全飞头段耗氧率的测定与解释

摘要

测量代谢率的变化是了解各种疾病和衰老进展的关键。在这里, 我们提出了一个新的技术来测量整个头部的耗氧量, 更接近的生理状态, 并可能有助于揭示新的药物, 改变线粒体的活性。

摘要

调节代谢活动对于活细胞的正常运作至关重要。事实上, 代谢活动的改变与癌症、糖尿病、神经退行性变和衰老的进展有因果关系。例如, 线粒体活性的变化--细胞的代谢动力--在许多此类疾病中都有其特征。一般来说, 线粒体的耗氧率被认为是线粒体活性的可靠读数, 其中一些研究的测量是基于分离的线粒体或细胞。然而, 这样的情况可能并不代表整个组织的复杂性。最近, 我们开发了一种新的方法, 可以动态测量整个孤立飞头的耗氧率。利用这种方法, 我们记录了年轻苍蝇与老年苍蝇整个头部段的耗氧率较低。其次, 我们发现赖氨酸去乙酰化酶抑制剂迅速改变了整个头部的耗氧量。因此, 我们的新技术可能有助于发现各种药物的新特性, 这可能会影响代谢率。此外, 我们的方法可以让更好地了解代谢行为的实验设置, 更接近生理状态。

引言

调节代谢活动对于细胞的存活和组织的健康功能至关重要。放松管制的代谢活动已被广泛证明与各种疾病的发生和进展1有关.例如, 较低的代谢活动以前被描述在神经退行性疾病, 如阿尔茨海默氏症和年龄相关的记忆障碍^2,3。此外, 线粒体功能障碍被认为是因果关系的老化过程^4,5。另一方面, 在癌细胞⁶中描述了较高的线粒体和代谢率, 其中使用线粒体抑制剂降低了肿瘤的发生.

代谢活动的一个读数是线粒体的耗氧率 (ocr)。有趣的是, 这种类型的读数主要是从孤立的线粒体或细胞获得的, 因此文献中描述的大部分内容主要是基于与生理状态不相似的读数。但是, 此技术有几个缺点。首先, 线粒体分离的协议可能会损害其完整性⁸, 这可能是比较从年轻组织和老年组织9中分离的线粒体时的一个相关的人工制品^.此外, 分离过程很长, 可能会导致相关蛋白质翻译后修饰的损失, 调节线粒体功能^9,10,11。此外, 它已经表明, 孤立的线粒体并不一致地代表整个组织代谢^{率 12,13.}这种细胞生物学复杂性可以被看作是, "整体大于其各部分的总和",即线粒体可能显示不同的代谢率在一个复杂的细胞内相比, 他们的代谢率, 当孤立。

虽然细胞可能比分离的线粒体提供更好的 ocr 读数, 但在整个组织的背景下, 细胞与细胞之间的通信可能会丢失。例如, 在大脑中, 神经元的代谢活动在很大程度上取决于邻近胶质细胞的代谢活动¹⁴。因此, 建立新的技术来调查整个组织或整个生物体中的 ocr 可能会被证明是更有见地的发病和进展的各种疾病。

最近, 出现了新的技术来解决这些问题, 并能够测量整个组织, 段, 或活生物体的 ocr。例如, 最近的一项研究报告了使用带有呼吸计15的渗透纤维方法从甲虫飞行肌肉中测量氧气的情况.新的微呼吸测量机可以测量胰岛的 ocr^16,17。因此, 据报道, 该技术能够测量全蠕虫¹⁸和斑马鱼¹⁹的 ocr。然而, 消化道屏障的存在可能会对在 ocr 改变的情况下检测各种药物构成挑战。有趣的是, 内维尔和他的同事最近的报告显示了一种用井板^20,21测量单果蝇幼虫大脑的新技术。

在这项研究中, 我们使用了类似的设置, 以实现整个 ocr 的测量从整个活的和非移动的五合器22。这项技术还提供了一个次要优势, 可以测量各种药物对整个部分代谢活动的影响, 而不必通过消化系统屏障^13,22.例如, 此前已经证明, 直接注射赖氨酸去乙酰化酶抑制剂 (kdaci), 一种被认为改变大脑表观遗传机制的药物, 导致了记忆形成²³的改善。然而, 通过使用我们的新技术, 我们发现 kdac 的抑制导致 ocr 的迅速增加, 这本身可能是一个因素本身在神经元活动。我们的协议提供了一种简单而新颖的方法来评估各种药物、基因操纵或生理状态 (疾病、衰老) 在整个头部的背景下对 ocr 的影响。

