Estimación del número de Nefrona en riñón entera utilizando el método de maceración ácida

Resumen

Las estimaciones del número total de Nefrona renal son importantes clínicamente y experimentalmente, ya que existe una Asociación inversa entre el número de Nefrona y un mayor riesgo de enfermedad renal y cardiovascular. En este documento, se demuestra el uso del método de maceración ácida, que proporciona estimaciones rápidas y fiables del número total de Nefrona renal.

Resumen

La investidura de Nefrona se refiere al número total de nefronas con las que nace un individuo, ya que la nefrogénesis en los seres humanos se completa por 36 semanas de gestación y no se forman nuevas nefronas después del parto. El número nefrón se refiere al número total de nefronas medidos en cualquier punto en el tiempo después del parto. Ambos factores genéticos y ambientales influyen tanto en la investidura de Nefrona como en su número. Comprender cómo influyen los genes o factores específicos en el proceso de nefrogénesis y pérdida o desaparición de Nefrona es importante, ya que se cree que las personas con una dotación o número de Nefrona más baja tienen un mayor riesgo de padecer enfermedad renal o cardiovascular. Entender cómo las exposiciones ambientales en el transcurso de la vida de una persona afecta el número de Nefrona también será vital para determinar el riesgo futuro de la enfermedad. Por lo tanto, la capacidad de evaluar el número completo de Nefrona renal de forma rápida y confiable es un requisito experimental básico para comprender mejor los mecanismos que contribuyen a o promueven la nefrogénesis o la pérdida de Nefrona. Aquí describimos el método de maceración ácida para la estimación del número entero de Nefrona renal basado en el procedimiento descrito por Damadian, Shawayri y Bricker, con ligeras modificaciones. El método de maceración ácida proporciona estimaciones rápidas y fiables del número de Nefrona (evaluados por el conteo de glomérulos) que están dentro del 5% de los que se determinan utilizando métodos más avanzados, aunque caros, como la resonancia magnética. Además, el método de maceración ácida es un excelente método de alto rendimiento para evaluar el número de Nefrona en grandes cantidades de muestras o condiciones experimentales.

Introducción

La nefrona es tanto la estructura básica como la unidad funcional del riñón¹. Estructuralmente, la nefrona consiste en el glomérulo (capilares y podocitos) ubicado dentro de la cápsula del Bowman y el túbulo renal, que consiste en el túbulo proximal, el lazo de Henle, y el túbulo distal que termina en el conducto colector. Funcionalmente, el papel de la nefrona es la filtración y reabsorción de agua y electrólitos y la secreción de desechos. En general, la nefrogénesis se completa a las 36 semanas de gestación en humanos y poco después del nacimiento en varias especies como el ratón y la rata². La investidura de Nefrona se refiere al número total de nefronas con las que nace un individuo, mientras que el número de nefronas es el número total de nebulas que se miden en cualquier momento después del parto³. El término número de Nefrona y número glomerular se utilizan a menudo indistintamente. Debido a que sólo hay un glomérulo por Nefrona, la evaluación del número de glomérulos es un sustituto importante para estimar el número de Nefrona.

La evaluación de la investidura de Nefrona y el número de Nefrona es de interés clínico ya que los estudios han demostrado una asociación entre la investidura de Nefrona y los números de nefrón reducidos con una mayor incidencia de enfermedades cardiovasculares^{4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15}. sobre la base de hallazgos en los riñones en la autopsia, Brenner observó que los individuos hipertensos presentaron con un número total más bajo de nefronas que individuos normotensivos¹⁶. Por lo tanto, Brenner presumido que existe una relación inversa entre el número de Nefrona y el riesgo de desarrollar hipertensión más adelante en la vida. Brenner también presumido que una reducción en el número de Nefrona fue compensada por las nefronas que permanecieron. Con el fin de mantener la tasa de filtración normal en el riñón, las nefronas residuales compensan aumentando su área superficial glomerular (hipertrofia glomerular), trabajando así para mitigar cualquier efecto adverso de la pérdida de Nefrona en la función renal^{4 ,16}.

Mientras que la protección en la hipertrofia glomerular a corto plazo, a largo plazo, conduce a un aumento de la retención de sodio y líquido, aumento del volumen de líquido extracelular, y aumentos en la presión arterial arterial, dando lugar a un círculo vicioso de aumentos adicionales en presión capilar glomerular, hiperfiltración glomerular y cicatrización de Nefrona (esclerosis) y lesión^4,16.

La obtención de estimaciones o recuentos del número de Nefrona ofrece un par de ventajas experimentales: 1) proporciona información sobre el proceso de nefrogénesis, que luego se puede vincular a genes o factores específicos en el embrión o el ambiente materno-fetal, y 2) existe una asociación de número de Nefrona con enfermedad cardiovascular y, por lo tanto, existe el potencial de que se puedan utilizar estimaciones del número de Nefrona para predecir futuros riesgos cardiovasculares^{2,17,18, 19 , 20 , 21 , 22}. Además del ambiente materno-fetal, varias enfermedades afectan directamente el número de Nefrona y la función renal, incluyendo aterosclerosis, diabetes, hipertensión e incluso el envejecimiento normal^{2,9, 10,11,12,22,23}. Por lo tanto, la evaluación del número entero de Nefrona renal es importante para comprender los factores genéticos y ambientales que afectan la nefrogénesis (es decir, la investidura de Nefrona) y el número de Nefrona en el transcurso de la vida de una persona y los efectos resultantes sobre la función renal y la salud cardiovascular.

Actualmente, existen varios métodos disponibles para la determinación y cuantificación del número de Nefrona, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones^{24,25,26,27,28 ,29,30}. Los métodos sofisticados para determinar el número completo de Nefrona renal incluyen métodos estereológicos, como el método de dessector/fraccionamiento y la resonancia magnética^25,26. A menudo considerado el estándar de oro para determinar el número entero de Nefrona de riñón, el método de dessector/fraccionador es costoso y consume mucho tiempo. Los avances recientes y la mejora en la imagen y el procesamiento de la resonancia magnética han proporcionado las herramientas para contar cada Nefrona individualmente. Sin embargo, las imágenes por resonancia magnética no solo consumen mucho tiempo, sino que también son extremadamente costosas. Además, tanto el método de dessector/fraccionamiento como la imagen por resonancia magnética requieren conocimientos técnicos avanzados, limitando así el uso de tales métodos en la mayoría de los laboratorios de investigación.

La mayoría de los métodos para determinar el número de Nefrona hacen recuentos o estimaciones basadas en la identificación de glomérulos, ya que son fácilmente identificables estructuralmente. En este documento, se describe y se demuestra el método de maceración ácida para estimar el número de Nefrona en el riñón entero²⁷. El método de maceración ácida es rápido, fiable y significativamente menos costoso que otros métodos, como el método de dessector/fraccionador y la resonancia magnética. Además, el método de maceración ácida proporciona estimaciones altamente repetibles del número de nefrona que se ha reportado que están dentro del rango de los determinados mediante la resonancia magnética²⁶.

Protocolo

Los suministros y reactivos enumerados a continuación son para la determinación de todo el número de Nefrona renal en un ratón, es decir, dos riñones. Las modificaciones para el uso del método de maceración ácida para ratas se identifican con asteriscos. Todos los protocolos experimentales se conformaron con la guía de institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales en el centro médico de la Universidad de Mississippi.

1. procedimiento de aislamiento renal

1. Pesar el ratón (u otras especies) y eutanasia con un isoflurano (5%-8%) Sobredosis o pentobarbital (150 mg/kg inyección intraperitoneal).
2. Una vez que el ratón es eutanzado, abra su cavidad abdominal utilizando tijeras quirúrgicas finas a lo largo de la línea media.
3. Levante cuidadosamente los intestinos y el adiposo reproductivo en el lado derecho de la cavidad abdominal. Por disección bruta, aísla el riñón izquierdo. Usando tijeras quirúrgicas finas, corte la arteria y la vena renal izquierda y retire con cuidado el riñón izquierdo, colocando el riñón en un barco de pesaje apropiadamente etiquetado (número de ratón/identificador) que contenga suero salino fosforado (PBS).
4. Repita el procedimiento para el riñón derecho.
5. Retire cada riñón de su respectivo bote de pesaje y colóquelo en una gasa quirúrgica pre-humedecido con PBS.
6. Dejando el riñón en la gasa quirúrgica, retire rápidamente cualquier tejido no renal adherente (como adiposo perirenal o glándula suprarrenal) seguido de la extracción de la cápsula renal. Pesar cada riñón individualmente, registrando el peso del riñón izquierdo y derecho por separado en un cuaderno de laboratorio.

2. procedimientos de homogeneización, incubación y encadenamiento

1. Una vez que se pesa cada riñón, escurrir cada bote de pesaje de PBS y volver a colocar los riñones en el bote de pesaje debidamente etiquetado. Usando una cuchilla de afeitar limpia, corta el riñón por la mitad, longitudinalmente. Coloque cada mitad del riñón hacia abajo y corte cada mitad en trozos de 2 mm o más pequeños.
2. Usando el mismo navajas, recoja cuidadosamente y coloque las piezas de riñón picadas en un tubo cónico de 15 mL etiquetado (número de ratón/identificador; izquierda versus riñón derecho).
3. Repite el procedimiento para el riñón opuesto, usando una nueva cuchilla de afeitar. Coloque el riñón picado en un tubo cónico de 15 mL con etiquetas separadas.
4. En una campana de humos bien ventilada, añadir 5 mL de ácido clorhídrico (HCl) de 6 M a cada tubo cónico de 15 mL.
5. Sustituya la tapa por el tubo cónico, agite suavemente la mezcla de riñón/HCl y coloque el tubo cónico de 15 mL en un baño de agua precalentado a 37 ° c durante 90 min (* 120 min para los riñones de rata).
6. Agitar brevemente cada tubo de 15 mL cada 15 min durante la incubación con el fin de asegurar que todo el tejido esté expuesto al ácido HCl.
7. Inserte una aguja de 18 G en una jeringa de 5 mL (* jeringa de 10 mL para ratas) y retire con cuidado el émbolo de la jeringa. Coloque la jeringa en un tubo cónico de 50 mL (tubo #1) en una campana extractora.
8. Retire la solución de riñón/HCl del baño de agua y vierta la solución de tejido en el extremo abierto de la jeringa y ponga el tubo cónico de 15 mL a un lado en un bastidor de tubo de ensayo. Reemplace con cuidado el émbolo y empuje lentamente el émbolo para extruir la solución a través de la aguja y en el tubo #1.
9. Lavar el tubo cónico de 15 mL con 5 mL de solución PBS. Agitar el PBS en el tubo cónico de 15 mL para solubilizar cualquier tejido renal restante.
10. Una vez más, retire con cuidado el émbolo de la jeringa de 5 mL que contiene la aguja 18-G y vierta el contenido del tubo cónico de 15 mL en el extremo abierto de la jeringa. Reemplace cuidadosamente el émbolo y enjuague la jeringa presionando suavemente hacia abajo en el émbolo, en el tubo #1. Repite este proceso 2x (realizado 3x en total).
11. Inserte una aguja de 21 G en una nueva jeringa de 5 mL (* jeringa de 10 mL para ratas) y retire con cuidado el émbolo de la jeringa. Coloque la jeringa con la aguja 21-G unida en un nuevo tubo cónico de 50 mL (tubo #2).
12. Vierta el contenido de la #1 del tubo en el extremo abierto de la jeringa que contiene la aguja 21-G. Inserte con cuidado el émbolo y lave la jeringa presionando suavemente el émbolo de la jeringa y colocando la solución extruida en el tubo #2.
13. Lavar el tubo #1 con 5 mL de solución PBS. Agitar el PBS en tubo #1 con el fin de solubilizar cualquier tejido renal restante.
14. Una vez más, retire con cuidado el émbolo de la jeringa de 5 mL que contiene la aguja 18-G y vierta el contenido del tubo #1 en el extremo abierto de la jeringa. Reemplace cuidadosamente el émbolo y enjuague la jeringa presionando suavemente hacia abajo en el émbolo, extruir la solución en el tubo #2. Repite este proceso 2x (realizado 3x en total).
15. Lleve el volumen total del tubo #2 hasta 50 mL añadiendo PBS adicional, hasta la línea de 50 mL en el tubo #2.
16. Incubar el tubo #2 que contiene la solución de tejido renal en una rejilla de tubo en una placa basculante en un refrigerador fijado a 4 ° c durante la noche (mínimo 8-10 h).

