Medición e interpretación de las tasas de consumo de oxígeno en su totalidad operan segmentos de cabeza

Resumen

Alteraciones en la tasa metabólica es central para entender la progresión de varias enfermedades y envejecimiento. Aquí, presentamos una nueva técnica para medir el consumo de oxígeno toda cabeza que más estrechamente se asemeja el estado fisiológico y puede ayudar a revelar nuevos fármacos que modifican la actividad mitocondrial.

Resumen

Regulada actividad metabólica es esencial para el funcionamiento normal de las células vivas. De hecho, actividad metabólica alterada causal está relacionada con la progresión de cáncer, diabetes, neurodegeneración y envejecimiento para nombrar unos pocos. Por ejemplo, cambios en la actividad mitocondrial, potencia metabólica de la célula, se han caracterizado en este tipo de enfermedades. En general, las tasas de consumo de oxígeno de las mitocondrias eran consideradas una lectura fiable de la actividad mitocondrial y medidas en algunos de estos estudios se basan en células o mitocondrias aisladas. Sin embargo, tales condiciones no pueden representar la complejidad de un tejido entero. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso método que permite la medición de las tasas de consumo de oxígeno de cabezas de mosca completamente aisladas. Mediante la utilización de este método, hemos registrado tasas más bajas de consumo de oxígeno del segmento todo cabeza en jóvenes versus de moscas. En segundo lugar, hemos descubierto que los inhibidores de la deacetilasa lisina alteran rápidamente el consumo de oxígeno en toda la cabeza. Nuestra novedosa técnica por lo tanto puede ayudar a descubrir nuevas propiedades de diversos fármacos, que pueden afectar la tasa metabólica. Además, nuestro método puede dar una mejor comprensión del comportamiento metabólico en un montaje experimental que se parece más a Estados fisiológicos.

Introducción

Regulada actividad metabólica es esencial para la supervivencia de las células y la función saludable del tejido. Actividad metabólica desregulado ha demostrado ampliamente ligado a la aparición y progresión de varias enfermedades¹. Por ejemplo, menor actividad metabólica fue descrita anteriormente en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el deterioro de memoria asociado a la edad^2,3. Además, la disfunción mitocondrial se cree que es causalmente implicados en el proceso de envejecimiento^4,5. Por otra parte, tasas metabólicas y mitocondriales fueron descritas en cáncer células⁶, donde el uso de inhibidores mitocondriales reducido tumorigenesis⁷.

Una lectura de la actividad metabólica es la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las mitocondrias. Curiosamente, este tipo de lectura se obtiene principalmente de las mitocondrias aisladas o las células, así la mayoría de lo que se describe en la literatura se basa en una lectura que no se asemeja el estado fisiológico. Sin embargo, hay varios inconvenientes a esta técnica. En primer lugar, el protocolo de aislamiento mitocondrial puede dañar potencialmente su integridad⁸, que puede ser un artefacto relevante cuando se comparan las mitocondrias aisladas de joven versus más viejos tejidos⁹. Además, el proceso de aislamiento es largo y puede resultar en pérdida de modificaciones postraduccionales de las proteínas que regulan la función mitocondrial^9,10,11. Por otra parte, se ha demostrado que las mitocondrias aisladas no representan constantemente todo tejido tasa metabólica^12,13. Tal complejidad biológica celular puede considerarse como, 'el todo es mayor que la suma de sus partes', es decir, de las mitocondrias pueden mostrar diferentes tasas metabólicas dentro de una célula compleja en comparación con su tasa metabólica cuando están aisladas.

Mientras que las células pueden ofrecer una mejor lectura de OCR que las mitocondrias aisladas, comunicación de célula a célula en el contexto de un tejido todo puede perderse. Por ejemplo, en el cerebro, la actividad metabólica de las neuronas es altamente dependiente en la actividad metabólica de las células gliales vecinas¹⁴. Como tal, establecer nuevas técnicas para investigar OCR en todo tejido u organismos enteros puede resultar más perspicaz para la aparición y progresión de varias enfermedades.

Recientemente, han surgido nuevas técnicas para abordar estos temas y permitir la medición de OCR de todo tejido, segmento u organismos vivos. Por ejemplo, un trabajo reciente informó la medida de oxígeno de un músculo de vuelo de escarabajo usando un acercamiento de fibra permeabilized con un respirómetro¹⁵. Nuevas máquinas para micro-respirometría permiten la medición de OCR de islotes pancreáticos^16,17. En consecuencia, se ha reportado que esta tecnología permite la medición de OCR de todo gusanos¹⁸ y¹⁹de pez cebra. Sin embargo, la presencia de la barrera digestiva puede plantear un desafío para probar diferentes medicamentos en el contexto de alteraciones de OCR. Curiosamente, los informes recientes por Neville y sus colegas han demostrado una nueva técnica para medir el cerebro de la larva de drosophila solo con la placa bien^20,21.

En este estudio, hemos utilizado una instalación similar que permita la medición de todo OCR de vida entera y no móviles Drosophila²². Esta técnica también ofrece una ventaja secundaria en medir el impacto de distintas drogas en la actividad metabólica en un segmento entero, sin tener que pasar por el sistema digestivo barrera^13,22. Por ejemplo, fue demostrado previamente que inyección directa de inhibidor de la deacetilasa de lisina (KDACi), una droga cree para alterar el mecanismo epigenético en el cerebro, dio lugar a una formación mejor memorias del²³. No obstante, utilizando nuestra nueva técnica, hemos descubierto que la inhibición de la KDAC dio lugar a un rápido incremento de OCR, que puede ser un factor que contribuye por sí misma en la actividad neuronal. Nuestro protocolo proporciona un método simple y novedoso para evaluar el impacto de distintas drogas, manipulación genética o Estados fisiológicos (enfermedades, envejecimiento) en OCR en el contexto de una cabeza entera.

Protocolo

1. instrumento preparación

Nota: Para este experimento, hemos utilizado un dispositivo de Caballito de mar XF24 con placas"islote". La operación de la técnica utiliza diferentes ciclos de mezcla, espera y mediciones, así como la posibilidad para agregar sustancias para el compartimento de medición.

1. Encender la máquina bien antes del inicio del experimento para que haya tiempo suficiente para alcanzar la temperatura deseada y permanecer estable.
2. En la configuración del software (modo de administración), elegir la longitud de la calibración de cartucho (aquí, 20 min fue elegido) y la temperatura deseada.
   Nota: Mientras que las mitocondrias o medidas de tejidos de mamíferos típicamente llevan a cabo a 37 ° C, mosca cabeza temperatura es 25 ° C pero se publican los resultados de las mediciones a 31 ° C. Se utilizaron 31 ° C ya que es la temperatura más baja para el dispositivo a temperatura ambiente. Para llegar a temperaturas de 25 ° C o inferior, coloque la máquina en un cuarto frío o a 11 ° C recientemente publicado²¹.
3. En el software, utilice el siguiente protocolo: 3 minutos de mezcla, espera 2 minutos – 2 minutos medir. Dependiendo del diseño experimental, agregar pasos de inyección de puertos A D después de un paso de medición elegido.
   1. Para control de calidad y determinación de OCR basal, espere al menos tres ciclos de medición antes de inyectar la droga primera via a puerto. Para una cronología detallada del Protocolo, consulte referencia Becker et al. ¹³ .

2. preparación del cartucho

1. Calibrar previamente el cartucho de un día o por lo menos 4 h antes a prueba. Añadir 1,0 mL de Calibrant (pH 7,4) a cada pocillo y colocar el cartucho de sensor en la parte superior la placa y tienda a 37 ° C sin CO₂ durante la noche o hasta para 72 h. evitar la evaporación del cartucho con parafilm si está siendo hidratada por más de 24 h.
2. Asegúrese de que los fármacos experimentales se disuelven bien en el medio (medio fresco + glucosa 2,5%) antes del inicio del experimento.
3. Medir y ajustar el pH de la solución de la droga para el pH del vehículo a la temperatura deseada para evitar cualquier diferencia de pH durante la inyección de drogas.
4. Pipetear la solución farmacológica a su puerto de inyección asignado. Por ejemplo, utilizar 77 μL para el puerto A para lograr un 1:10 dilución en una solución de 770 μL y posteriormente 85 μL para el puerto B.
5. Ponga el cartucho en la máquina y comenzar la calibración.

3. preparación de las placas

Nota: Se recomienda que dos personas preparan simultáneamente la placa. La duración de la preparación de una placa por cada dos personas puede requerir ~ 45-60 minutos.

1. Ajustar el recién preparado media + glucosa 2,5% al pH deseado con 1 N HCl. Asegúrese de que el pH no es afectado por cambios de temperatura.
2. Preparar una caja de hielo y colocar una placa de metal sobre el hielo.
3. Abra el paquete de la placa (la placa de 24 pocillos) de islote y sumerja las redes en una placa Petri (92 mm x 16 mm) con los medios de comunicación.
4. Recoger una red con el elemento de inserción (un pequeño instrumento que coloca la red firmemente en el pozo) y tienen el insertador de pie al lado del microscopio. Agregar una pequeña gota de los medios de comunicación a la red conectada al aparato de inserción.
5. Anestesiar las moscas (una semana o semanas 4 machos Cantón antiguo fueron utilizados aquí) colocando las moscas sobre la placa metálica helada.
6. Con unas pinzas, agarra el abdomen de una mosca y sumergirlo en los medios de comunicación en una placa Petri al microscopio.
7. Utilizando un segundo par de pinzas, quite con cuidado la cabeza de la mosca. Coloque en el centro de la red conectada al aparato de inserción y verificar que la cabeza se encuentra inmerso en los medios de comunicación.
8. Centro de la cabeza cuando hay 16 de ellos en la red. Eliminar líquido superfluo antes de centrar la cabeza para evitar la pérdida de cabezas mientras coloca en el pozo.
   Nota: se utilizaron 16 cabezas de mosca como este número dio datos suficientes y estables dentro de un plazo razonable de preparación de las placas durante el establecimiento del método.
9. Usando el elemento de inserción, coloque la red en el pozo. Asegúrese de que las cabezas quedan atrapadas en la red. Lentamente añadir 700 μL de media + 2.5% de glucosa (figura 1). Repita el proceso para cada uno de los pozos.
   Nota: 20 pozos de volar cabeza muestras y se recomienda 4 pozos vacíos para la calibración de fondo por placa. Asegúrese de que vaciar pozos contienen también una red con 700 μL de buffer + glucosa 2,5%.
10. Compruebe los pozos para las burbujas de aire debajo de la redes a través del microscopio. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta de 1 mL para eliminar las posibles burbujas. Mantener la cabeza centrada para un confiable OCR de lectura.
11. Agregar la placa de la máquina y comenzar la medición.

4. Análisis de las mediciones de OCR

1. Al final del Protocolo, extraiga el cartucho.
2. Como una verificación de calidad, observar cualquier restos visibles en los rellenos del puerto. Deseche el cartucho y la placa (opción 1) si las cabezas no son deben ser utilizados para la extracción de la proteína, por ejemplo, (ver opción 2).
3. Extraer los archivos de hoja de cálculo y calidad compruebe cada uno para los niveles de oxígeno y pH. Asegúrese de que los pozos de fondo sin OCR y que los niveles de oxígeno son estables.
   1. Utilizar un algoritmo de análisis de datos, algunos de los cuales pueden ser elegidos en el software respectivo. Uso el algoritmo AKOS para OCR valores² si los niveles de la gama de oxígeno durante la medida de toda, entre la señal primera y la última (= medición sub) son similares entre dos muestras biológicas y los niveles de oxígeno de las garrapatas última no menores que () 95 mmHg) (OCR los jefes es marcadamente inferior a este nivel de oxígeno), (figura 2).
   2. Algunas condiciones hará que la muestra generar un OCR rápido y pueden mostrar bajos niveles de oxígeno durante la 1 garrapata del^st y en la última señal (anoxia) (Figura 3A). En este escenario, utilice un método de medición alternativo como el algoritmo fijo. En anoxia, el OCR se reduce grandemente debido a los bajos niveles de oxígeno en la solución. Así, el algoritmo AKOS produce lecturas engañosas.
      Nota: La máquina más nueva le falta el algoritmo fijo. Por lo tanto, es preferido para extraer los niveles de oxígeno total y parcela la tarifa por hora para los primeros 3-5 garrapatas (figura 3).

5. (opción 2) el análisis bioquímico del segmento cabeza

1. Para medir la bioquímica (metabolitos, proteoma, etc.) propiedades de un segmento de la cabeza, ajustar el tiempo de ejecución para el requisito; sin embargo, es posible anular el protocolo en cualquier momento y retire la placa.
2. Una vez retirada la placa, utilice pinzas afiladas no hacer un agujero en la red y lo elimine tal modo lanzando la cabeza a flote.
3. Utilizando una pipeta de 1 mL con punta de corte y traslado de las cabezas a un frasco.
4. Rápidamente deseche el búfer y rápido-congele las cabezas en nitrógeno líquido. Guarde las cabezas a-80 ° C para futuros análisis.

Resultados

La capacidad para registrar alta calidad medida de OCR se basa en centrar la cabeza en medio de la red (figura 1). Esto es importante para la máquina de XF24, que tiene un sensor de oxígeno pequeño punto en comparación con la nueva máquina de XFe24 en el cual el sensor es más grande. Centrado, como se ha demostrado las cabezas muestran un OCR constante de al menos 20 mediciones consecutivas en moscas jóvenes¹³.

Un aspecto crítico de la utilización de las máquinas es aplicar el análisis correcto. Se recomienda comprobar los niveles de oxígeno durante los experimentos. Cada medición de 2 min se subdivide en 10 sub-mediciones (garrapatas). Un pozo con 16 cabezas sanas generalmente muestra una presión parcial de oxígeno (pO₂) de 140-170 (mmHg) para la primera señal. En el primer ejemplo, comparamos a jóvenes vs edad cabezas de mosca (figura 2A y 2B). Mientras que los niveles de oxígeno caen más rápido en las cabezas de mediana edad, la diferencia observada es pequeña (figura 2A). Por otra parte, la gama de los niveles de oxígeno es similar entre las condiciones, con 165 durante la primera señal a 120 durante el último tick. En tal caso, es preferible utilizar el algoritmo AKOS para generar automáticamente el OCR (pmol/min)², que refleja confiablemente la caída del nivel de oxígeno entre jóvenes versus edad (figura 2B). De nota, el programa de análisis por la máquina automáticamente elige el algoritmo AKOS.

Sin embargo, basado en nuestras observaciones, de forma automática mediante el algoritmo AKOS dé engañosa, si no contrario resultados de OCR correcto. Tales artefactos pueden generarse en las condiciones de una muestra altamente consumidor que llega a la anoxia^13,22. Por ejemplo, la adición de butirato de sodio (SB), un inhibidor de la KDAC, transitoriamente cambia la dinámica de los niveles de oxígeno (Figura 3A). Mientras que los controles del vehículo muestran niveles constantes de oxígeno durante las primeras y la últimas las garrapatas, además de SB provoca una caída considerable y transitoria de los niveles de oxígeno en estas garrapatas (Figura 3A). SB por sí misma no altera los niveles de oxígeno en los pozos de fondo, donde no se emplean cabezales agregan (datos no mostrados). Los datos apoyan la noción que SB aumenta el consumo de oxígeno. Como la colección de la primera señal se retrasa (12 segundos hasta que la primera señal se registra en la fase de medición) el primer punto de datos ya es menor en los pozos SB tratado. Por lo tanto, es difícil de capturar los primeros cambios en el consumo de oxígeno después de la adición de este inhibidor HDAC. Además, los niveles de oxígeno en las muestras de SB tratado se reducen a niveles ya bajos (anoxia) según lo indicado por la colección de los últimos pasos. En anoxia, las cabezas de frenan su consumo de oxígeno en las garrapatas última (Figura 3A). Porque el cálculo AKOS toma en cuenta todas las garrapatas y hace caso omiso de un estado anóxico, genera un OCR engañosa. De hecho, el AKOS no normalizada basa Mostrar niveles de OCR poco cambio en la inyección (línea discontinua) del puerto A (Veh/SB) (figura 3B).

Normalización de los niveles de OCR a la medida de la inyección basada en el AKOS revela niveles muy similares de OCR antes y después de la inyección del puerto A, que no es compatible con los cambios de nivel de oxígeno (Figura 3A). En estas circunstancias, el algoritmo fijo, que más modelos/se parece a los cambios de nivel OCR y oxígeno se recomienda (figura 3). En consecuencia, el algoritmo fijo base normalizada revela medida un OCR creciente sobre el tratamiento de SB (figura 3).

Un inconveniente con la nueva máquina es la ausencia del algoritmo fijo. Por lo tanto, en experimentos donde consumo altamente tratamiento o muestra es utilizado, se recomienda calcular manualmente las medidas de OCR y calcular la disminución de oxígeno nivel por tiempo para los primeros 3-5 garrapatas en cada medición.

Figura 1 . Un ejemplo de un pozo que contiene 16 cabezas una semana de edad de las moscas macho. Las cabezas están centrado debajo de una red y flotantes en los medios de comunicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Un ejemplo representativo de OCR de medición comparación entre cabezas de mosca una semana de edad (jóvenes) y cabezas de mosca cuatro semanas de edad (edad media). (A) el nivel de oxígeno se muestra tres mediciones independientes; cada medición de 2 min se subdivide en diez sub-mediciones (garrapatas). (B) cuantificación de (A). Los niveles de las garrapatas y son similares, aunque los niveles de la edad media muestra son ligeramente inferiores. Una cuantificación de la vertiente de la disminución de los niveles de oxígeno se utiliza para generar los niveles de OCR. Como se describió anteriormente²², el OCR de moscas edad mediados es 10% - 15% superior de moscas jóvenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Un ejemplo de la alteración del OCR de butirato de sodio (SB) en cabezas de mosca joven. (A) niveles de oxígeno registran de siete mediciones después de la adición de 15 mM SB. La línea discontinua marca la inyección de la droga (o vehículo) desde el puerto A. De nota, mientras que los niveles de oxígeno de garrapatas 1 y 10 permanecen estables en el grupo de control (azul), los niveles de oxígeno durante estas garrapatas son transitoriamente (seis mediciones después de la inyección) reducción en las muestras tratada SB (naranja). Además, la disminución de los niveles de oxígeno se reduce durante las garrapatas última de muestras SB tratado. N = 3 por el grupo (B) niveles de OCR no normalizado [izquierda] calculados a partir del algoritmo AKOS. El cálculo incorrectamente muestra niveles similares de OCR antes y después de la inyección de SB por el puerto a. [derecho] normalización de OCR a la medida antes de la inyección del puerto A. C [izquierda] 'Fijo' algoritmo cálculo de (A) mostrando el OCR no normalizada . Aquí, la OCR representa cerca el aumento transitorio en el uso de oxígeno de las cabezas sobre el tratamiento de la SB; [Derecho] Normalización de la OCR a la medida antes de la inyección de Puerto A. Error barras indican la SEM en todos los gráficos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Nuestra nueva técnica ofrece un nuevo enfoque para estudiar los cambios metabólicos en el envejecimiento y la enfermedad en el contexto de toda mosca segmentos cabeza²². El método también puede ser adecuado para estudiar el impacto KDAC de butirato de sodio en el consumo de oxígeno. Como hemos demostrado, inhibidores de la deacetlyase de lisina (HDACs/KDACs) provocar cambios de OCR. Esencialmente, los objetivos de estos inhibidores no se localizan en las mitocondrias (estos inhibidores no afectan la deacetilasas clase III, las sirtuinas)²⁴, estos medicamentos sólo podrían ser probados en un mínimo nivel de tejido. De hecho, varios medicamentos se inyectan directamente al cerebro, evitando así posible transformación/modificación/inactivación por el sistema digestivo. Como tal, nuestra técnica ofrece una visión novedosa cómo tales drogas directamente impacto el segmento cabeza.

Hay varios pasos críticos. En primer lugar, como se indica en el protocolo, le recomendamos preparar una placa de una hora, con dos pares de manos preparando la placa. Desde nuestra experiencia, la calidad y la estabilidad de las mediciones de OCR son mejores si se prepara de una manera oportuna. Cuando se toma demasiado tiempo, la ocurrencia de baja pozos mucho de OCR está aumentando, así como la duración más corta de OCR estable. En segundo lugar, es importante efectuar un control de calidad y asegurar que las condiciones experimentales entre varias muestras son similar (pH, niveles de oxígeno). Finalmente, un paso crítico es elegir el algoritmo correcto para analizar las muestras. Como hemos demostrado, el algoritmo predeterminado AKOS rindió un cálculo engañoso y a veces oposición en muestras que consumen oxígeno a tasas elevadas¹³. Por lo tanto, recalcamos la importancia de la comprobación de los datos en bruto para los niveles de oxígeno y la comparación de la OCR resultante.

Actualmente, existen varias limitaciones con esta técnica. A temperatura ambiente, la máquina calienta hasta 31 ° C (esta es la mínima temperatura de medición, mientras la máquina está a temperatura ambiente), que puede representar un estado de estrés para el volar cabezas²⁵. Esto sin embargo puede ser superado colocando la máquina en un cuarto frío, que le permiten realizar mediciones a 25 ° C y por lo tanto sin una posible insolación a las cabezas de mosca. Informe reciente ha demostrado poner la máquina a 11 ° C, lo que permite la grabación de OCR de moscas a los 25 ° C²¹. Sin embargo, la separación de cabeza mosca debe realizarse a temperatura ambiente. Además, las fluctuaciones de temperatura hacen difícil control cambios en el pH y por lo tanto es muy recomendable para probar el impacto de las condiciones fisiológicas, drogas en OCR mediante montajes experimentales similares. Además, la contribución del consumo de oxígeno por mecanismos no mitocondrial independiente no ha sido todavía establecido²⁶. Mediante el uso de diferentes inhibidores respiratorios que son eficientes para cabezas de mosca, sería posible establecer estas tasas de consumo de oxígeno no mitocondrial.

Cabe destacar que varias enfermedades mamíferos se caracterizan por alteraciones en el metabolismo energético. Entre ellos son enfermedades que se caracterizan por cualquier reducción metabólica como la enfermedad de Alzheimer o metabólicas cableado como el cáncer. Curiosamente, los inhibidores de la KDAC se utilizan para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y cáncer²⁷. Si bien los mecanismos precisos por los que KDAC inhibidores están logrando el aspecto terapéutico siguen siendo confusos, los datos de nuestra técnica apoyan la noción de novela que estos inhibidores pueden modular el metabolismo.

En Resumen, este método es valioso para medir el consumo total de oxígeno precios en vivo y más exactamente muestra efectos de drogas sobre el metabolismo general, que puede ser pasado por alto en mitocondrias aisladas protocolos¹². Por ejemplo, resultados obtenidos con este método, en lugar de las técnicas anteriores, han implicado nuevos insights para inflexibilidad metabólica asociado a la edad sobre el tratamiento de KDAC. Mientras que el trabajo adicional es necesario para optimizar las condiciones experimentales para volar cabezas, la combinación de nuestra técnica y análisis adecuado puede llevar a más aclaración de la actividad mitocondrial en el contexto de los tejidos vivos todo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich	G8644	D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium	Agilent	103575-100	Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate	Merck	817500	Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer	Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit	Agilent	100850-001	Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates	Agilent	101122-100	Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool	Agilent	101135-10	Insertor
Petri dish	Sarstedt	821,472	Petri dish 92 x 16 mm