研究方案

1. 仪器制备

注意: 在这个实验中, 我们使用了带有 "胰岛板" 的海马 xf24 设备。该技术的操作使用不同的混合、等待和测量周期, 以及向测量隔间添加物质的可能性。

1. 在实验开始前尽早打开机器, 以便有足够的时间达到所需的温度并保持稳定。
2. 在软件设置 (管理模式) 中, 选择墨盒校准的长度 (此处选择了 20分钟) 和所需的温度。
   注: 线粒体或哺乳动物组织测量通常在37°c 进行,而飞头环境温度为 25°c, 但在31°c 时公布测量结果。我们使用了 31°c, 因为这是设备在室温下的最低温度设置。要达到25°c 或更低的温度, 请将机器放置在较冷的房间或 11°c, 如最近公布^{的 21°c}。
3. 在软件中, 使用以下协议: 3分钟混合–2分钟等待–2分钟测量。根据实验设计, 在选择的测量步骤之后, 从端口 a-d 添加注射步骤。
   1. 对于质量检查和基础 ocr 的测定, 请等待至少三个测量周期, 然后再通过端口 a 注射第一种药物。有关协议的详细时间表, 请参见参考 becker等人.¹³.

2. 墨盒准备

1. 在测试前每天 (或至少 4小时) 对墨盒进行预校准。将校准器 (ph 7.4) 的 1.0 ml 添加到每个井中, 并将传感器墨盒放在板顶部, 并在没有二氧化碳₂的37°c 下存放一夜或高达 72小时. 如果墨盒的水份超过 24小时, 则防止使用准滤膜的墨盒蒸发。
2. 在实验开始前, 确保实验药物在培养基 (新鲜培养基 + 2.5% 葡萄糖) 中溶解良好。
3. 测量药物溶液的 ph 值并将其调整到所需温度下的车辆 ph 值, 以避免药物注射过程中的任何 ph 值差异。
4. 将药物溶液移到其分配的注射端口。例如, 使用77μl 的端口 a, 以实现1:10 稀释在770μl 溶液和随后85μl 为端口 b。
5. 将墨盒装入机器并开始校准。

3. 板材制备

注意: 强烈建议两人同时准备板材。每两人准备一个盘子的时间可能需要 ~ 40-60分钟。

1. 用 1 n hcl 将新鲜制备的培养基 + 2.5% 葡萄糖调整到所需的 ph 值, 确保 ph 值不受温度变化的影响。
2. 准备一个冰盒, 并在冰上放置一个金属板。
3. 打开胰岛板 (24 孔板) 包装, 并将网浸入培养皿 (92 毫米 x16 毫米) 中, 用介质浸泡。
4. 收集一个网与插入器 (一个小仪器, 把网牢固地放在井里), 并让插入器站在显微镜旁边。向连接到插入器的网络添加一小滴介质。
5. 通过将苍蝇放在冰冷的金属板上, 对苍蝇 (这里使用了一周或4周大的雄性) 进行了麻醉。
6. 使用钳子, 抓住苍蝇的腹部, 将其浸入显微镜下的培养皿中。
7. 使用第二对钳子, 轻轻地取下苍蝇的头部。将其放置在连接到插入器的网的中间, 并验证头部是否浸入介质中。
8. 当网上有16个人的时候, 把它们的头集中起来。在将多余的液体放入井中时, 在头部居中之前, 请去除多余的液体, 以防止头部丢失。
   注: 在方法建立过程中, 使用了16个飞头, 因为该数字在合理的制版时间内提供了足够和稳定的数据。
9. 使用插入器, 将网放在井中。确保头部被困在网下。慢慢加入700μl 的培养基 + 2.5% 的葡萄糖 (图 1)。对每个井重复这个过程。
   注: 建议每个板20口飞头样品井和4口空井进行背景校准。确保空井还含有一个含有700μl 的缓冲液 + 2.5% 葡萄糖的网。
10. 通过显微镜检查井内的气泡。用1毫升的移液轻轻向上和向下进行移液, 以去除任何气泡。保持头部居中, 以获得可靠的 ocr 读数。
11. 将板材添加到机器中, 然后开始测量。

4. ocr 测量分析

1. 在协议结束时, 取出墨盒。
2. 作为质量检查, 观察端口填充物中任何可见的剩菜。如果头不用于蛋白质提取 (例如, 请参见选项 2),请丢弃墨盒和板 (选项 1)。
3. 提取电子表格文件, 并检查每口井的氧气和 ph 值。确保背景井没有 ocr, 氧气水平稳定。
   1. 使用数据分析算法, 其中一些可以在相应的软件中选择。如果在整个测量过程中, 在第一个刻度和最后一个刻度之间的氧水平范围 (= 子测量) 与最后一个刻度的氧水平不低于 95 ((在这个氧的水平上, 头部的 ocr 明显较低), (图 2)。
   2. 某些条件会导致样品产生快速 ocr, 并可能在^第1个滴答声和/或最后一个滴答声 (缺氧) 中显示较低的氧气水平 (图 3a)。在这种情况下, 请使用备用测量方法 (如 fixed 算法)。在缺氧中, 由于溶液中的氧气含量较低, ocr 大大降低。因此, akos 算法产生误导性读数。
      注意: 较新的计算机缺少固定算法。因此, 最好提取总氧水平, 并为前3-5 刻度每次绘制速率 (图 3)。

5. (备选方案 2) 头部段的生化分析

1. 测量头部段的生化 (代谢物、蛋白质组等) 特性, 根据要求调整运行时间;但是, 可以随时中止协议并删除该板块。
2. 一旦板被移除, 使用非锐化的钳子在网中打一个洞, 并将其取出, 从而释放头部漂浮。
3. 使用带有切割尖端的1毫升移液器, 并将头转移到小瓶上。
4. 快速丢弃缓冲液, 并将头冻结在液氮中。将磁头存放在-80°c, 以便将来进行分析。

结果

记录高质量 ocr 测量的能力取决于将头部集中在网中 (图 1)。这对于 xf24 机器来说很重要, 与较新的 xfe24 机器相比, 它的氧传感器点相当小, 而新的 xfe24 机器的传感器较大。如前所示, 在幼蝇13中, 居中显示稳定的 ocr^,至少连续测量20次。

使用机器的一个关键方面是应用正确的分析。建议在实验过程中检查氧气水平。每2分钟的测量被细分为10个子测量 (刻度)。有16个健康头的井通常在第一个滴答声中显示 140-170 (_mmhg) 的氧分压 (po 2)。在第一个示例中, 我们比较了年轻的苍蝇头和中年的飞头 (图 2 a 和2A)。虽然中年头的氧气含量下降得更快, 但观察到的差异很小 (图 2a)。此外, 氧气水平的范围在条件之间是相似的, 其中165在第一个滴答声中达到120在最后一个滴答声。在这种情况下, 最好使用 akos 算法自动生成 ocr (pmol/min)², 它可靠地反映了年轻和中年头之间的氧水平下降 (图 2b)。值得注意的是, 机器的分析程序会自动选择 akos 算法。

但是, 根据我们的观察, 自动使用 akos 算法可能会产生误导, 如果不是相反的结果正确的 ocr。这些人工制品可以在高度消耗的样品达到缺氧^13,22的条件下产生。例如, 添加丁酸钠 (sb), kdac 抑制剂, 瞬时改变氧水平的动态 (图 3 a)。虽然车辆控制在第一个和最后一个滴答声中显示稳定的氧气水平, 但 sb 的添加会导致这些滴答声中的氧气水平出现相当大的瞬态下降 (图 3 a)。sb 本身并不改变背景井中的氧气水平, 在背景井中不添加头部 (未显示数据)。这些数据支持了 sb 增加氧气消耗的观点。由于第一个刻度线的收集被延迟 (在测量阶段记录第一个刻度线之前的 12秒), 在 sb 处理的井中, 第一个数据点已经较低。因此, 在添加这种 hdac 抑制剂后, 很难捕捉到氧气消耗的早期变化。此外, 如最后一个滴答声的收集所示, sb 处理样品中的氧气水平降低到已经很低的水平 (缺氧)。在缺氧时, 头部在最后一个滴答声中减缓了耗氧量 (图 3a)。由于 akos 计算考虑到所有滴答声并忽略缺氧状态, 因此会产生误导性 ocr。实际上, 基于非规范化 akos 的 ocr 水平在端口 a (veh/sb) 的注入 (虚线) 上几乎没有变化 (图 3b)。

将 ocr 水平归化为基于 akos 的注射前测量, 可在注入端口 a 之前和之后显示出非常相似的 ocr 水平, 这不支持氧气水平的变化 (图 3 a)。在这种情况下, 建议使用这样的 fixed 算法, 该算法更类似于 ocr 和氧气水平的变化 (图 3c)。因此, 基于 fixed 算法的归一化测量揭示了在 sb 处理时 ocr 的增加 (图 3c)。

新机器的一个缺点是缺少 fixed 算法。因此, 在使用高消耗样品处理的实验中, 建议手动计算 ocr 测量值, 并计算每次测量的前3-5 个刻度每次氧气水平的下降。

图 1.一个例子, 一个井里面有16个一周大的雄性苍蝇头.磁头位于网下, 漂浮在媒体中。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2.ocr 测量比较一周大的飞头 (年轻) 和四周大的飞头 (中年) 的一个代表性示例.(a) 三个单独的测量显示氧气水平;每2分钟的测量被细分为十个子测量 (刻度)。(b) (a) 的量化。第一个和最后一个价格的水平是相似的, 虽然中年样本的水平略低。对氧水平下降的斜率进行量化, 用于生成 ocr 水平。如前^所述, 中年苍蝇的 ocr 比幼蝇高 10%-15%。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3.以丁酸钠 (sb) 改变 ocr 为例, 说明了它们在幼飞头中的变化.(a) 在增加 15 mm sb 后, 从七项测量中记录的氧气含量。虚线标志着从 a 港注入了药物 (或车辆)。值得注意的是, 虽然对照组 (蓝色) 的滴答声1和10的氧水平保持稳定, 但在 sb 处理的样品 (橙色) 中, 这些滴答声中的氧水平是瞬时的 (注射后的6次测量)。此外, 在 sb 处理的样品的最后一个滴答声中, 氧气水平的下降也大大降低。nct 3 每个组 (b) [左] 非归一化 ocr 水平计算从 akos 算法。计算不正确地显示了类似水平的 ocr 之前和之后的端口 a. [右] ocr 的归一化之前的测量之前注入端口 a. (c) [左] "固定" 算法计算 (a) 显示非归一化 ocr.在这里, ocr 密切代表了 sb 治疗时头部氧气使用量的瞬态增加;[右]ocr 对注入端口 a. error 柱之前的测量的归一化表示所有图形中的 s. e. m.。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

我们的新技术提供了一种新的方法来研究代谢变化的老化和疾病的背景下, 整个飞头段22。该方法也适用于研究 kdac 丁酸钠对耗氧量的影响。正如我们所证明的, 赖氨酸去乙酰化酶抑制剂 (hdacs/kdac) 会导致 ocr 的变化。从本质上讲, 由于这类抑制剂的靶点通常不局域在线粒体中 (这些抑制剂不会影响 iii 类去乙酰化酶, sirtuins)²⁴, 这类药物只能在至少组织水平上进行检测。事实上, 各种药物直接注射到大脑, 从而绕过可能的过程修改/由消化系统失活。因此, 我们的技术为这些药物如何直接影响头部部分提供了新的洞察。

有几个关键步骤。首先, 正如协议中所说, 我们强烈建议在一小时内准备一个盘子, 两双手准备盘子。根据我们的经验, 及时准备 ocr 测量的质量和稳定性会更好。当使用时间过长时, 低 ocr 消耗井的发生率不断增加, 稳定 ocr 的持续时间也较短。其次, 重要的是要进行质量检查, 并确保不同样品之间的实验条件相似 (ph 值、氧气水平)。最后, 关键的一步是选择正确的算法来分析样本。正如我们所证明的, 默认的 akos 算法在以高速度消耗氧气的样本中产生了误导, 有时甚至是相反的计算。因此, 我们强调检查原始数据的氧气水平和比较由此产生的 ocr 的重要性。

目前, 此技术有几个限制。在室温下, 机器加热温度高达 31°c (这是机器在室温下的最小测量温度), 这可能代表飞头25的应力状态^.然而, 这可以通过将机器放在一个寒冷的房间来克服, 这将使测量在 25°c, 因此没有可能的热压力飞头。最近的报告表明, 将机器放置在 11°c, 从而能够在 25°c^{21 记录}苍蝇的 ocr。然而, 飞头分离应在室温下进行。此外, 温度波动使控制 ph 值变化具有挑战性, 因此强烈建议使用类似的实验装置来测试生理条件/药物对 ocr 的影响。此外, 非线粒体无关机制对耗氧量的贡献尚未确定 26.通过使用各种有效的呼吸抑制剂在飞头, 将有可能建立这样的非线粒体耗氧率。

值得注意的是, 各种哺乳动物疾病的特点是能量代谢的改变。其中包括以代谢减少为特征的疾病, 如阿尔茨海默氏症或代谢重新布线, 如癌症。有趣的是, kdac 抑制剂既用于阿尔茨海默氏症, 也用于癌症治疗27。虽然 kdac 抑制剂实现治疗方面的确切机制仍不清楚, 但我们技术的数据支持了这样的抑制剂可能调节新陈代谢的新概念。

总之, 该方法对于测量体内总耗氧率具有重要价值, 更准确地显示药物对一般代谢的影响, 这在孤立的线粒体协议^{12 中}可能被忽略。例如, 从这种方法而不是以前的技术中获得的结果, 涉及到对 kdac 治疗中年龄相关的代谢不灵活的新见解。虽然需要做更多的工作来优化飞头的实验条件, 但我们的技术和适当的分析结合起来, 可能会进一步阐明整个活组织中的线粒体活性。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich	G8644	D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium	Agilent	103575-100	Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate	Merck	817500	Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer	Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit	Agilent	100850-001	Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates	Agilent	101122-100	Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool	Agilent	101135-10	Insertor
Petri dish	Sarstedt	821,472	Petri dish 92 x 16 mm