déterminés en utilisant des méthodes plus avancées, quoique coûteuses, telles que l’imagerie par résonance magnétique. En outre, la méthode de macération acide est une excellente méthode à haut débit pour évaluer le nombre de néphron dans un grand nombre d’échantillons ou de conditions expérimentales.

Introduction

Le néphron est à la fois la structure de base et l’unité fonctionnelle du rein¹. Structurellement, le néphron se compose des glomérulus (capillaires et podocytes) situés à l’intérieur de la capsule du Bowman et du tubule rénal, composé du tubule proximale, de la boucle de Henle et du tubule distal qui se termine dans le canal collecteur. Fonctionnellement, le rôle du néphron est la filtration et la réabsorption de l’eau et des électrolytes et la sécrétion des déchets. En général, la néphrogenèse est achevée à 36 semaines de gestation chez l’homme et peu après la naissance chez plusieurs espèces comme la souris et le rat². La dotation de néphron se rapporte au nombre total de néphrons avec lesquels un individu naît, alors que le nombre de néphron est le nombre total de néphrons mesurés à tout moment après la naissance³. Le nombre de néphron terme et le nombre glomérulaire sont souvent utilisés indifféremment. Comme il n’y a qu’un seul glomérulus par néphron, l’évaluation du nombre de glomérules est un substitut important pour estimer le nombre de néphron.

L’évaluation de la dotation en néphron et du nombre de néphron est d’intérêt clinique, car les études ont démontré une association entre la dotation en néphron et les nombres de néphron réduits avec une incidence accrue de maladies cardiovasculaires^{4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15}. sur la base des résultats obtenus dans les reins lors de l’autopsie, le Brenner a observé que les personnes hypertensives présentaient un nombre total inférieur de néphrons par rapport aux individus normotensifs¹⁶. Ainsi, Brenner a émis l’hypothèse qu’il existe une relation inverse entre le nombre de néphron et le risque de développer une hypertension plus tard dans la vie. Brenner a également émis l’hypothèse qu’une réduction du nombre de néphron était compensée par les néphrons qui restaient. Afin de maintenir le taux de filtration normal dans le rein, les néphrons résiduels compensent en augmentant leur surface glomérulaire (hypertrophie glomérulaire), ce qui permet d’atténuer tout effet indésirable de la perte de néphron sur la fonction rénale^{4 ,16}.

Alors que la protection à court terme, l’hypertrophie glomérulaire, à long terme, conduit à une augmentation de la rétention de sodium et de liquide, augmentation du volume de liquide extracellulaire, et l’augmentation de la pression artérielle, conduisant à un cycle vicieux de nouvelles augmentations de pression capillaire glomérulaire, hyperfiltration glomérulaire, et cicatrices néphroniques (sclérose) et blessure^4,16.

L’obtention d’estimations ou de dénombrements du nombre de néphron offre quelques avantages expérimentaux: 1) il fournit des informations sur le processus de néphrogenèse, qui peut ensuite être lié à des gènes ou des facteurs spécifiques dans l’embryon ou l’environnement maternel-fœtal, et 2) Il y a une association de nombre de néphron avec des maladies cardiovasculaires et, ainsi, il y a le potentiel que des estimations du nombre de néphron pourraient être employées pour prédire le risque cardiovasculaire futur^2,17,18, le ^{19 ,} la ^{vingtaine ,} le ^{21 , 22}. en plus de l’environnement maternel-fœtal, plusieurs maladies affectent directement le nombre de néphron et la fonction rénale, y compris l’athérosclérose, le diabète, l’hypertension, et même le vieillissement normal^{2,9, 10,11,12,22,23}. Ainsi, l’évaluation du nombre de néphron du rein entier est importante pour comprendre à la fois les facteurs génétiques et environnementaux qui affectent la néphrogenèse (c.-à-d., la dotation de néphron) et le nombre de néphron au cours de la vie d’une personne et les effets résultants sur la fonction rénale et la santé cardiovasculaire.

Actuellement, il existe plusieurs méthodes disponibles pour la détermination et la quantification du nombre de néphron, chacun avec ses propres avantages et limitations^{24,25,26,27,28 ,29,30}. Les méthodes sophistiquées pour déterminer le nombre de néphron du rein entier comprennent des méthodes stéréologiques, telles que la méthode du dissecteur/fractionnement, et l’imagerie par résonance magnétique^25,26. Souvent considéré comme l’étalon-or pour déterminer le nombre de néphron du rein entier, la méthode dissectorielle/fractionnatrice est à la fois coûteuse et chronophage. Les progrès récents et l’amélioration de l’imagerie et du traitement par résonance magnétique ont fourni les outils nécessaires pour compter chaque néphron individuellement. Cependant, l’imagerie par résonance magnétique n’est pas seulement chronophage mais aussi extrêmement coûteuse. En outre, la méthode dissectorielle/fractionnée et l’imagerie par résonance magnétique requièrent une expertise technique avancée, limitant ainsi l’utilisation de ces méthodes dans la majorité des laboratoires de recherche.

La plupart des méthodes de détermination du nombre de néphron font des dénombrements ou des estimations basés sur l’identification des glomérules, car ils sont facilement identifiables structurellement. Dans cet article, la méthode de macération acide pour estimer le nombre de néphron dans le rein entier est décrite et démontrée²⁷. La méthode de macération acide est rapide, fiable et significativement moins coûteuse que d’autres méthodes, telles que la méthode dissectorielle/fractionnatrice et l’imagerie par résonance magnétique. En outre, la méthode de macération acide fournit des estimations hautement reproductibles du nombre de néphron qui ont été signalés comme étant dans la fourchette de ceux déterminés à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique²⁶.

Protocole

Les fournitures et les réactifs énumérés ci-dessous sont pour la détermination du nombre entier de néphron de rein dans une souris, c’est-à-dire deux reins. Les modifications pour l’utilisation de la méthode de macération acide pour rat sont identifiées par des astérisques. Tous les protocoles expérimentaux sont conformes au Guide national des instituts de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université du Mississippi.

1. procédure d’isolement des reins

1. Peser la souris (ou d’autres espèces) et l’euthanasier avec un isoflurane (5%-8%) surdosage ou pentobarbital (150 mg/kg d’injection intrapéritonéale).
2. Une fois que la souris est euthanasiée, ouvrez sa cavité abdominale en utilisant des ciseaux chirurgicaux fins le long de la ligne médiane.
3. Soulevez délicatement les intestins et l’adiposture reproductrice sur le côté droit de la cavité abdominale. Par dissection grossière, isoler le rein gauche. À l’aide de ciseaux chirurgicaux fins, coupez l’artère rénale gauche et la veine et retirez délicatement le rein gauche, plaçant le rein dans un bateau de pesée (numéro de souris/identificateur) convenablement étiqueté contenant une solution saline tamponnée au phosphore (PBS).
4. Répétez la procédure pour le rein droit.
5. Retirez chaque rein de son bateau de pesée respectif et placez-le sur une gaze chirurgicale pré-humidifiée avec du PBS.
6. En laissant le rein sur la gaze chirurgicale, enlevez rapidement tout tissu non-rénal adhérent (comme l’adipode perirénal ou la glande surrénale) suivi de l’ablation de la capsule rénale. Peser chaque rein individuellement, en enregistrant le poids du rein gauche et droit séparément dans un cahier de laboratoire.

2. homogénéisation, incubation et procédures de contrainte

1. Une fois que chaque rein est pesé, égoutter chaque bateau de pesage de PBS et replacez les reins dans le bateau de pesée convenablement étiqueté. À l’aide d’une lame de rasoir propre, coupez le rein en deux, en longueur. Placez chaque moitié de rein vers le bas et coupez chaque moitié en morceaux de 2 mm ou plus petits.
2. À l’aide de la même lame de rasoir, recueillir et placer soigneusement les morceaux de rein hachés dans un tube conique de 15 mL étiqueté (numéro/identificateur de la souris; rein gauche versus droit).
3. Répétez la procédure pour le rein opposé, à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir. Placer le rein haché dans un tube conique de 15 mL, étiqueté séparément.
4. Dans une hotte bien ventilée, ajouter 5 mL d’acide chlorhydrique 6 M (HCl) à chaque tube conique de 15 mL.
5. Replacer le capuchon dans le tube conique, agiter doucement le mélange rein/HCl et placer le tube conique de 15 mL dans un bain d’eau préchauffé réglé à 37 ° c pendant 90 min (* 120 min pour les reins de rat).
6. Agiter brièvement chaque tube de 15 mL toutes les 15 min pendant l’incubation afin de s’assurer que tous les tissus sont exposés à l’acide HCl.
7. Insérez une aiguille de 18 G dans une seringue de 5 mL (* seringue de 10 mL pour rat) et retirez délicatement le piston de la seringue. Placer la seringue dans un tube conique de 50 mL (tube #1) dans une hotte.
8. Retirer la solution rénale/HCl du bain d’eau et verser la solution tissulaire dans l’extrémité ouverte de la seringue et mettre le tube conique de 15 mL de côté dans un rack de tube à essai. Remplacez délicatement le piston et poussez lentement le piston de manière à extruder la solution à travers l’aiguille et dans le tube #1.
9. Lavez le tube conique de 15 mL avec 5 mL de solution PBS. Agiter le PBS dans le tube conique de 15 mL de façon à solubiliser les tissus rénaux restants.
10. Encore une fois, retirez délicatement le piston de la seringue de 5 mL contenant l’aiguille de 18 G et versez le contenu du tube conique de 15 mL dans l’extrémité ouverte de la seringue. Remplacez délicatement le piston et rincez la seringue en poussant doucement vers le bas sur le piston, dans le tube #1. Répétez ce processus 2x (effectué 3x au total).
11. Insérez une aiguille de 21 G dans une nouvelle seringue de 5 mL (* seringue de 10 mL pour rat) et retirez délicatement le piston de la seringue. Placer la seringue avec l’aiguille de 21 G attachée dans un nouveau tube conique de 50 mL (tube #2).
12. Versez le contenu du tube #1 dans l’extrémité ouverte de la seringue contenant l’aiguille de 21 G. Insérez délicatement le piston et rincez la seringue en poussant doucement le piston de la seringue et en plaçant la solution extrudée dans le tube #2.
13. Laver le tube #1 avec 5 mL de solution PBS. Agiter le PBS dans le tube #1 de façon à solubiliser les tissus rénaux restants.
14. Encore une fois, retirez délicatement le piston de la seringue de 5 mL contenant l’aiguille de 18 G et versez le contenu du tube #1 dans l’extrémité ouverte de la seringue. Remplacez délicatement le piston et rincez la seringue en poussant doucement vers le bas sur le piston, en extrudant la solution dans le tube #2. Répétez ce processus 2x (effectué 3x au total).
15. Apportez le volume total du tube #2 jusqu’à 50 mL en ajoutant du PBS supplémentaire, jusqu’à la ligne de 50 mL sur le tube #2.
16. Incuber le tube #2 contenant la solution de tissu de rein dans un rack de tube sur une plaque à bascule dans un réfrigérateur réglé à 4 ° c pendant la nuit (minimum 8-10 h).

3. comptage des glomérules et extrapolation du nombre de néphron

1. Retirez le tube #2 du réfrigérateur et Resuspendez le tissu granulé en l’invertant doucement plusieurs fois afin de créer une solution homogène. Nous recommandons de compter les glomérules dans les 5 d après le traitement.
2. Soigneusement aliquote 500 μL de la solution rénale dans un seul puits d’une plaque de 12 puits. Répétez cette 2x, en plaçant chaque aliquote dans un puits séparé de sorte qu’il y ait trois puits de solution rénale par rein, pour l’analyse en triplicate.
3. Ajouter 500 μL de PBS dans chacun des trois puits contenant la solution rénale, pour une dilution de 1:1.
4. À l’aide d’un microscope inversé, comptez le nombre de glomérules par puits. Le comptage est facilité par l’utilisation d’une grille de 16 sections distinctes placées sur le fond de chaque puits. Comptez le nombre de glomérules par chaque section quadrillée, puis additionnez le nombre par grille pour obtenir le total des glomérules par puits. Les glomérules sont facilement identifiables par leur structure sphérique. D’autres identificateurs comprenaient une teinte rougeâtre due à des capillaires remplis de sang, ainsi que des pré-ou post-artérioles qui demeurent attachés au corps de glomérules individuels (figure 1).
5. Ajouter le nombre total de glomérules comptés par chacun des trois puits, puis les diviser par trois pour le nombre moyen de glomérules par 500 μL de solution rénale. Si la variance du nombre moyen de glomérules par puits est supérieure à 10%, répéter la procédure de comptage néphron, en accordant une attention particulière à la nature homogène de la solution rénale. Multiplier le nombre de glomérules comptés par puits fois 100 pour le nombre moyen de glomérules par rein. Le nombre total de néphron peut être exprimé par rein ou, en utilisant le poids de rein, par mg ou g de tissu.

Résultats

Voici des estimations représentatives du nombre de néphron de rein entier d’un modèle de souris établi de l’hypertension et un modèle génétique de rat de la maladie rénale chronique liée à l’âge. Les principales caractéristiques d’identification des glomérules, telles qu’une structure sphérique avec ou sans structures pré-ou post-artériolaires ou tubulaires attachées, sont mises en évidence pour celles qui sont nouvelles à la méthode de macération acide (

Discussion

Avec une bonne technique expérimentale, la méthode de macération acide est idéale pour estimer le nombre de néphron dans le rein entier. Bien que le rein soit dissous dans l’acide, les glomérules demeurent largement intacts et sont facilement identifiables, rendant le comptage des glomérules individuels relativement facile et direct. La technique de macération acide est particulièrement avantageuse pour plusieurs raisons. Premièrement, la méthode de macération acide est une méthode rapide et pratique qui n...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable