酸性揉捻法を用いた全腎ネフロン数の推定

要約

全腎ネフロン数の推定値は、ネフロン数と腎および心血管疾患のリスクの亢進との間に逆相関があるので、臨床的および実験的に重要である。ここで、全腎ネフロン数の迅速かつ信頼性の高い推定を提供する酸性揉捻法の使用が、実証されている。

要約

ネフロンは、ヒトの nephrogenesis が妊娠の36週までに完了し、新たなネフロンが誕生後に形成されないため、個体が生まれたネフロンの合計数を指します。ネフロン数は、出生後の任意の時点で測定されたネフロンの総数を指す。遺伝的要因と環境因子の両方がネフロンの両方のエンダウメントと数に影響を与えます。特定の遺伝子または因子が nephrogenesis およびネフロンの損失または終焉の過程にどのように影響するかを理解することは、より低いネフロンのエンダウメントまたは数を持つ個人が腎または心血管疾患を発症するリスクが高いと考えられるために重要である。人の一生にわたる環境曝露がネフロン数にどのように影響するかを理解することは、将来の疾患リスクを決定する上でも重要である。したがって、全腎ネフロン数を迅速かつ確実に評価する能力は、nephrogenesis またはネフロン損失に寄与または促進するメカニズムをよりよく理解するための基本的な実験要件である。ここでは、Damadian、Shawayri、およびブリッカーによって記述された手順に基づいて、腎臓全体のネフロン数を推定するための酸揉捻法について説明し、わずかな変更を加えた。酸性マセレーション法は、ネフロン数 (糸球体を計数することによって評価される) の 5% 以内であり、より高度な、しかし高価であるが、磁気共鳴イメージングなどの方法を用いて決定されたもののうちの、迅速で信頼できる推定値を提供する。さらに、酸性マセレーション法は、多数のサンプルまたは実験条件においてネフロン数を評価する優れた高スループット方法である。

概要

ネフロンは腎臓¹の基本的な構造および機能単位の両方である。構造的には、ネフロンは、ボーマンカプセルおよび腎細管内に位置する糸球体 (毛細血管および podocytes) と、近位細管、ヘンレのループ、および収集ダクトに終端する遠位細管からなる。機能的には、ネフロンの役割は、水と電解質の濾過と再吸収、および廃棄物の分泌である。一般に、nephrogenesis は、マウスおよびラット²のようないくつかの種において出生直後のヒトおよび生後約36週に完了する。ネフロンは、個体が生まれたネフロンの総数を指し、一方、ネフロン数は出生後³の任意の時点で測定されたネフロンの合計数です。ネフロン数および糸球体数という用語は、しばしば同義的に用いられる。ネフロンごとの糸球体は1つしか存在しないため、糸球体数の評価はネフロン数を推定するための重要なサロゲートです。

ネフロンのエンダウメントとネフロン数の評価は、研究がネフロン基金と心血管疾患の発生率の増加とのネフロン数との関連を示したので、臨床的な関心である^{4,5 、6、7、8、9、10、11、12、13、14、}剖検における腎臓の所見に基づいて、ブレンナーは、高血圧の個体が normotensive 個人¹⁶よりも低い総ネフロン数を提示したことを観察した。このように、ブレナーは、ネフロン数と、後の人生において高血圧を発症するリスクとの間に逆の関係があると仮説を立てた。ブレンナーはまた、ネフロン数の減少が残ったネフロンによって補われるという仮説を立てた。腎臓における正常な濾過速度を維持するために、残留ネフロンは糸球体表面領域 (糸球体肥大) を増加させることによって補償し、それによって腎機能上のネフロン損失の任意の有害作用を緩和するように働く^{4 、16}。

短期的には、糸球体肥大は、長期的には、ナトリウムおよび体液貯留の増加、細胞外液量の増加、および動脈血圧の上昇を招き、さらに増加する悪循環に至る。糸球体毛細血管圧、糸球体 hyperfiltration、およびネフロン瘢痕化 (硬化症) および傷害^4、16。

推定値またはネフロン数のカウントは、実験的な利点のカップルを提供しています: 1) それは、その後、胚または母体-胎児環境における特定の遺伝子または因子にリンクすることができる nephrogenesis のプロセスに関する情報を提供し、2)心血管疾患とネフロン数の関連があり、したがって、将来の心血管リスク^2、17、18を予測するために、ネフロン数の推定値が使用できる可能性があります。^19,20,21,22. 母体胎児環境に加えて、いくつかの疾患は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血圧、さらには正常な老化を含むネフロン数および腎機能に直接影響を与える^{2、9、 10、11、12、22、23}。したがって、全腎ネフロン数の評価は、人の生命の経過にわたる nephrogenesis (すなわちネフロン) およびネフロン数に影響する遺伝的および環境的要因の両方を理解するために重要であり、その結果として生じる効果腎機能と心血管の健康に.

現在、ネフロン数の決定と定量化のために利用可能ないくつかの方法があり、それぞれに独自の利点と制限があります^{24、25、26、27、28 、29、30}。全腎ネフロン数を決定するための洗練された方法には、解剖器/fractionator 法、および磁気共鳴画像^25、26などの stereological 方法が含まれる。多くの場合、腎臓全体のネフロン数を決定するための金標準と考えられているが、解剖器/fractionator 法は高価で時間がかかる。磁気共鳴イメージングと処理の最近の進歩と改善は、一つ一つのネフロンを個別にカウントするためのツールを提供してきました。しかし、磁気共鳴イメージングは、時間がかかるだけでなく、非常に高価です。さらに、解剖器/fractionator 法と磁気共鳴画像の両方が高度な技術的専門知識を必要とするため、大部分の研究所でこのような方法の使用を制限しています。

ネフロン数を決定するほとんどの方法は、糸球体の同定に基づいてカウントまたは推定を行い、構造的に容易に識別可能である。本論文では、全腎臓においてネフロン数を推定するための酸揉捻法について説明し、²⁷を示した。酸揉捻法は、高速で信頼性が高く、解剖器/fractionator 法や磁気共鳴イメージングなどの他の方法よりも大幅に安価です。さらに、この酸性揉捻法は、磁気共鳴イメージング²⁶を用いて決定されたものの範囲内にあると報告しているネフロン数の再現性の高い推定値を提供する。

プロトコル

以下に記載されている供給物および試薬は、1匹のマウス、すなわち2つの腎臓における全腎ネフロン数の決定のためのものである。ラットのための酸揉捻法の使用のための修正は、アスタリスクで識別されます.すべての実験プロトコールは、実験動物のケアと使用のための健康ガイドの国立研究所に適合し、ミシシッピ大学医療センターの機関の動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 腎分離手順

1. マウス (または他の種) を計量し、イソフルラン (5%-8%) で euthanize過剰投与またはペントバルビタール (150 mg/kg 腹腔内注射).
2. マウスを安楽死させると、正中線に沿って微細な外科用はさみを使用して腹腔を開く。
3. 腸と生殖用脂肪を腹腔の右側に慎重に持ち上げます。グロス解剖によって、左腎臓を分離する。微細な手術用はさみを使用して、左腎動脈および静脈を切断し、慎重に左腎臓を除去し、腎臓を適切に標識された (マウス番号/識別子) 蛍光体緩衝生理食塩水 (PBS) を含むボートの重量を量る。
4. 右の腎臓のための手順を繰り返します。
5. それぞれの重さのボートから各腎臓を削除し、PBS で予め湿らせた手術用ガーゼの上に置きます。
6. 手術ガーゼの上に腎臓を残し、すぐに腎カプセルの除去に続く任意の付着性の非腎組織 (perirenal 脂肪または副腎など) を除去します。それぞれの腎臓を個別に秤量し、実験ノートにおいて左右の腎臓の体重を別々に記録する。

2. 均質化、インキュベーション、および負担の手順

1. 各腎臓を計量したら、PBS の各重量ボートを排水し、適切に標識された計量ボートに戻って腎臓を置きます。清潔なかみそりの刃を使用して、腎臓を縦に半分に切ってください。各腎臓を下に向けて半分にし、2 mm またはそれよりも小さい部分にそれぞれの半分をカットします。
2. 同じ剃刀を使用して、細かく刻んだ腎臓の断片を標識された 15 mL の円錐形の管 (マウス番号 /識別子; 左と右の腎臓) に入れます。
3. 新しいかみそりの刃を使用して、反対の腎臓のための手順を繰り返してください。みじん切りにした腎臓を、別々に標識された 15 mL 円錐状のチューブに入れます。
4. 風通しの良いヒュームフードで、各 15 mL 円錐管に 6 M の塩酸 (HCl) 酸 5 mL を加えます。
5. キャップを円錐管に交換し、腎臓/HCl 混合物を静かに攪拌し、15 mL の円錐形のチューブを、37° c で設定した予熱した水浴中に90分 (ラット腎臓の場合は * 120 min) に置きます。
6. すべての組織が HCl に暴露されることを確実にするために、インキュベーション中に15分ごとに各 15 mL のチューブを簡単に攪拌ます。
7. 18グラムの針を5ml の注射器に挿入し (* 10 mL シリンジをラット用)、慎重にシリンジを取り外します。50の円錐形のチューブ (チューブ #1) をヒュームフードに入れて注射します。
8. 水浴から腎臓/HCl 溶液を取り出し、シリンジの開いた端に組織溶液を注ぎ、試験管ラックに 15 mL の円錐管を脇に置きます。慎重にプランジャーを交換し、溶液を針を通してチューブ #1 に押し出すようにプランジャーをゆっくりと押し込みます。
9. 5ml の PBS 溶液で 15 mL の円錐形のチューブを洗浄します。残りの腎臓組織を可溶化ように、15 mL の円錐管で PBS を旋回させる。
10. 再度、18 G 針を含んでいる 5 mL のスポイトからプランジャーを注意深く取除き、15の mL の円錐形の管からスポイトの開いた端に内容を注ぐ。慎重にプランジャーを交換し、チューブ #1 に、プランジャーをゆっくりと押し下げてシリンジをフラッシュします。このプロセスの2x を繰り返します (合計で3倍になります)。
11. 新しい 5 mL シリンジ (ラット用10ml シリンジ) に 21 G 針を挿入し、注射器プランジャーを慎重に取り外します。新しい 50 mL の円錐形の管 (管 #2) に付す 21 G の針が付いているスポイトを置きなさい。
12. チューブ #1 から、21 G 針を含むシリンジの開いた端に内容物を注ぎます。慎重にプランジャーを挿入し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げてシリンジをフラッシュし、押出液をチューブ #2 に入れます。
13. PBS 溶液 5 mL で洗浄チューブ #1。可溶化チューブ内の PBS を旋回させることで、残りの腎臓組織を維持することができ #1。
14. 再度、18 G 針を含んでいる 5 mL のスポイトからプランジャーを慎重に取除き、スポイトの開いた端に管 #1 からの内容を注ぐ。プランジャーを慎重に交換し、プランジャーを静かに押し下げてシリンジをフラッシュし、溶液をチューブ #2 に押し出します。このプロセスの2x を繰り返します (合計で3倍になります)。
15. チューブ #2 の 50-mL ラインまで、PBS を追加して、チューブ #2 の総量を最大 50 mL にします。
16. 4° c で一晩 (最小 8-10 h) に設定された冷蔵庫のロッカープレート上のチューブラックに腎臓組織溶液を含むインキュベートチューブ #2。

3. ネフロン数の糸球体と外挿のカウント

1. 冷蔵庫からチューブ #2 を取り外し、均質な溶液を作成するために、チューブを穏やかに数回反転させることによってペレット化された組織を再懸濁します。処理後 5 d 以内で糸球体を数えることをお勧めします。
2. 慎重にアリコートの500μ l を12ウェルプレートの単井戸に注入します。この2x を繰り返して、各アリコートを別々の井戸に置き、腎臓あたりの腎臓溶液の3つのウェルがあるように、三連での分析のために。
3. 腎溶液を含む3つのウェルのそれぞれに500μ l の PBS を添加し、1:1 希釈する。
4. 倒立顕微鏡を使用して、ウェルあたり糸球体の数をカウントします。カウントは、各ウェルの底部に配置された16の別々のセクションのグリッドを使用することによって助けられる。各グリッドセクションごとの糸球体の数をカウントし、1つのウェルあたりの合計数の糸球体を取得するには、1個あたりの数を合計します。糸球体は、それらの球状構造によって容易に識別可能である。付加的な識別子は、血液で満たされた毛細血管による赤みを帯びた色相、ならびに個々の糸球体の身体に付着したままであるプレ細動脈または後血管を含む (図 1)。
5. 3つの井戸のそれぞれについてカウントされた糸球体の合計数を追加し、腎臓液500μ l あたり糸球体の平均数の3つによってそれらを分割します。ウェルあたりの平均糸球体数の分散が 10% を超える場合は、腎臓溶液の均質な性質に細心の注意を払って、ネフロンの手順を繰り返します。1腎あたりの平均糸球体数について、ウェルタイムズ100あたりの糸球体数を乗算します。合計ネフロン数は、腎臓ごとに、または腎臓の重量を使用して、mg または g の組織ごとに発現させることができる。

結果

以下は高血圧の確立されたマウスモデルからの全腎ネフロン数の代表的な推定値と加齢性慢性腎疾患の遺伝的ラットモデルである。事前または細動脈後、または管状構造に接続されているかどうかにかかわらず、球状構造のような糸球体の主要な識別特性は、酸性マセレーション法に新しいものについては強調しています (図 1)。

ディスカッション

優れた実験技術により、酸性マセレーション法は、腎臓全体のネフロン数を推定するのに理想的です。腎臓は酸に溶解しているが、糸球体はほとんど無傷のままであり、容易に識別可能であるため、個々の糸球体の計数は比較的容易で簡単である。この酸性マセレーション技術は、いくつかの理由により特に有利である。第1に、酸性マセレーション法は、費用と身体的努力の面で比較的少な...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable