Измерение и интерпретации показателей потребления кислорода в целом летать головы сегментов

Резюме

Измерение изменений в уровень метаболизма центральное значение для понимания прогрессирования различных заболеваний и старения. Здесь мы представляем Роман технику для измерения потребления всей головы кислорода, что более близко напоминает физиологическое состояние и может помочь в выявлении Роман наркотики, которые изменяют митохондриальной активности.

Аннотация

Регулируемые метаболической активности имеет важное значение для нормального функционирования живых клеток. Действительно изменения метаболической активности каузально связаны с прогрессирования рака, диабета, нейродегенеративные и старения, чтобы назвать несколько. Например изменения в митохондриальной активности, клетки метаболических электростанция, характеризовались во многих таких заболеваний. Как правило показатели потребления кислорода митохондрий считались надежным индикация митохондриальной активности и измерения в некоторых из этих исследований были основаны на изолированных митохондриях или клетки. Однако такие условия не могут представлять сложности всей ткани. Недавно мы разработали Роман метод, который позволяет динамическое измерение показателей потребления кислорода от всей изолированных летать головы. Используя этот метод, мы добились более низкие показатели потребления кислорода всей головы сегмента в молодых против возрасте мух. Во-вторых мы обнаружили, что ингибиторов деацетилаз лизин быстро изменить потребления кислорода по всей голове. Поэтому наш Роман технику может помочь в выявлении новых свойств различных препаратов, которые могут повлиять на уровень метаболизма. Кроме того наш метод может дать лучшее понимание метаболических поведения в экспериментальной установки, которая больше напоминает физиологических состояний.

Введение

Регулируемые метаболической активности имеет важное значение для выживания клеток и здоровой функции ткани. Дерегулирование метаболической активности широко доказано быть связано с наступлением и прогрессирования различных недугов¹. Например, Нижняя метаболическую активность была ранее описана в нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и обесценение возраста ассоциированной памяти^2,3. Кроме того митохондриальной дисфункции считается каузально включиться в процесс старения^4,5. С другой стороны более высокие показатели митохондриального и метаболических были описаны в раковых клеток⁶, где использование ингибиторов митохондриальных уменьшена tumorigenesis⁷.

Одна индикация метаболической активности является уровень потребления кислорода (OCR) митохондрий. Интересно, что этот тип индикации главным образом получены из изолированных митохондриях или клетки, таким образом большинство того, что описано в литературе основывается главным образом на индикации, которые не похожи на физиологическое состояние. Однако есть несколько недостатков в этой технике. Во-первых протокол митохондриальной изоляции может потенциально повредить ее целостность⁸, который может быть соответствующим артефакт, при сравнении митохондрий изолированных от молодых и старых тканей⁹. Кроме того процесс изоляции длинный и может привести к потере соответствующих белков Посттрансляционная модификаций, которые регулируют функции митохондрий^9,10,11. Кроме того было показано, что изолированных митохондриях не представляют последовательно цельной ткани метаболизма^12,13. Такие Сотовые биологических сложности может рассматриваться как, «целое больше, чем сумма его частей», т.е., митохондрий может отображать различные метаболические ставок внутри комплекса ячейки по сравнению с их метаболизма при изоляции.

В то время как клетки может предложить лучше OCR индикация чем изолированных митохондриях, клетки для сотовой связи в контексте всей ткани могут быть потеряны. Например в головном мозге, сильно зависит от метаболической активности соседние глиальные клетки¹⁴метаболической активности нейронов. Таким образом создания новых методов для расследования OCR в цельной ткани или весь организмов может оказаться более глубокий для возникновения и прогрессирования различных расстройств.

Недавно появились новые методы для решения этих вопросов и включения измерения OCR из цельной ткани, сегмента или живых организмов. Например недавняя работа сообщили измерения кислорода от Жук полет мышцы с помощью подхода permeabilized волокно с респирометра¹⁵. Новые машины для микро respirometry позволяют измерения OCR панкреатических островков^16,17. Следовательно сообщалось, что эта технология позволяет измерение OCR весь червей¹⁸ и¹⁹Зебра рыбы. Однако наличие пищеварительной барьера может представлять вызов для тестирования различных наркотиков в контексте изменения OCR. Интересно, что последние доклады Невилл и его коллеги показали новую технику для измерения одного дрозофилы личинка мозга с хорошо плиты^20,21.

В этом исследовании мы использовали аналогичные установки для включения измерения всего OCR от всей жизни и не mobile дрозофилы²². Этот метод также предлагает вторичных преимущество в измерения воздействия различных препаратов на метаболическую активность в целый сегмент, без необходимости проходить через пищеварительный тракт барьер^13,22. Например ранее было показано, что прямое впрыскивание ингибиторов деацетилаз лизина (KDACi), препарат считают, изменить эпигенетический механизм в головном мозге, привели к улучшению воспоминания формирования²³. Однако используя наш Роман технику, мы обнаружили, что ингибирование KDAC привели к быстрый рост OCR, который может быть фактором, способствующим сама по себе в активности нейронов. Наш протокол обеспечивает простой и Роман метод для оценки влияния различных препаратов, генетическая манипуляция или физиологических состояний (болезни, старение) на распознавание в контексте всей головы.

протокол

1. инструмент подготовки

Примечание: Для этого эксперимента, мы использовали устройство конька XF24 плитами «островок». Операция технику использует различные циклы смешивания, ожидания и измерений а также возможность добавления веществ в отсеке для измерения.

1. Включите машину задолго до начала эксперимента, так что есть достаточно времени для достижения желаемой температуры и остаются стабильными.
2. В Настройка программного обеспечения (режим управления), выберите продолжительность калибровки картриджа (здесь, было выбрано 20 мин) и температуру.
   Примечание: Хотя митохондрий или млекопитающих ткани измерения обычно проводятся вне при 37 ° C, летать головы температура составляет 25 ° C, но публикуются результаты измерений на 31 ° C. Мы использовали 31 ° C, так как это самые низкие температуры для устройства при комнатной температуре. Чтобы достичь температуры 25 ° C или ниже, установите машину в холодной комнате или на 11 ° C как недавно опубликованный²¹.
3. В программном обеспечении, используйте следующий протокол: 3 мин, смешивания – 2 мин ожидания – 2 мин измерения. В зависимости от экспериментальный дизайн добавьте шаги инъекции из портов A-D после выбранного измерения шаг.
   1. Для проверки качества и определение базальной OCR ждать по крайней мере три измерения циклов перед инъекцией первый наркотиков через порт а. Подробный график протокола, пожалуйста смотрите ссылки Беккер и др. ¹³ .

2. картридж подготовка

1. Предварительно откалибровать картридж в день (или по крайней мере 4 h) до тестирования. Добавьте 1,0 мл Calibrant (рН 7,4) для каждой скважины и поместите датчик картридж верхней пластины и хранить при 37 ° C без CO₂ на ночь или вверх до 72 ч. предотвращения испарения патрон с парафина если это время гидратированных для более чем 24 часа.
2. Убедитесь, что экспериментальные препараты хорошо растворяются в среде (свежие среднего + 2,5% глюкозы) до начала эксперимента.
3. Измерения и регулировка рН раствора препарата к рН транспортного средства на желаемую температуру, чтобы избежать каких-либо различий рН во время инъекции наркотиков.
4. Накапайте наркотиков решение его выделенный инъекционным портом. Например, используйте 77 мкл для порта A для достижения 1:10 разрежения в 770 мкл раствора и впоследствии 85 мкл для порта B.
5. Загрузка картриджа в машину и начать калибровку.

3. плита подготовка

Примечание: Настоятельно рекомендуется два человека подготовить пластину одновременно. Продолжительность подготовки одной пластины на двух человек может потребовать ~ 45-60 минут.

1. Отрегулируйте свежеприготовленные СМИ + 2,5% глюкозы до желаемого pH с 1 N HCl. Убедитесь что pH не зависит от изменения температуры.
2. Подготовка льда коробки и место металлическую пластину на льду.
3. Открыть пакет пластины (24-ну Латы) островок и погружать сеток в чашке Петри (92 мм x 16 мм) со средствами массовой информации.
4. Собирать один чистый с фрагментов (небольшой инструмент, что места сети твердо в скважине) и вставки встать рядом с микроскопом. Добавьте небольшое падение средств массовой информации в сети, придает вставки.
5. Анестезировать мух (одна неделя или 4 недели, здесь были использованы старые самцы кантона), поместив мух на ледяной металлической пластине.
6. С помощью щипцов, захватить живота мухи и погрузите его в СМИ в чашке Петри под микроскопом.
7. Используя вторую пару щипцов, аккуратно удалите голову летать. Поместите его в середине сети, придает вставки и убедитесь, что голова погружается в средствах массовой информации.
8. Центр головы, когда есть 16 из них в сети. Удаление излишней жидкости перед центрирование головки для предотвращения потери головы при их размещении в колодец.
   Примечание: 16 Лети головок использовались как это число дал достаточных и стабильных данных в разумные сроки подготовки пластины во время создания метода.
9. Использование фрагментов, место сети в колодец. Убедитесь, что руководители оказались в ловушке под сеткой. Медленно добавьте 700 мкл СМИ + 2,5% раствор глюкозы (рис. 1). Повторите этот процесс для каждого из скважин.
   Примечание: 20 скважин летать головой образцов и 4 пустой скважин для калибровки фон каждой пластины рекомендуется. Убедитесь, что пустой Уэллс также содержат сетку с 700 мкл буфера + 2,5% раствор глюкозы.
10. Проверьте скважин для пузырьков воздуха под сетей через Микроскоп. Накапайте мягко вверх и вниз с помощью пипетки 1 мл удалить любые пузыри. Держите по центру для надежного распознавания чтения главы.
11. Добавьте пластину на машину и начать измерение.

4. анализ измерений OCR

1. В конце протокола Удалите картридж.
2. Для проверки качества соблюдайте любые видны остатки в порт начинками. Если главы не должны быть использованы для извлечения белков, например, отказаться от картриджа и плиты (вариант 1) (см. вариант 2).
3. Извлечь файлы электронных таблиц и качества проверить каждый хорошо для кислорода и рН. Убедитесь, что фон скважин показывают не OCR и что уровень кислорода являются стабильными.
   1. Используйте алгоритм для анализа данных, некоторые из которых могут быть выбраны в соответствующее программное обеспечение. Использование AKOS алгоритм для распознавания значений² если спектр кислорода уровнях во время всего измерения, между первым и последним клеща (= вложенные измерения) похожи между двух биологических образцов и уровень кислорода последних тиков не ниже 95) mmHg) (главы OCR заметно ниже этого уровня кислорода), (Рисунок 2).
   2. Некоторые условия приведет к образца для создания быстрого распознавания и может отображать более низкие уровни кислорода во время 1^st клеща или в последнем тике (гипоксия) (рис. 3A). В таком случае используйте метод альтернативного измерения, такие как фиксированной алгоритм. В гипоксия OCR значительно снижается из-за низкого уровня кислорода в решении. Таким образом алгоритм AKOS дает заблуждение чтений.
      Примечание: Новая машина не имеет фиксированной алгоритм. Поэтому желательно для извлечения всего кислорода и участок за время для первых 3-5 тиков (рис. 3).

5. (вариант 2) биохимический анализ сегмента головы

1. Чтобы измерить биохимические (метаболитов, протеома и т.д.) свойства головы сегмента, Отрегулируйте время выполнения требования; Однако это можно прервать в любое время протокол и удалить пластину.
2. После удаления пластину, используйте щипцы-заостренный сделать отверстие в сети и удалить его высвободив головы до плавать.
3. С помощью пипетки 1 мл с разрезом отзыв и передать главы флакон.
4. Быстро сбросить буфер и руководители оснастки замораживание в жидком азоте. Храните головы на-80 ° C для будущего анализа.

Результаты

Возможность записи высокого качества распознавания измерения опирается на центровку голову в середине сети (рис. 1). Это важно для XF24 машины, который имеет довольно небольшой кислорода датчик месте по сравнению с новой XFe24 машины, в котором датчик больше. Как ранее показанного, центрирование головки отображения устойчивый OCR для по крайней мере 20 последовательных измерений в молодых мух¹³.

Одним из важнейших аспектов использование машин необходимо применять правильный анализ. Рекомендуется проверить уровень кислорода во время экспериментов. Каждое измерение 2 мин подразделяется на 10 суб измерений (клещи). Колодец с 16 Здоровые головки обычно отображает парциального давления кислорода (по₂) 140-170 (mmHg) для первого тика. В первом примере мы сравнили молодые против среднего летать головки (рис. 2A и 2B). В то время как уровень кислорода падение быстрее в головах людей среднего возраста, наблюдается разница невелика (рис. 2A). Кроме того диапазон уровней кислорода похож между условиями, с 165 во время первого тика до 120 во время последнего тика. В таком случае желательно использовать алгоритм AKOS для автоматического создания OCR (пмоль/мин)², которая достоверно отражает снижение уровня кислорода между молодыми против среднего головы (Рисунок 2Б). Следует отметить анализ программы на машине автоматически выбирает алгоритм AKOS.

Однако основываясь на наших наблюдений, автоматически с использованием алгоритма AKOS может дать в заблуждение, если не противоположные результаты для правильного распознавания. Такие артефакты могут создаваться в условиях весьма много образца, который достигает аноксии^13,22. Например добавлением натрия бутират (SB), ингибитор KDAC, временно изменяет динамику уровня кислорода (рис. 3A). В то время как транспортное средство контроля отображения устойчивые уровни кислорода во время первого и последнего клещей, SB сложения вызывает значительные и переходных падение уровня кислорода в эти клещи (рис. 3A). SB само по себе не изменяет уровень кислорода в фон скважинах, где нет головы добавляются (данные не показаны). Данные поддерживает понятие, что SB увеличивается потребление кислорода. Как коллекция первый тик задерживается (12 секунд до тех пор, пока первый тик Записанная в измерения фазы) первая точка данных уже ниже в скважинах SB лечение. Таким образом трудно захватить ранние изменения потребления кислорода после добавления этой HDAC ингибиторов. Кроме того уровень кислорода в образцах SB лечение сводится к уже низкого уровня (гипоксия) как указано в коллекции последних тиков. В гипоксия руководители замедлить их потребление кислорода в последних тактах (рис. 3A). Потому что AKOS расчет учитывает все тики и игнорирует аноксии государства, он генерирует заблуждение OCR. Действительно ненормализованные AKOS основе OCR уровнях шоу мало изменений инъекции (пунктирная линия) порт (Вег/SB) (рисунок 3B).

Нормализация уровней OCR для предварительного впрыска измерения, основанные на AKOS показывает очень сходные уровни OCR, до и после инъекции, а порт, который не поддерживает изменения уровня кислорода (рис. 3A). В этих обстоятельствах фиксированная алгоритм, который более тесно модели/напоминает OCR и кислорода изменения уровня рекомендуется (рис. 3 c). Следовательно фиксированная алгоритм, основанный нормированный измерений показывает увеличение оптического распознавания текста после лечения SB (рис. 3 c).

Недостаток с новой машиной является отсутствие фиксированной алгоритма. Таким образом в экспериментах, где используется очень много образца/лечение, рекомендуется для вычисления измерения оптического распознавания текста вручную, и расчета сокращения кислородная уровня за время для первых 3-5 тиков в каждом измерении.

Рисунок 1 . Пример хорошо, содержащий 16 одно - неделя старый головы мужчин мух. Главы по центру ниже чистой и плавающие в средствах массовой информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Представитель пример OCR измерения сравнения между одно - неделя старый летать головы (молодые) и четыре - неделя старый летать головки (средневековье). (A уровни кислорода показаны для трех отдельных измерений; Каждое измерение 2 мин подразделяются на десять суб измерений (клещи). (B) количественную оценку (A). Уровень первый и последний клещи похожи, хотя уровни среднего возраста образца чуть ниже. Количественная оценка склона снижение уровня кислорода используется для создания уровней распознавания. Как ранее описанных²²OCR среднего возраста мухи — 10% - 15% выше, чем молодые мух. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 . Пример изменения OCR, натрия бутират (SB) в головах молодых летать. (A) кислорода записал семь измерений после добавления 15 мм SB. Пунктирная линия знаменует инъекции наркотиков (или транспортного средства) от порта A. Следует отметить, в то время как уровень кислорода клещей, 1 и 10 остаются стабильными в контрольной группе (синий), уровень кислорода во время этих клещей являются временно (шесть измерений после инъекции) уменьшена в образцах SB лечение (оранжевый). Кроме того снижение уровня кислорода значительно снижается в течение последних тиков SB лечение образцов. N = 3 в группу (B) [влево] Non нормированный OCR уровни рассчитываются от AKOS алгоритма. Расчет неправильно показывает аналогичные уровни OCR, до и после введения SB портом A. [право] нормализация OCR для измерения до инъекции порт а. (C) [влево] «Fixed» алгоритм расчета () показаны распознавание ненормализованных . Здесь OCR тесно представляет преходящее повышение использования кислорода руководителей после лечения SB; [Вправо] Нормализация OCR для измерения до введения порта A. Ошибка бары указывают на S.E.M. всех графиках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Наша новая техника предлагает новый подход к изучению метаболические изменения в старения и болезней в контексте всей летать сегментов²². Этот метод может также подходит для изучения влияния KDAC натрия бутират на потребление кислорода. Как мы показали, лизин deacetlyase ингибиторы (ГДА/KDACs) приводят к изменениям OCR. По существу, как цели таких ингибиторов обычно не локализована в митохондриях (эти ингибиторы не влияют комплексы класса III, Sirtuins)²⁴, такие препараты могут только испытываться на по крайней мере тканевом уровне. Действительно различные препараты вводят непосредственно в мозг, таким образом обходя возможные обработки/изменения/инактивации пищеварительной системой. Таким образом наша техника предлагает Роман проницательность в как такие препараты непосредственно влияние головы сегмента.

Есть несколько важных шагов. Во-первых как указано в протоколе, мы настоятельно рекомендуем, подготовке пластины под один час, с две пары рук, подготовке пластину. Из нашего опыта качество и стабильность измерений OCR лучше, когда подготовлен своевременно. Когда принимая слишком длиной, возникновение низкого потребления скважин OCR растет, а также короче продолжительность стабильной OCR. Во-вторых важно провести проверку качества и обеспечить что экспериментальных условий между различными образцами являются аналогичными (рН, уровень кислорода). Наконец важным шагом является выбор правильного алгоритма для анализа образцы. Как мы показали, используемый по умолчанию алгоритм AKOS принесли заблуждение и иногда противоположные вычисления в образцах, которые потребляются кислорода на высокие ставки¹³. Поэтому мы подчеркиваем важность проверки исходных данных для уровней кислорода и сравнивая результате OCR.

В настоящее время существует несколько ограничений с этой техникой. При комнатной температуре, машина нагревается до 31 ° C (это минимальное измерения температуры при работе машины при комнатной температуре), который может представлять состояние стресса для fly главы²⁵. Это, однако, могут быть преодолены, поставив машину в холодной комнате, которая даст возможность измерения при 25 ° C и, следовательно без возможных теплового стресса к лету головы. Недавний доклад продемонстрировал, поставив машину в 11 ° C, таким образом позволяя OCR запись мух на 25 ° C²¹. Тем не менее летать головой разделения должны быть выполнены при комнатной температуре. Кроме того колебания температуры осложняют для контроля рН изменений, и поэтому настоятельно рекомендуется проверить влияние физиологических условиях/наркотиков на OCR с помощью подобных экспериментальных установок. Кроме того вклад потребления кислорода, митохондриальных независимых механизмов еще не установленных²⁶. С помощью различных респираторные ингибиторы, которые являются эффективными в лету головы, было бы возможно установить такие темпы потребления не митохондрий кислородом.

Примечательно, что различные недуги млекопитающих характеризуются изменения в метаболизме энергии. Среди них заболевания, которые характеризуются либо метаболических сокращения, например, болезнь Альцгеймера или метаболических переоснащая например рака. Интересно, что ингибиторы KDAC используются для лечения рака и болезни Альцгеймера²⁷. Хотя точные механизмы, по которой KDAC ингибиторов достижение лечебный аспект остаются неясными, данные из нашей техники поддерживает Роман понятие, что такое ингибиторы могут модулировать метаболизма.

В целом этот метод является ценным для измерения общего потребления кислорода в естественных условиях и более точно отображает эффекты наркотиков на общий обмен веществ, которые могут остаться незамеченными в изолированных митохондриях протоколы¹². Например результаты, полученные из этого метода, вместо предыдущих методов, причастны Роман идеи для возраста связанные метаболических гибкости после KDAC лечения. Хотя дополнительная работа необходима для оптимизации экспериментальных условий для fly головы, сочетание нашей техники и подходящих анализа может привести к дополнительные разъяснения митохондриальной деятельности в контексте всего живых тканей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose	Sigma-Aldrich	G8644	D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium	Agilent	103575-100	Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate	Merck	817500	Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer	Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit	Agilent	100850-001	Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates	Agilent	101122-100	Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool	Agilent	101135-10	Insertor
Petri dish	Sarstedt	821,472	Petri dish 92 x 16 mm