Schätzung der Nephron-Zahl in Ganznierstein mit der Acid-Maeration-Methode

Zusammenfassung

Schätzungen der gesamten Nieren-NPhrafonzahl sind klinisch und experimentell wichtig, da es einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der Nphron-Zahl und einem erhöhten Risiko für Nieren-und Herz-Kreislauf-Erkrankungen gibt. Dabei wird die Verwendung der Säure-Mazerationsmethode, die schnelle und zuverlässige Schätzungen der gesamten Nieren-NPhron-Zahl liefert, nachgewiesen.

Zusammenfassung

Die Gabelstiftung bezieht sich auf die Gesamtzahl der Neffen, mit denen ein Individuum geboren wird, da die Nierenbildung beim Menschen durch 36 Wochen der Schwangerschaft abgeschlossen wird und keine neuen Neffen nach der Geburt gebildet werden. Die Nepthron-Zahl bezieht sich auf die Gesamtzahl der zu jedem Zeitpunkt nach der Geburt gemessenen Nphronen. Sowohl genetische als auch ökologische Faktoren beeinflussen sowohl die Nphronausstattung als auch die Anzahl. Zu verstehen, wie bestimmte Gene oder Faktoren den Prozess der Nieren-und Nierenverlust oder des Niedergangs beeinflussen, ist wichtig, da Menschen mit geringerer Neffon-Stiftung oder-zahl ein höheres Risiko für die Entwicklung von Nieren-oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben. Zu verstehen, wie sich Umweltbelastungen im Laufe der Lebenszeit auf die Nphron-Zahl auswirken, wird auch entscheidend sein, um das zukünftige Krankheitsrisiko zu ermitteln. So ist die Fähigkeit, die ganze Nieren-Nphron-Zahl schnell und zuverlässig zu beurteilen, eine grundlegende experimentelle Anforderung, um Mechanismen besser zu verstehen, die zur Nierenentzündung oder zum Nefftverlust beitragen oder sie fördern. Hier beschreiben wir die Säure-Mazerationsmethode zur Abschätzung der gesamten Nierennephron-Nummer, die auf dem von Damadian, Shawayri und Bricker beschriebenen Verfahren basiert, mit leichten Änderungen. Die Methode der Säuremeration bietet schnelle und zuverlässige Schätzungen der Neffonenzahl (wie sie durch Zählen von Glomeruli bewertet wird), die innerhalb von 5% der mit fortgeschritteneren, wenn auch teuren Methoden wie Magnetresonanztomographie bestimmt werden. Darüber hinaus ist die Säure-Mazerationsmethode eine ausgezeichnete Methode, um die Neffonzahl in einer großen Anzahl von Proben oder experimentellen Bedingungen zu bewerten.

Einleitung

Der Nphron ist sowohl die strukturelle Grund-als auch die funktionelle Einheit der Niere 1^. Strukturell besteht das Nphron aus dem Glomerulus (Kapillaren und Pokdozyten), der sich in der Kapsel des Bowman befindet, und der Nierenröhre, bestehend aus der proximalen Röhre, der Schleife von Henle, und der distalen Röhre, die sich in den Sammelkanal auslotet. Funktionell ist die Rolle des Nphrons die Filtration und Wiederabsorption von Wasser und Elektrolyten und die Abscheidung von Abfällen. In der Regel wird die Nierenkunde mit 36 Wochen der Schwangerschaft beim Menschen und kurz nach der Geburt bei mehreren Arten wie der Maus und der Ratte²abgeschlossen. Die Neffon-Stiftung bezieht sich auf die Gesamtzahl der Nätze, mit denen ein Individuum geboren wird, während die Neff-Zahl die Gesamtzahl der zu jeder Zeit nach der Geburt gemessenen Nphronen ist. Der Begriff nephron Nummer und die glomeruläre Zahl werden oft austauschbar verwendet. Da es nur einen Glomerulus pro Neffon gibt, ist die Bewertung der Glomeruli-Zahl ein wichtiger Ersatz für die Schätzung der nephronenlichen Zahl.

Die Bewertung der NPhron-Stimausbeweidung und der Nphron-Zahl ist von klinischem Interesse, da Studien einen Zusammenhang zwischen der Nphron-Ausstattung und der Verringerung der Nphron-Zahlen mit einer erhöhten Häufigkeitvon Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4^{, 5 gezeigt}haben. ^,6, 7^{,8,9, 10,11, 12,13,14}, ¹⁵. Auf der Grundlage von Befunden in Nieren bei der Autopsie beobachtete Brenner, dass hypertensive Individuen mit einer geringeren Gesamtzahl von Npresphronen als normotensive Individuen 16^dargestelltwurden. So vermutete Brenner, dass es einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der nephronen Zahl und dem Risiko, später im Leben zu Bluthochdruck zu entwickeln, gibt. Brenner vermutete auch, dass eine Reduzierung der Nphron-Zahl durch die verbliebenen Neffen kompensiert wurde. Um die normale Filtrationsrate in der Niere zu erhalten, kompensieren Restnephronen durch die Erhöhung ihrer glomerulären Oberfläche (glomeruläre Hypertrophie) und arbeiten so daran, die negativen Auswirkungen des Nuppressionsverlustes auf die Nierenfunktion abzumildern 4 ^,16.

Während die schützende in der kurzfristigen, glomerulären Hypertrophie, auf lange Sicht, führt zu einer erhöhten Natrium-und Flüssigkeitsansammlung, erhöhte extrazelluläre Flüssigkeitsvolumen, und erhöht den arteriellen Blutdruck, was zu einem Teufelskreis von weiteren Anstieg in Glomerulärer Kapillardruck, glomerulare Hyperfiltration, und Neff-Narbenbildung (Sklerose) und Verletzung^4,16.

Die Einholung von Schätzungen oder Zählungen der nephron-Zahl bietet ein paar experimentelle Vorteile: 1) sie liefert Informationen über den Prozess der Nierenentstehung, die dann mit bestimmten Genen oder Faktoren in der Embryonen-oder mütterlich-fetalen Umgebung verknüpft werden können, und 2) Es gibt einen Zusammenhang von nephron Zahl mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und so gibt es das Potenzial, dass Schätzungen der nephron Zahl verwendet werden könnten, um zukünftige Herz-Kreislauf-Risiko^{2,17,18vorherzusagen, 19 , 20 , 21 , 22}. Neben der mütterlich-fetalen Umgebung wirken mehrere Krankheiten direkt auf die Nphron-Zahl und Nierenfunktion, darunter Atherosklerose, Diabetes, Bluthochdruck undsogar normales Altern 2,9^{, 10,11,12,22},²³. Daher ist es wichtig, dass die Beurteilung der gesamten Nierennephron-Zahl sowohl die genetischen als auch die Umweltfaktoren, die die Nierenentzündung beeinflussen (d.h.die Nephon-Stiftung), und die Nphron-Zahl im Laufe des Lebens einer Person und die daraus resultierenden Auswirkungen verstehen. Auf Nierenfunktion und Herz-Kreislauf-Gesundheit.

Derzeit gibt es mehrere Methoden zur Bestimmung und Quantifizierung der nephron-Zahl, die jeweils ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen 24, 25^{, 26,27,28 ,29,30}. Zu den ausgeklügelten Methoden zur Bestimmung der gesamten Nierennephron-Zahl gehören stereologische Methoden, wie die Dissektor/Fractionator-Methode und die Magnetresonanztomographie 25^,26. Die Dissektor/Fractionator-Methode wird oft als Gold-Standard für die Bestimmung der gesamten Nierennachzahl betrachtet und ist sowohl teuer als auch zeitaufwendig. Die jüngsten Fortschritte und Verbesserungen in der Magnetresonanztomographie und-verarbeitung haben die Werkzeuge zur Verfügung gestellt, um jeden einzelnen Neffon einzeln zu zählen. Die Magnetresonanztomographie ist aber nicht nur zeitaufwendig, sondern auch extrem teuer. Darüber hinaus erfordert sowohl die Dissektor/Fractionator-Methode als auch die Magnetresonanztomographie ein fortgeschrittenes technisches Know-how, wodurch der Einsatz solcher Methoden in den meisten Forschungslabors begrenzt wird.

Die meisten Methoden zur Bestimmung der nephron-Zahl machen auf der Grundlage der Identifizierung von Glomeruli Zählungen oder Schätzungen, da sie leicht strukturell erkennbar sind. In diesem Beitrag wird die Säure-Mazerationsmethode zur Abschätzung der Neffonzahl in der ganzen Niere beschriebenund gezeigt 27. Die Säure-Mazerationsmethode ist schnell, zuverlässig und deutlich günstiger als andere Methoden, wie die Dissektor/Fractionator-Methode und die Magnetresonanztomographie. Darüber hinaus liefert die Säure-Mazerationsmethode sehr wiederholbare Schätzungen der Nphron-Zahl, die Berichten zufolge im Bereich der Magnetresonanztomographie 26 liegen.

Protokoll

Nachschub und Reagenzien sind für die Bestimmung der gesamten Nierennummer in einer Maus, also zwei Nieren. Modifikationen für die Verwendung der Säuremerationsmethode für Ratte werden mit Sternchen identifiziert. Alle experimentellen Protokolle, die den National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals entsprechen und vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Mississippi Medical Center genehmigt wurden.

1. Nierenisolierungsverfahren

1. Wiegen Sie die Maus (oder andere Arten) und euthanieren Sie sie mit einem Isoofluran (5%-8%) Überdosis oder Pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneale Injektion).
2. Sobald die Maus euthaniert ist, öffnen Sie ihre Bauchhöhle mit feiner chirurgischer Schere entlang der Mittellinie.
3. Den Darm vorsichtig anheben und den Reproduktionsadipsebereich auf die rechte Seite der Bauchhöhle legen. Durch grobe Trennung, isolieren Sie die linke Niere. Mit einer feinen chirurgischen Schere die linke Nierenarterie und die Vene schneiden und die linke Niere vorsichtig entfernen, indem Sie die Niere in ein entsprechend beschriftetes (Maus-Nummerierung/Identifikator) Gewichtsboot mit phosphorgepuffener Saline (PBS) legen.
4. Wiederholen Sie die Prozedur für die richtige Niere.
5. Jede Niere aus dem jeweiligen Gewichtheber nehmen und auf eine mit PBS vorbefeuchtete chirurgische Gaze legen.
6. Wenn man die Niere auf der chirurgischen Gaze verlässt, entfernen Sie schnell das anhaftende nicht-Rennengewebe (wie perirenales Fettmittel oder Nebennierendrüse), gefolgt von der Entfernung der Nierenkapsel. Wiegen Sie jede Niere einzeln, das Gewicht der linken und rechten Niere separat in einem Labornotebook.

2. Homogenisierungs-, Inkubations-und Strafverfahren

1. Sobald jede Niere gewogen ist, ziehen Sie jedes Gewichtsboot von PBS ab und legen Sie die Nieren zurück in das entsprechend beschriftete Gewichtsboot. Mit einer sauberen Rasierklinge schneiden Sie die Niere in die Hälfte, längs. Jede Niere halb nach unten legen und jede Hälfte in 2 mm oder kleinere Stücke schneiden.
2. Mit dem gleichen Rasiermesser die gehackten Nierenstücke sorgfältig sammeln und in eine beschriftete 15-mL-konische Röhre legen (Maus-Nummerierung/Kennung; links versus rechte Niere).
3. Wiederholen Sie die Prozedur für die gegenüberliegende Niere, mit einer neuen Rasierklinge. Die gehackte Niere in ein separat beschriftetes 15-mL-konische Rohr geben.
4. In einer gut belüfteten Rauchhaube 5 ml 6 M Salzsäure (HCl) zu jedem 15-mL-konischen Rohr hinzufügen.
5. Die Kappe an das konische Rohr ersetzen, das Kidney/HCl-Gemisch sanft anrühren und das 15-mL-konische Rohr in ein vorgeheiztes Wasserbad bei 37 ° C für 90 Minuten (* 120 min für Rattennebel) legen.
6. Während der Brutzeit alle 15 Minuten kurz aufrüsten, um sicherzustellen, dass alle Gewebe HCl-Säure ausgesetzt sind.
7. Eine 18-G-Nadel in eine 5-mL-Spritze (* 10-mL-Spritze für Ratte) geben und vorsichtig die Spritzenspanne entfernen. Die Spritze in ein 50-mL-konisches Rohr (Rohr #1) in eine Rauchhaube geben.
8. Die Kidney/HCl-Lösung aus dem Wasserbad entfernen und die Gewebelösung in das offene Ende der Spritze gießen und das 15-mL-konische Rohr in einem Reagenzgläser-Rack beiseite stellen. Den Kolben vorsichtig ersetzen und langsam drücken, um die Lösung durch die Nadel zu extrudieren und in die Röhre #1 zu pressen.
9. Waschen Sie das 15-mL-konische Rohr mit 5 ml PBS-Lösung. Die PBS in der 15-mL-konischen Röhre schwirren, um das restliche Nierengewebe zu lösen.
10. Auch hier den Kolben vorsichtig aus der 5-mL-Spritze mit der 18-G-Nadel entfernen und den Inhalt aus dem 15 mL-konischen Rohr in das offene Ende der Spritze gießen. Den Kolben vorsichtig ersetzen und die Spritze durch sanftes Drücken auf den Kolben, in den Schlauch #1 spülen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x (insgesamt 3x).
11. Eine 21-G-Nadel in eine neue 5-mL-Spritze (* 10-mL-Spritze für Ratte) geben und vorsichtig die Spritzenspalte entfernen. Die Spritze mit der 21-G-Nadel in ein neues 50-ML-konisches Rohr (Rohr #2) legen.
12. Den Inhalt aus der Röhre #1 in das offene Ende der Spritze mit der 21-G-Nadel gießen. Den Kolben vorsichtig einlegen und die Spritze bündeln, indem Sie den Spritzenpfall vorsichtig nach unten drücken und die extrudierte Lösung in die Rohre legen #2.
13. Waschrohr #1 mit 5 ml PBS-Lösung. Wirbeln Sie die PBS in der Röhre #1, um alle verbleibenden Nierengewebe zu lösen.
14. Auch hier den Kolben vorsichtig aus der 5-mL-Spritze mit der 18-G-Nadel entfernen und den Inhalt aus dem Rohr #1 in das offene Ende der Spritze gießen. Den Kolben vorsichtig ersetzen und die Spritze durch sanftes Drücken auf den Kolben, die in die Rohre #2 drücken. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2x (insgesamt 3x).
15. Bringen Sie das Gesamtvolumen der Röhre #2 bis zu 50 mL, indem Sie zusätzliche PBS, bis zur 50-ML-Linie auf Schlauch #2.
16. Inkubat-Rohr #2, das die Nierengewebelösung in einem Röhrenständer auf einer Rocker in einem Kühlschrank enthält, der über Nacht bei 4 ° C liegt (mindestens 8-10 h).

3. Zählung von Glomeruli und Hochrechnung der Nephron-Zahl

1. Das Rohr #2 aus dem Kühlschrank nehmen und das pellende Gewebe wieder aufleben lassen, indem das Rohr mehrmals sanft umgedreht wird, um eine homogene Lösung zu schaffen. Wir empfehlen, Glomeruli nach der Verarbeitung innerhalb von 5 d zu zählen.
2. Vorsichtig aliquot 500 μL der Nierenlösung in einen einzigen Brunnen einer 12-well-Platte. Wiederholen Sie diese 2x, indem Sie jeden Aliquot in einen separaten Brunnen, so dass es drei Brunnen der Nierenlösung pro Niere, für die Analyse in Triplicat.
3. Fügen Sie 500 μL PBS zu jedem der drei Brunnen, die die Nierenlösung enthalten, für eine 1:1-Verdünnung hinzu.
4. Mit einem umgekehrten Mikroskop, zählen Sie die Anzahl der Glomeruli pro Brunnen. Das Zählen wird durch die Verwendung eines Gitters von 16 getrennten Abschnitten unterstützt, die auf dem Boden eines jeden Brunnens platziert sind. Zählen Sie die Anzahl der Glomeruli pro Gitter und addieren Sie dann die Anzahl pro Gitter, um die Gesamtzahl der Glomeruli pro Brunnen zu erhalten. Glomeruli sind durch ihre kugelförmige Struktur leicht zu erkennen. Weitere Identifikatoren waren ein rötlicher Farbton aufgrund blutgefüllter Kapillaren sowie Vor-oder Nacharteriolen, die am Körper einzelner Glomeruli haften bleiben (Abbildung 1).
5. Fügen Sie die Gesamtzahl der Glomeruli pro der drei Brunnen hinzu und teilen Sie sie dann für die durchschnittliche Anzahl von Glomeruli pro 500 μL Nierenlösung um drei. Wenn die Varianz in der durchschnittlichen Anzahl von Glomeruli pro Brunnen größer als 10% ist, wiederholen Sie das Nephron-Zählverfahren, wobei Sie die Homogene Natur der Nierenlösung genau beachten. Multiplizieren Sie die Anzahl der Glomeruli, die je gut mal 100 gezählt werden, für die durchschnittliche Anzahl der Glomeruli pro Niere. Die Gesamtzahl der NPhron kann pro Niere oder mit Nierengewicht pro mg oder g Gewebe angegeben werden.

Ergebnisse

Im Folgenden finden Sie repräsentative Schätzungen der gesamten Nierennephron-Zahl aus einem etablierten Mausmodell der Hypertonie und einem genetischen Rattenmodell der altersbedingten chronischen Nierenerkrankungen. Für diejenigen, die neu in der Säuremasisierungsmethode sind (Abbildung1), werden wesentliche Identifikationsmerkmale von Glomeruli hervorgehoben, wie zum Beispiel eine kugelförmige Struktur mit oder ohne angebrachte Vor-oder Nach-oder Rohr...

Diskussion

Mit guter experimenteller Technik ist die Säure-Mazerationsmethode ideal für die Abschätzung der Neffonzahl in der ganzen Niere. Obwohl sich die Niere in Säure aufgelöst hat, bleiben Glomeruli weitgehend intakt und leicht erkennbar, was die Zählung einzelner Glomeruli relativ einfach und unkompliziert macht. Die Säuremerationstechnik ist aus mehreren Gründen besonders vorteilhaft. Erstens ist die Methode der Säure eine schnelle und bequeme Methode, die relativ wenig an Kosten und körperlicher Anstrengung erford...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anesthesia	Abbott Laboratories	05260-05
Isoflurane vaporizor system & flow gauge	Braintree Scientific	VP I	Include medical grade oxygen supply
Leica Inverted Microscope DMIL LED	Leica Microsystems	DMIL LED	Any make also suitable
Digital water bath	Fisher Scientific	2239	Any make also suitable
ToughCut Fine surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11	25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight
Micro dissecting forceps 4 1/4 in.	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	Curved tip
Plexiglass board 5 in. x 7 in.	any source suitable	n/a	Any make also suitable
Hexagonal polystyrene weighing dish	Fisher Scientific	02-2002-100	Any make also suitable
Razor blades	Fisher Scientific	12-640	Single edge carbon steel 0.009
Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply	Fisher Scientific	MSD-1400250
10x concentrate phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-4L	Dilute to 1x
6 N Hydrocholric acid solution	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C	Any make also suitable
50 mL conical centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A	Any make also suitable
Disposable 5 mL syringe	Cole Palmer	EW-07944-06	Any make also suitable
18G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5D	Any make also suitable
21G1.5 disposable needle	Fisher Scientific	14-826-5B	Any make also suitable
12-well multiple-well cell culture plates with lid	Cole Palmer	#FW-01959-06	Any make also suitable
Polypropylene modular test tube rack	Cole Palmer	#EW-06733-00	Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable