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摘要

啮齿类动物骨骼肌收缩功能的测量是一个有用的工具, 可用于跟踪疾病进展以及治疗干预的效果。我们在这里描述的非侵入性,体内评估的背屈肌, 可以重复随着时间的推移, 在同一只老鼠。

摘要

骨骼肌收缩功能的评估是临床和研究目的的重要测量指标。许多情况会对骨骼肌产生负面影响。这可能会导致肌肉质量的损失 (萎缩) 和/或肌肉质量的损失 (单位肌肉质量的力量减少), 这两种疾病都是普遍存在于慢性病, 肌肉特异性疾病, 固定, 和老化 (石斑)。动物骨骼肌功能可以通过一系列不同的测试来评估。所有测试都有与生理测试环境相关的限制, 特定测试的选择往往取决于实验的性质。在这里, 我们描述了一种在体内,非侵入性的技术, 涉及一个有用的和容易的评估力量频率曲线 (ffc) 的小鼠, 可以执行相同的动物随着时间的推移。这允许监测疾病进展和/或潜在的治疗效果。

引言

骨骼肌是一种重要的代谢组织, 约占体重总量的40%。它在控制能量代谢和稳态中起着至关重要的作用1。骨骼肌质量是通过蛋白质合成率和降解率之间的精细平衡来维持的1。许多疾病条件影响骨骼肌的这些过程, 导致肌肉质量净损失 (萎缩)。其中包括但不限于癌症、艾滋病、衰老、禁食和肢体固定2, 3.在老龄化人口中, 力量的丧失与肌肉质量的损失有关, 是所有病例死亡率的预测指标4。在此背景下, 评估肌肉功能提供了一个重要的措施, 当确定的疗效的治疗策略, 以打击和或防止骨骼肌消瘦和功能丧失。

研究人员使用了许多不同的方法和动物模型来了解肌肉萎缩5, 6 的分子途径, 以及这些机制对肌肉收缩功能2,3 的影响 ,7。因此, 将分子水平的变化与肌肉功能的差异联系起来对于了解分子水平的变化如何影响肌肉功能是非常必要的。

骨骼肌功能, 特别是在小啮齿类动物, 通常是使用三个很好的程序8,9, 以检测受损的力量生产和/或监测疾病的进展。(1) 体内;其中肌肉从动物中取出, 并在林格的洗澡液中孵育, 使用场刺激10来评估肌肉功能.(2) 就地;其中肌肉的近端连接留在动物和远端肌腱连接到力传感器, 允许肌肉功能通过直接神经刺激 11.(3) 体内;其中电极被放置在皮下, 以获得神经诱发肌肉力量的生产9,12。虽然这三个过程用于不同的目的, 但它们各自都有优点和缺点。因此, 根据研究的目的选择合适的方法是很重要的。体外实验的主要局限性是将肌肉从正常环境中去除, 并使用现场刺激。原位方法维持正常的血液供应, 通过神经进行刺激, 但正常解剖结构发生改变, 实验性质接近;因此, 这使得后续肌肉功能测量不可能。这里描述的体内方法最密切地模仿正常生理, 因为解剖不受干扰, 神经肌肉束保持完整, 实验不结束, 允许在同一动物体内随着时间的推移采取后续措施8。

在这里, 我们描述了一个体内程序, 允许随着时间的推移在同一动物的肌肉功能的多个测量。这个程序包括评估前胸膜室的肌肉-包括胫骨前 (ta), 伸肌长 (edl), 和伸展肌长肌 (ehl) 负责背屈-在一个非侵入性的程序通过腓骨 (也称为腹膜) 神经刺激。ta 提供了大部分的力量脚踝背屈 13, 只有最小的贡献由 edl 和 ehl 控制脚趾的运动。这种非终端协议确保了神经和血液供应的保存。这使得在动物模型中目前可用的最生理环境中, 可以对疾病演变和治疗效果进行研究。

研究方案

所有实验程序均由迪肯大学动物伦理委员会批准 (项目 #G19/2014)。

1. 设备设置

  1. 确保所有计算机都已正确连接。
  2. 打开计算机、大功率双相刺激器和双模杠杆系统。
  3. 在平台上设置鼠标膝盖夹, 以及在传感器上设置鼠标脚板。
  4. 将加热平台打开至37°c。
  5. 打开桌面上的动态肌肉控制软件。
    请注意:这是执行功能测试所需的软件。

2. 软件和模型设置

  1. 程序打开后 (图 1), 校准传感器并选择"设置"我的乐器校准。
  2. 在 "设置" 按钮上, 选择"即时"参数, 并将 "运行时间" 参数更改为 120秒 (图 1a)。
    请注意:还可以根据需要多次执行单次抽搐、手动设置或启动即时启动。
  3. 在标记为 "自动保存基础" 的可键入窗口中, 输入自动保存文件位置的名称 (例如,鼠标 1-日期时间点 1)。单击 "自动保存基础" 窗口左侧的复选框, 并将其更改为"启用自动保存".
  4. 在 dmc 控制屏幕的顶部, 转到序列器, 这将打开一个新的弹出窗口。选择 "打开序列" , 然后选择要使用的预制协议 (图 1 b)。单击 "加载序列"关闭窗口。
    请注意:此步骤用于生成力频率曲线 (ffc) 测试 (1、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250 hz)。
  5. 在双相刺激器上将 "range" 旋钮设置为 10 ma。
    请注意:确保 "调整" 旋钮 (右下一底部) 为零。这种精细的调整允许设置电极。

3. 鼠标设置

请注意:所有的力测量都是在12周大的雄性野生小鼠 (c57bib) 上进行的。

  1. 将每只小鼠放入麻醉室, 氧气流量为 1 l%, 含5% 异氟醚 (通过鼻通吸入), 直到小鼠失去意识。通过失去足部反射确认足够的麻醉。
  2. 用电动剪羊毛器剃须, 将老鼠右腿上的所有头发都摘掉。
  3. 将动物放置在加热平台上的仰角, 用70% 的酒精和碘清洁右腿 (两侧均可使用)。此时, 将异氟醚调整为 2% (氧气流量为 1 lmmin), 并将导电凝胶涂在放置电极的皮肤上。
    请注意:使用直肠温度探头在手术过程中监测体温, 并使用眼药膏, 以防止任何干燥和/或损害眼睛。
  4. 将脚放在脚板上, 并用医用胶带固定。在手术过程中夹住膝盖以稳定和固定腿。
    请注意:一些研究描述使用一个非常薄的别针插入胫骨近端 (后背屈肌)12 , 以提供稳定。该协议选择夹具, 因为这提供了足够的稳定性, 而不会对膝盖造成不必要的压缩/损伤。夹具还避免了可能产生的炎症, 一个跨骨针可能会产生, 同时仍然允许准确的评估肌肉收缩性。此外, 小鼠膝关节夹具已成功使用 14。
  5. 此时, 使用平台上的旋钮定位鼠标后肢, 使脚踝有90°角 (图 2)。

4. 电极位置的优化

  1. 一旦鼠标被放置在平台上, 将电极放置在右腿的皮肤下 (皮下)。
    请注意:这是一个关键的步骤, 在步骤4.4 中的设置过程中, 可能需要重新定位才能获得所需的位置。
  2. 将电极放在右腿的侧侧;将一个放在腓骨的头部附近, 另一个电极更远的放在腿的侧侧 (图 2)。
    请注意:定制的电极系统设计用于优化此步骤。但是, 此测试可以使用制造商在此系统中提供的电极针进行。
  3. 一旦这些步骤实现, 在大功率双相刺激器调整旋钮标记为 "调整" 所需的, 以获得腹膜神经的刺激, 导致最大的背屈扭矩。
    请注意:对于成年野生小鼠, 此范围小于 2 ma;然而, 这可能取决于动物的大小、年龄和性别。力的产生 (曲线的峰值) 应该缓慢增加, 直到达到最大力。
  4. 在刺激过程中, 顺时针旋转换能器以产生负值 (图 3), 这对于确保电极仅通过腹膜神经刺激背屈肌非常重要。一旦完成此步骤, 使用夹具稳定电极, 防止在过程中任何移动。
    请注意:峰值的大小会慢慢增加, 最大安培被确定为三个或三个以上连续刺激导致相同收缩力的水平。抗将安培调高到必要的水平;最大安培将刺激邻近和潜在的拮抗肌收缩, 导致共同收缩, 这可能产生正值的峰值。
  5. 停止软件上的即时启动。
  6. 在主屏幕上, 打开标记为 "启动序列" 的按钮, 启动上一个设置序列 (如步骤2.4 中所述)。

5. 终止程序

  1. 一旦力测量完成, 取下电极, 松开膝盖夹子, 并取出脚带。
  2. 关闭异氟烷并保持氧气输送几分钟, 以帮助动物恢复。一旦鼠标开始移动和/或恢复意识, 并可以自有权, 返回到它的笼子。
    请注意:非甾体抗炎药 (nsaid) 可以皮下注射 (1 mg/kg 美洛昔康), 以防止手术后出现任何不适和/或酸痛。

6. 数据分析

  1. 打开数据分析软件。
  2. 转到高吞吐量(屏幕左上角)。选择 "强制频率"以分析上述设置顺序。
  3. 选择"手动", 并将 "结束光标" 值更改为3。还选择 "删除基线"。
  4. 单击 "选择文件"以访问以前执行的过程, 然后单击 "分析"。此时, 可以在屏幕上访问结果, 也可以将结果导出到电子表格中进行进一步分析和计算。
    请注意:以 mn 为单位测量数据;但是, 扭矩可以通过将力值乘以杠杆臂的长度 (绝对力) 来计算。如果需要归一化 (特定的力), 扭矩可以归一化为体重, 或者终端实验可以进行, 以收集年龄匹配的肌肉质量。

结果

力频率曲线是一个有用的测试, 其中肌肉可以受到较低和较高频率的刺激, 以区分次优和最佳的力响应15。较低频率的力可以刺激单个抽搐, 激活较少和较小的运动单位, 在较高频率下达到稳定的峰值, 孤立的抽搐融合 (破伤风), 通过激活所有运动单元达到最大力 16.在所介绍的测试中, tetanic 曲线从 ~ 60 hz 开始, 在那里可以看到电位 (图 4a), 最大力确定在 ~ 150 hz (图 4A), 当高原达到一个完整的融合曲线9, 16岁

这些结果的任何变化都可能表明肌肉没有受到电极的适当刺激。电极放置是准备这一程序的一个重要步骤, 因为电刺激必须正确定位, 以刺激腹膜神经, 从而充分激活背屈肌肉, 它提供 (ta, edl, 和 ehl)。正确的电极定位会在这一过程中产生负峰 (图 3), 而电极的错位或较高的安培可能会导致周围肌肉的刺激, 从而导致周围肌肉的共同收缩。相邻的肌肉和拮抗剂肌肉, 这反过来产生的积极值的峰值。

图 5a显示了鼠标在不同时间的代表性力频率曲线数据, 在该时间内, 该过程每周重复一次, 直到完成5个时间点。这些观测结果显示了在整个时间点和测量的观测值中一致的力产生值。这一过程在小鼠测量之间也证明是一致的, 因为图 5b显示了 ffc 曲线下的代表性区域, 每周对6只小鼠进行一次测试, 超过5个不同的观察。

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图 1: 软件系统.(a) 控制软件说明设置 "即时 stim" 参数的步骤。在背景照片上, 单击 "设置"即时的斯姆。在弹出窗口 (前图) 上, 设置参数。(b) "序列器" 设置视图的插图。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 2: 鼠标设置.麻醉动物的位置概述。右膝夹被放置, 使膝盖在 90°, 使脚和脚踝在90°角 (虚线白线)。背屈肌的收缩是通过刺激腹膜神经来实现的, 腹膜神经位于腓骨头部下方 (远端)。我们使用定制设计的电极 (镶嵌);然而, 与该装置一起提供的针头电极, 或单独购买的针头电极, 也就足够了。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 3: 电极位置的输出.一旦电极被定位在皮肤下, 电压启动, 就会观察到负值的峰值。此时, 达到负值 (绿线) 是确保仅在背屈肌 (ta、edl 和 ehl) 中实现刺激的关键一步。在两条红线之间进行实时测量。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 4: 代表性曲线.(a) 60 赫兹力曲线样本 (鼠标 #06)。(b) 150 赫兹 (鼠标 #03) 的破伤风曲线样本。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 5: 代表力频率曲线 (ffc) 和曲线数据下的面积.(a) ffc (x 轴) 超过样本鼠标 (#05) 中的5个不同时间点 (第1、2、3、4和5周)。(b) ffc 曲线 (au, y 轴) 下5个不同时间点 (分别为鼠标 #01、02、03、04、05和06下的区域; x 轴)。结果表示为6只小鼠5个时间点 (sem) 的均数标准测量误差 (sem), 并通过单向方差分析 (p < 0.05) 进行分析。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

以准确和可重复的方式测量最大肌肉收缩功能对于基因、代谢和肌肉状况的进步评估至关重要 17。同样, 在体内肌肉收缩功能允许评估新的治疗和治疗的衰弱肌肉条件。本文通过体内程序对小鼠下肢背屈肌的力产生进行了测量。

商用设备是有效的, 并有助于执行这种非侵入性的程序。该测试提供了重要的优势, 评估肌肉收缩功能, 同时保持当地的生理环境, 其中血液供应和神经支配保持不变。另一方面, 它的缺点与肌肉横截面面积 (比力) 单位的力量正常化有关, 这只能在实验后收获的孤立肌肉中确定。然而, 非侵入性测试允许随着时间的推移对同一动物的屈肌收缩功能进行多次测量, 从而减少了所需实验动物的数量, 特别是如果目标是评估相对变化 (绝对力随时间的变化)。

在此过程中必须考虑一些重要步骤, 以便在时间点上实现一致的数据。首先, 应该尽可能努力规范动物的定位。其次, 在设置过程中, 重要的是要与电极定位保持一致, 以便通过刺激腹膜神经达到最佳的刺激。电极的位置应位于 (在这种情况下是右) 腿的侧侧, 靠近腓骨的头部, 并在腿的侧侧更远的地方 (图 2)。在此基础上, 定制电极的设计使两者每次都可以放置在同一位置。然而, 使用商业设备提供的电极针也可以实现足够的刺激。第三, 在电压设置过程中, 通过顺时针转动连接到脚板的传感器来实现负峰是至关重要的。在设置最大电压的情况下正确定位鼠标腿电极已被证明是一种技术, 可以随着时间的推移在同一鼠标上执行。

评估和跟踪同一动物在不同时间点的肌肉功能的能力是一个重要的评估, 以表征不同的肌肉疾病以及它们的进展。此外, 这种小鼠肌肉背屈的测量可以作为一个工具, 以评估潜在治疗在当地生理环境中的有效性, 以最小的代谢应激12。因此, 它提供了一种评估肌肉疾病, 其进展和潜在的治疗技术。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

该项目的资金来自迪肯大学运动和营养科学学院。作者要感谢 andrew howarth 先生在优化电极装置方面所做的大量工作。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – MouseAurora Scientific Inc.305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse ApparatusComplete muscle function system 
Conductive gel LivingstoneECGEL250conductive gel used in the mice
Eye ointmentAlconPoly Viscpharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) IliumMetacamveterinary medicine (injectable 5mg/ml) 
Isoflurane ZoetisIsofloveterinary inhalation Anaesthetic

参考文献

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