Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Resumo

Alterações nas taxas metabólicas de medição é fundamental para compreender a progressão de várias doenças e envelhecimento. Aqui, apresentamos uma nova técnica para medir o consumo de oxigênio de toda a cabeça que mais de perto se assemelha o estado fisiológico e pode ajudar a revelar novos medicamentos que modificam a atividade mitocondrial.

Resumo

Regulamentada a atividade metabólica é essencial para o funcionamento normal das células vivas. Na verdade, a atividade metabólica alterada causalmente está ligada com a progressão do câncer, diabetes, neurodegeneração e envelhecimento, para citar alguns. Por exemplo, alterações na atividade mitocondrial, potência metabólica da célula, foram caracterizadas em muitas dessas doenças. Geralmente, as taxas de consumo de oxigênio da mitocôndria foram consideradas uma leitura confiável de atividade mitocondrial e medições em alguns desses estudos foram baseadas em mitocôndrias isoladas ou células. No entanto, tais condições não podem representar a complexidade de um tecido inteiro. Recentemente, temos desenvolvido um novo método que permite a medição dinâmica de taxas de consumo de oxigênio de chefes de voar toda isolada. Utilizando este método, gravamos menores taxas de consumo de oxigênio do segmento toda cabeça em jovens contra envelhecido moscas. Em segundo lugar, descobrimos que os inibidores de lisina deacetilase alteram rapidamente o consumo de oxigênio em toda a cabeça. Nossa nova técnica, portanto, pode ajudar na descobrindo novas propriedades de diversas drogas, que podem afetar o ritmo metabólico. Além disso, nosso método pode dar uma melhor compreensão do comportamento metabólico em uma instalação experimental que se assemelha mais a Estados fisiológicos.

Introdução

Regulamentada a atividade metabólica é essencial para a sobrevivência das células e função saudável de um tecido. Atividade metabólica desregulamentada extensivamente demonstrou estar ligada ao aparecimento e progressão de várias doenças¹. Por exemplo, a baixa atividade metabólica anteriormente foi descrita em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e deficiência de memória associada a idade^2,3. Além disso, a disfunção mitocondrial é acreditada para ser causalmente envolvidos no envelhecimento processo^4,5. Por outro lado, maiores taxas metabólicas e mitocondriais foram descritas no câncer células⁶, onde o uso de inibidores mitocondriais reduzido tumorigênese⁷.

Uma leitura de atividade metabólica é a taxa de consumo de oxigênio (OCR) da mitocôndria. Curiosamente, este tipo de leitura é obtido principalmente mitocôndrias isoladas ou células, assim, a maioria do que é descrito na literatura baseia-se principalmente uma leitura que não se assemelham o estado fisiológico. No entanto, existem várias desvantagens para esta técnica. Em primeiro lugar, o protocolo de isolamento mitocondrial pode potencialmente prejudicar sua integridade⁸, que pode ser um artefato relevante quando se comparam as mitocôndrias isoladas de jovens contra os tecidos mais velhos⁹. Além disso, o processo de isolamento é longo e pode resultar em perda de modificações posttranslational proteína pertinente, que regulam a função mitocondrial^9,10,11. Além disso, verificou-se que mitocôndrias isoladas não representam consistentemente todo tecido taxas metabólicas^12,13. Tal complexidade biológica celular poderia ser vista como, 'o todo é maior que a soma das suas partes', ou seja, as mitocôndrias podem exibir diferentes taxas metabólicas dentro de uma célula complexa, em comparação com sua taxa metabólica quando isolado.

Enquanto as células podem oferecer uma melhor leitura de OCR que mitocôndrias isoladas, célula a célula comunicação no contexto de um tecido inteiro pode ser perdida. Por exemplo, no cérebro, a atividade metabólica dos neurônios é altamente dependente da atividade metabólica dos vizinhos células gliais¹⁴. Como tal, estabelecer novas técnicas para investigar o OCR no tecido inteiro ou todo organismos pode provar mais perspicaz para o início e a progressão de várias doenças.

Recentemente, novas técnicas surgiram para solucionar esses problemas e permitir a medição de OCR de todo tecido, segmento ou organismos vivos. Por exemplo, um trabalho recente relatou a medição de oxigênio de um músculo de voo do besouro, usando uma abordagem de fibra permeabilized com respirometer¹⁵. Novas máquinas para microrespirometria permitem a medição de OCR de ilhotas pancreáticas^16,17. Consequentemente, foi relatado que esta tecnologia permite a medição de OCR de toda vermes¹⁸ e peixe-Zebra¹⁹. No entanto, a presença da barreira digestiva pode representar um desafio para testar várias drogas no contexto de alterações de OCR. Curiosamente, relatórios recentes por Neville e colegas mostraram uma nova técnica para medir o cérebro de larva drosófila único com o prato bem^20,21.

Neste estudo, usamos uma instalação similar para permitir a medição de OCR toda por toda vida e não-móveis da drosófila²². Esta técnica também oferece uma vantagem secundária em medir o impacto das diversas drogas na atividade metabólica em um segmento inteiro, sem ter que atravessar a barreira de sistema digestivo^13,22. Por exemplo, foi previamente demonstrado que injeção direta de inibidor de deacetilase de lisina (KDACi), acreditava que uma droga para alterar o mecanismo epigenético no cérebro, que resultou em uma melhoria memórias formação²³. No entanto, usando a nossa nova técnica, descobrimos que a inibição KDAC resultou em um aumento rápido de OCR, que pode ser um fator contribuinte por si só na atividade neuronal. Nosso protocolo fornece um método simples e inovador para avaliar o impacto de várias drogas, manipulação genética ou Estados fisiológicos (doença, envelhecimento) em OCR no contexto de uma cabeça inteira.

Protocolo

1. instrumento preparação

Nota: Para este experimento, usamos um dispositivo XF24 de cavalo-marinho com "placas de ilhéu". A operação da técnica usa ciclos diferentes de mistura, esperando e medições, bem como a possibilidade de adicionar substâncias para o compartimento de medição.

1. Liga a máquina bem antes do início do experimento, para que haja tempo suficiente para chegar à temperatura desejada e permanecem estáveis.
2. Na configuração do software (modo de administração), escolher o comprimento da calibração de cartucho (aqui, 20 min foi escolhido) e a temperatura desejada.
   Nota: Enquanto mitocôndrias ou medições de tecidos de mamíferos são normalmente transportadas para fora a 37 ° C, , mosca cabeça temperatura ambiente é 25 ° C mas são publicados os resultados das medições a 31 ° C. Usamos o 31 ° C, pois esta é a configuração de temperatura mais baixa para o dispositivo à temperatura ambiente. Para alcançar temperaturas de 25 ° C ou inferior, coloque a máquina em um quarto mais frio ou no 11 ° C, como recentemente publicado²¹.
3. No software, use o seguinte protocolo: 3 min – espera 2 min – 2 min medição de mistura. Dependendo do design experimental, adicione as etapas de injeção de portos A-D após uma etapa de medição escolhido.
   1. Para verificação da qualidade e determinação de OCR basal, espere pelo menos três ciclos de medição antes de injetar a primeira droga através do porto. Para um cronograma detalhado do protocolo, por favor consulte referência Becker et al . ¹³ .

2. cartucho preparação

1. Pre-calibre o cartucho de um dia (ou pelo menos 4 h) antes de testar. Adicionar 1,0 mL de Calibrant (pH 7,4) a cada poço e coloque o cartucho de sensor na parte superior da placa e a loja a 37 ° C sem CO₂ para a noite ou até de 72 h. prevenir a evaporação de cartucho com parafilm se ele está sendo hidratado por mais de 24 h.
2. Certifique-se de que as drogas experimentais são bem dissolvidas no meio (meio fresco + 2,5% de glicose) antes do início do experimento.
3. Medir e ajustar o pH da solução de droga ao pH do veículo na temperatura desejada para evitar qualquer diferença de pH durante a injeção de drogas.
4. A solução de drogas para o seu porto de injeção alocado de pipeta. Por exemplo, use o 77 μL para porta A conseguir um 01:10 diluição em uma solução de 770 μL e posteriormente 85 μL para porta B.
5. Carregar o cartucho na máquina e começar a calibração.

3. placa preparação

Nota: É altamente recomendável que duas pessoas preparem o prato simultaneamente. A duração da preparação de um prato por duas pessoas pode exigir ~ 45-60 minutos.

1. Ajustar o preparadas media + 2,5% de glicose para o pH desejado com 1 N HCl. Certifique-se que o pH não é afetado por mudanças na temperatura.
2. Preparar uma caixa de gelo e coloque uma placa de metal sobre o gelo.
3. Abra o pacote de placa (a placa de 24 poços) ilhéu e mergulhe as redes em uma placa de Petri (92 x 16 mm) com a mídia.
4. Recolher um líquido com o dispositivo de inserção (um pequeno instrumento que coloca na net firmemente no poço) e ter o Insertor de pé ao lado do microscópio. Adicione uma pequena gota de mídia para net anexada para o dispositivo de inserção.
5. Anestesia as moscas (uma semana ou 4 semanas de idade machos Cantão foram usados aqui), colocando as moscas na placa de metal gelada.
6. Usando a pinça, pegue o abdômen de uma mosca e mergulhá-lo na mídia em um prato de Petri sob o microscópio.
7. Usando um segundo par de pinças, retire com cuidado a cabeça de uma mosca. Coloque-o no meio de rede anexada para o dispositivo de inserção e verificar que a cabeça está imerso na mídia.
8. Centro as cabeças quando há 16 na net. Remova o fluido supérfluo antes de centrar as cabeças para evitar a perda de cabeças, colocando-os no poço.
   Nota: 16 cabeças moscas foram usadas como este número deu suficientes e estáveis de dados dentro de um prazo razoável de preparação da placa durante o estabelecimento do método.
9. Usando o dispositivo de inserção, coloque o líquido no poço. Certifique-se de que as cabeças são presos sob a rede. Lentamente adicione 700 μL de mídia + 2,5% de glicose (Figura 1). Repita o processo para cada um dos poços.
   Nota: 20 poços de voam de cabeça amostras e recomenda-se 4 poços vazios para calibração de fundo por placa. Certifique-se que os poços vazios também contêm uma rede com 700 μL do tampão + 2,5% de glicose.
10. Verifique os poços para as bolhas de ar sob as redes através do microscópio. Pipeta suavemente, subir e descer usando uma pipeta de 1 mL para remover quaisquer bolhas. Manter a cabeça centrada para uma confiável OCR leitura.
11. Adicione a placa para a máquina e iniciar a medição.

4. análise das medições OCR

1. No final do protocolo, remova o cartucho.
2. Como uma verificação de qualidade, observe algumas sobras visíveis em recheios o porto. Descartar o cartucho e placa (opção 1) se as cabeças não devem ser utilizados para a extração de proteínas, por exemplo, (consulte a opção 2).
3. Extrair os arquivos de planilha e verificação da qualidade cada um bem para os níveis de oxigênio e pH. Certifique-se que os poços de fundo não mostram nenhum OCR e que os níveis de oxigénio são estáveis.
   1. Use um algoritmo para análise de dados, alguns dos quais podem ser escolhidos no respectivo software. Uso o algoritmo AKOS para OCR valores² se o intervalo de oxigênio níveis durante a medição inteira, entre o primeiro e o último carrapato (= sub medição) são semelhantes entre duas amostras biológicas e os níveis de oxigênio dos últimos tiques não inferiores a 95 ( mmHg) (OCR das cabeças é marcadamente inferior a este nível de oxigênio), (Figura 2).
   2. Algumas condições fará com que a amostra gerar um OCR rápida e podem apresentar níveis mais baixos de oxigênio durante o 1 carrapato de^st e/ou o último instante (anóxia) (Figura 3A). Em tal cenário, use um método alternativo de medição tais como o algoritmo fixo. Em anóxia, o OCR é muito reduzido devido aos baixos níveis de oxigênio na solução. Como tal, o algoritmo AKOS produz leituras enganosas.
      Nota: A máquina mais recente carece o algoritmo fixo. Portanto, é preferido para extrair os níveis de oxigênio total e plotar a taxa por hora para o primeiro carrapatos de 3-5 (Figura 3).

5. (opção 2) análise bioquímica do segmento de cabeça

1. Para medir a bioquímica (metabolitos, proteoma, etc) Propriedades de um segmento da cabeça, ajustar o tempo de execução para a exigência; no entanto, é possível anular o protocolo a qualquer momento e retire a placa.
2. Uma vez que a placa é removida, use fórceps não-afiadas para fazer um buraco na net e removê-lo desse modo liberando as cabeças para flutuar.
3. Usando uma pipeta de 1 mL com um corte de ponta e transferir as cabeças para um frasco.
4. Rapidamente descartar o buffer e snap-congelar as cabeças em nitrogênio líquido. Armazene as cabeças a-80 ° C para análise futura.

Resultados

A capacidade de gravar alta qualidade medição OCR baseia-se na centralização da cabeça no meio da rede (Figura 1). Isto é importante para a máquina de XF24, que tem um sensor de oxigênio bastante pequeno local em comparação com a mais recente máquina de XFe24 em que o sensor é maior. Como já mostrado, centrando as cabeças exibem um OCR constante pelo menos 20 medições consecutivas em moscas jovens¹³.

Um aspecto crítico do uso das máquinas é aplicar a análise correta. Recomenda-se verificar os níveis de oxigênio durante os experimentos. Cada medição 2 min é subdividida em 10 medidas sub (carrapatos). Um poço com 16 cabeças saudáveis geralmente exibe uma pressão parcial de oxigênio (pO₂) de 140-170 (mmHg) para o primeiro carrapato. No primeiro exemplo, comparamos os jovens vs cabeças moscas da meia-idade (Figura 2A e 2B). Enquanto os níveis de oxigênio cair mais rápido na cabeça de meia-idade, a diferença observada é pequena (Figura 2A). Além disso, o alcance dos níveis de oxigênio é semelhante entre as condições, com 165 durante o primeiro carrapato para 120 durante o último carrapato. Nesse caso, é preferível usar o algoritmo AKOS para gerar automaticamente o OCR (pmol/min)², que confiantemente espelha a queda de nível de oxigênio entre jovens contra chefes da meia-idade (Figura 2B). Digno de nota, o programa de análise pela máquina automaticamente escolhe o algoritmo AKOS.

No entanto, com base em nossas observações, automaticamente, usando o algoritmo AKOS pode dar enganosa, se não oposto resulta para o OCR correto. Tais artefatos podem ser gerados em condições de uma amostra altamente consumindo que chega a anóxia^13,22. Por exemplo, a adição de butirato de sódio (SB), um inibidor KDAC, transitoriamente muda a dinâmica dos níveis de oxigênio (Figura 3A). Considerando que os controles do veículo exibem níveis estáveis de oxigênio durante os primeiros e o últimos carrapatos, adição de SB provoca uma queda considerável e transitória dos níveis de oxigênio nesses carrapatos (Figura 3A). SB por si só não altera os níveis de oxigênio em poços de fundo, onde não há cabeças são adicionadas (dados não mostrados). Os dados suporta a noção que o SB aumenta o consumo de oxigênio. Como a coleção de primeira escala é adiada (12 segundos até que a primeira escala é gravada na fase de medição) o primeiro ponto de dados já está menor em poços de SB Tratado. Portanto, é difícil capturar as alterações iniciais no consumo de oxigênio após a adição deste inibidor HDAC. Além disso, os níveis de oxigênio nas amostras SB Tratado são reduzidos ao já baixa (anóxia) conforme indicado pela coleção de tiques ontem. A anóxia, as cabeças de abrandar seu consumo de oxigênio nos últimos carrapatos (Figura 3A). Porque o cálculo AKOS leva em conta todos os carrapatos e ignora um estado anóxico, ele gera um OCR enganosa. Com efeito, o AKOS normalizado baseado mostrar níveis de OCR pequena mudança da injeção (linha tracejada) de Porto um (Veh/SB) (Figura 3B).

Normalizar os níveis de OCR para a medição de pre-injeção baseada a AKOS revela níveis muito semelhantes de OCR antes e após a injeção do Porto A, que não suporta as mudanças de nível de oxigênio (Figura 3A). Nestas circunstâncias, o algoritmo fixo, o que mais modelos/assemelha-se as alterações de nível de OCR e oxigênio é recomendado (Figura 3). Consequentemente, o algoritmo fixo com base normalizada revela medição um OCR aumento prévio tratamento SB (Figura 3).

Uma desvantagem com a nova máquina é a ausência do algoritmo fixo. Portanto, em experimentos onde altamente consumir amostra/tratamento é usado, é recomendável para calcular as medidas de OCR manualmente, e calculando a diminuição de oxigênio nível por vez para o primeiro carrapatos de 3-5 em cada medição.

Figura 1 . Um exemplo de um poço contendo 16 cabeças uma semana de idade de moscas masculinas. As cabeças são centrado abaixo uma rede e flutuante na mídia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Um exemplo representativo de comparação de medição OCR entre cabeças de voar uma semana de idade (jovens) e quatro - semana velhas cabeças de mosca (meia-idade). (A) os níveis de oxigênio são mostrados para três medidas separadas; cada medição 2 min é subdividida em dez medições sub (carrapatos). (B) uma quantificação do (A). Os níveis de primeiros e últimos tiques são semelhantes, embora os níveis da amostra de meia-idade são ligeiramente mais baixos. Uma quantificação da inclinação da diminuição nos níveis de oxigênio é usada para gerar os níveis de OCR. Como descrito anteriormente,²², o OCR de moscas envelhecidos médios é 10-15% mais elevado do que moscas jovens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . Um exemplo da alteração do OCR de butirato de sódio (SB) nas jovens cabeças moscas. (A) oxigênio níveis registrados de sete medidas após a adição de 15 mM SB. A linha tracejada marca a injeção da droga (ou veículo) de Porto. Da nota, enquanto os níveis de oxigénio de pulsos 1 e 10 permanecem estáveis no grupo controle (azul), os níveis de oxigênio durante esses carrapatos são transitoriamente (seis medições após a injeção) reduziram nas amostras tratada de SB (laranja). Além disso, a diminuição dos níveis de oxigénio é reduzida durante os últimos carrapatos de amostras SB Tratado. N = 3 por grupo (B) [esquerda] Non-normalizado OCR níveis calculados a partir do algoritmo AKOS. O cálculo mostra incorretamente níveis semelhantes de OCR antes e após a injeção do SB pelo porto a. [direita] normalização dos OCR para a medição antes da injeção do porto A. C [Left] cálculo algoritmo 'Fixo' do (A) mostrando o OCR normalizado . Aqui, o OCR estreitamente representa o aumento transiente no uso de oxigênio das cabeças de tratamento de SB; [Direita] Normalização dos OCR para a medição antes da injeção de Porto r. erro barras indicam no MEV mostrou em todos os gráficos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nossa nova técnica oferece uma nova abordagem para estudar alterações metabólicas no envelhecimento e doença no contexto de toda mosca segmentos cabeça²². O método também pode ser adequado para estudar o impacto do butirato de sódio KDAC sobre o consumo de oxigênio. Como temos demonstrado, inibidores de deacetlyase de lisina (HDACs/KDACs) resultam em alterações de OCR. Essencialmente, como alvos de tais inibidores normalmente não são localizados na mitocôndria (estes inibidores não impactam a deacetilases de classe III, o Sirtuins)²⁴, tais drogas apenas poderiam ser testadas em pelo menos nível de tecido. De fato, várias drogas são injetadas diretamente para o cérebro, ignorando assim possível processamento/modificação/inactivação pelo sistema digestivo. Como tal, nossa técnica oferece novos insights sobre como tais drogas diretamente impacto o segmento da cabeça.

Existem várias etapas críticas. Primeiro, tal como consta do protocolo, é altamente recomendável preparar um prato menos de uma hora, com dois pares de mãos preparando o prato. De nossa experiência, a qualidade e a estabilidade das medições OCR são melhores quando preparados em tempo hábil. Quando se toma muito tempo, a ocorrência de poços de consumo baixos OCR está a aumentar, além de mais curta duração de OCR estável. Em segundo lugar, é importante realizar uma verificação de qualidade e garantir que as condições experimentais entre várias amostras são semelhante (pH, os níveis de oxigênio). Finalmente, um passo fundamental é escolher o algoritmo correto para analisar as amostras. Como temos demonstrado, o algoritmo padrão de AKOS rendeu um cálculo enganoso e por vezes oposto em amostras que consumiu o oxigênio em altas taxas de¹³. Portanto, salientamos a importância de verificar os dados brutos para os níveis de oxigénio e comparar o OCR resultante.

Atualmente, existem várias limitações com esta técnica. À temperatura ambiente, a máquina aquece até 31 ° C (esta é a temperatura mínima de medição enquanto a máquina está à temperatura ambiente), que pode representar um estado de estresse para a mosca cabeças²⁵. Isso no entanto pode ser superado, colocando a máquina em uma sala fria, o que permitirá medições a 25 ° C e, portanto, sem um stress de calor possível para as cabeças de voar. Relatório recente demonstrou a colocação da máquina a 11 ° C, possibilitando assim a gravação OCR de moscas em 25 ° C²¹. No entanto, a separação de cabeça voar deve ser realizada à temperatura ambiente. Além disso, as flutuações de temperatura torná-lo difícil de controlar alterações de pH e, portanto, é altamente recomendável para testar o impacto das condições fisiológicas/drogas na OCR usando configurações experimentais semelhantes. Além disso, a contribuição do consumo de oxigênio, por mecanismos não mitocondriais-independente ainda não foi estabelecida,²⁶. Usando vários inibidores respiratórios que são eficientes na cabeça de mosca, seria possível estabelecer tais taxas de consumo de oxigênio não-mitocondrial.

Vale ressaltar que várias doenças de mamíferos são caracterizadas por alterações no metabolismo energético. Entre eles estão doenças que caracterizam-se por qualquer redução metabólica, tais como a doença de Alzheimer ou metabólica religação como o câncer. Curiosamente, os inibidores KDAC são utilizados para tanto a doença de Alzheimer e câncer tratamento²⁷. Enquanto os mecanismos precisos pelos qual KDAC inibidores estão conseguindo o aspecto terapêutico permanecem pouco claras, os dados de nossa técnica oferece suporte a noção de romance que tais inibidores podem modular o metabolismo.

Em resumo, este método é valioso para medição do consumo global de oxigênio taxas na vivo e mais precisão exibe efeitos de drogas sobre o metabolismo geral, que podem ser ignorados em mitocôndrias isoladas de protocolos¹². Por exemplo, resultados obtidos com este método, ao invés de técnicas anteriores, têm implicado novas insights para associada a idade metabólica inflexibilidade tratamento de KDAC. Enquanto trabalho adicional é necessário para otimizar as condições experimentais para voam de cabeças, a combinação de nossa técnica e a análise adequada pode levar a elucidação adicional da atividade mitocondrial no contexto dos tecidos vivos de todo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich	G8644	D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium	Agilent	103575-100	Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate	Merck	817500	Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer	Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit	Agilent	100850-001	Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates	Agilent	101122-100	Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool	Agilent	101135-10	Insertor
Petri dish	Sarstedt	821,472	Petri dish 92 x 16 mm