3. conteo de glomérulos y extrapolación del número de Nefrona

1. Quitar el tubo #2 del refrigerador y resuspender el tejido pelado, invirtiendo suavemente el tubo varias veces para crear una solución homogénea. Recomendamos contar los glomérulos dentro de los 5 d después del procesamiento.
2. Alícuota cuidadosamente 500 μL de la solución renal en un solo pozo de una placa de 12 pozo. Repite este 2x, colocando cada alícuota en un pozo separado para que haya tres pozos de solución renal por riñón, para análisis por triplicado.
3. Añadir 500 μL de PBS a cada uno de los tres pozos que contienen la solución renal, para una dilución 1:1.
4. Con un microscopio invertido, cuente el número de glomérulos por pozo. El conteo se ayuda mediante el uso de una rejilla de 16 secciones separadas colocadas en la parte inferior de cada pozo. Cuente el número de glomérulos por cada sección cuadriculada y luego sume el conteo por rejilla para obtener el número total de glomérulos por pozo. Los glomérulos son fácilmente identificables por su estructura esférica. Los identificadores adicionales incluyeron un matiz rojizo debido a los capilares llenos de sangre, así como antes o después de las arteriolas que permanecen adherido al cuerpo de los glomérulos individuales (figura 1).
5. Añadir el número total de glomérulos contados por cada uno de los tres pozos y luego dividirlos por tres para el número medio de glomérulos por 500 μL de solución renal. Si la varianza en el número medio de glomérulos por pozo es superior al 10%, repita el procedimiento de recuento de Nefrona, prestando mucha atención a la naturaleza homogénea de la solución renal. Multiplique el número de glomérulos contados por cada pozo 100 por el número promedio de glomérulos por riñón. El número total de Nefrona se puede expresar por riñón o, usando el peso del riñón, por mg o g de tejido.

Resultados

A continuación se presentan estimaciones representativas del número de Nefrona renal completa de un modelo de ratón establecido de hipertensión y un modelo de rata genética de la enfermedad renal crónica relacionada con la edad. Las características clave de identificación de los glomérulos, como una estructura esférica con o sin estructuras pre-o post-arteriolar o tubulares adjuntas, se destacan para aquellos nuevos en el método de maceración ácida (figur...

Discusión

Con una buena técnica experimental, el método de maceración ácida es ideal para estimar el número de Nefrona en todo el riñón. Aunque el riñón se disuelve en ácido, los glomérulos permanecen en gran parte intactos y son fácilmente identificables, haciendo que el conteo de glomérulos individuales sea relativamente fácil y sencillo. La técnica de maceración ácida es particularmente ventajosa por varias razones. En primer lugar, el método de maceración ácida es un método rápido y conveniente que requie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable