Valutazione non invasiva della funzione Dorsiflexor muscolare nei topi

Riepilogo

Misurazione della funzione contrattile del muscolo scheletrico del roditore è uno strumento utile che può essere utilizzato per monitorare la progressione della malattia, nonché l'efficacia di intervento terapeutico. Descriviamo qui la valutazione non invasiva, in vivo dei muscoli dorsiflexor che può essere ripetuto nel tempo nello stesso mouse.

Abstract

Valutazione della funzione contrattile del muscolo scheletrico è una misura importante per entrambi di clinici e scopi di ricerca. Numerose condizioni possono influenzare negativamente il muscolo scheletrico. Questo può comportare una perdita di massa muscolare (atrofia) e/o perdita di qualità muscolare (forza per unità di muscolare ridotta massa), entrambi i quali sono prevalenti nella malattia cronica, malattia muscolo-specific, immobilizzazione e invecchiamento (sarcopenia). Funzione del muscolo scheletrico negli animali può essere valutata da una serie di prove differenti. Tutti i test hanno limitazioni legate all'ambiente di prova fisiologica, e la selezione di un test specifico spesso dipende dalla natura degli esperimenti. Qui, descriviamo una tecnica non invasiva in vivo, che coinvolge una valutazione utile e facile di frequenza-curva di forza (FFC) in topi che possono essere eseguite sull'animale stesso nel tempo. Questo permette il monitoraggio della progressione della malattia e/o l'efficacia di un trattamento terapeutico potenziale.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è un tessuto metabolico importante che comprende circa il 40% del peso corporeo totale. Svolge un ruolo cruciale nel controllo del metabolismo e dell'omeostasi di energia¹. Muscolo scheletrico massa è mantenuto da un equilibrio sottile tra i tassi di sintesi e degradazione di proteine¹. Numerose patologie colpiscono questi processi nel muscolo scheletrico, che conduce a una perdita netta di massa muscolare (atrofia). Questi includono, ma non sono limitati a, invecchiamento di cancro, AIDS, digiuno e arto immobilizzazione^2,3. Nella popolazione di invecchiamento, perdita di forza è associata con una perdita di muscolo massa ed è un preannunciatore di mortalità di tutti-caso⁴. In questo contesto, la valutazione della funzione muscolare fornisce una misura importante nel determinare l'efficacia delle strategie terapeutiche per combattere e/o prevenire lo spreco del muscolo scheletrico e perdita di funzione.

I ricercatori hanno usato molti diversi approcci e modelli animali per capire i meccanismi molecolari dell'atrofia muscolare^5,6 e le implicazioni di questi meccanismi il muscolo funzione contrattile^{2,3 ,7}. Di conseguenza, correlando i cambiamenti a livello molecolare alle differenze nella funzione del muscolo è indispensabile nella comprensione come cambiamenti di livello molecolare possono avere un impatto funzionalità muscolare.

Funzione del muscolo scheletrico, soprattutto nei piccoli roditori, viene in genere eseguita utilizzando tre procedure ben descritte^8,9 per rilevare la ridotta produzione di forza e/o monitorare la progressione della malattia. (1) ex vivo; dove il muscolo è rimosso dall'animale e incubato in una soluzione di bagno per valutare la funzione del muscolo utilizzando campo stimolazione¹⁰. (2) In situ; dove l'attacco prossimale del muscolo rimane nell'animale e il tendine distale è collegato ad un trasduttore di forza, permettendo la funzione muscolare deve essere eseguito da diretta del nervo stimolazione¹¹. (3) In vivo; dove gli elettrodi sono posizionati per via sottocutanea per ottenere il muscolo nervo-evocato forza produzione^9,12. Mentre queste tre procedure sono utilizzate per scopi diversi, ciascuno possiedono vantaggi e svantaggi. Pertanto, è importante selezionare un metodo appropriato basato sull'obiettivo dello studio. La principale limitazione con ex vivo esperimenti è la rimozione del muscolo dal suo ambiente normale e l'uso di stimolo di campo. Il metodo in situ mantiene un rifornimento di anima normale e utilizza la stimolazione attraverso il nervo, ma è alterata anatomia normale e la natura dell'esperimento è terminale; così, questo rende misure di follow-up muscolo funzione Impossibile. Il metodo in vivo qui descritto più molto attentamente imita normale fisiologia in quanto l'anatomia è indisturbato, il bundle neuromuscolare rimane intatto e l'esperimento non è terminale, consentendo a misure di controllo all'interno dello stesso animale in tempo⁸.

Qui, descriviamo una procedura in vivo che permette misurazioni multiple della funzione muscolare nello stesso animale nel corso del tempo. Questa procedura comporta la valutazione dei muscoli del compartimento crurale anteriore — inclusi anterior(TA) tibialis, longus di digitorum dell'estensore (EDL) e hallicus longus (EHL) i muscoli estensori, responsabili di dorsiflexion — in una procedura non invasiva da fibular stimolo del nervo (noto anche come peroneo). Il TA fornisce la maggior parte della forza di dorsiflessione della caviglia¹³, con il solo contributo minimo dalla EDL ed EHL che controllano il movimento delle dita. Questo protocollo non terminale assicura la conservazione del rifornimento sanguigno e del nervo. Questo consente per l'indagine di efficacia di evoluzione e trattamento di malattia nel corso del tempo nell'ambiente più fisiologico attualmente disponibile in un modello animale.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di etica animale Università Deakin (progetto n #G19/2014).

1. installazione dell'apparecchiatura

1. Garantire che tutte le macchine siano collegate correttamente.
2. Accendere il computer, ad alta potenza bi-fase stimolatore e sistema a leva dual mode.
3. Impostare il morsetto del ginocchio di mouse sulla piattaforma, così come la pedana del mouse sul trasduttore.
4. Attivare la piattaforma di riscaldamento a 37 ° C.
5. Aprire il software di controllo muscolare dinamica sul desktop.
   Nota: Questo è il software necessario per eseguire il test funzionale.

2. il software e la configurazione di modello

1. Una volta che il programma è aperto (Figura 1), calibrare il trasduttore e selezionare installazione | I miei strumenti | Calibrare.
2. Il pulsante "Imposta", selezionare InstantStim e modificare i parametri di "Run Time" a 120 s (Figura 1A).
   Nota: Tensione ottima può essere ottenuta anche eseguire singole contrazioni, manualmente impostazione, o avviando la InstantStim tante volte quanto necessario.
3. Nella finestra tipo-in grado, con l'etichetta "Salvataggio automatico Base" per inserire il nome dell'auto salvare il percorso del file (ad esempio, mouse1-data-timepoint1). Fare clic sulla casella a sinistra della finestra "Salvataggio automatico Base" e modificarlo per Abilitare Autosave.
4. Nella parte superiore del controllo DMC schermo andare al Sequencer, che aprirà una nuova finestra pop-up. Selezionare Apri sequenza e selezionare il protocollo premade per essere utilizzato (Figura 1B). Fare clic su sequenza di carico | Chiudere la finestra.
   Nota: Questo passaggio viene utilizzato per generare un test di curva di frequenza (FFC) forza (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz).
5. Impostare la manopola di "Gamma" a 10 mA sullo stimolatore bi-fase.
   Nota: Assicurarsi che la manopola "ADJUST" (in basso a destra successiva) sia su zero. Questa regolazione permette la configurazione degli elettrodi.

3. Mouse installazione

Nota: Tutte le misure di forza sono state effettuate su topi wild-type maschi (C57BI/6) a 12 settimane di età.

1. Posizionare ogni mouse nella camera di anestesia, con un tasso di flusso di ossigeno di 1 L/min con 5% isoflurane (via inalazione musetto) fino a quando il mouse perde coscienza. Confermare un'anestesia adeguata tramite perdita del riflesso del piede.
2. Rimuovere tutti i capelli sulla gamba destra del mouse dalla rasatura con tagliacapelli elettrico.
3. Metti l'animale in posizione supina sulla piattaforma riscaldata e pulire la gamba destra (possono essere usato entrambi i lati) con alcol al 70% e lo iodio. A questo punto, regolare l'isoflurano al 2% (con flusso di ossigeno a 1 L/min) e applicare il gel conduttivo sulla pelle dove verranno posizionati gli elettrodi.
   Nota: Utilizzare una sonda di temperatura rettale per monitorare la temperatura corporea durante la procedura e applicare unguento oculare per prevenire eventuali danni e/o secchezza agli occhi.
4. Posizionare il piede sulla pedana e allegare utilizzando nastro medico. Morsetto del ginocchio per stabilizzare e immobilizzare la gamba durante la procedura.
   Nota: Alcuni studi hanno descritto utilizzando una punta molto sottile inserita attraverso la tibia prossimale (posteriore ai muscoli muscoli dorsiflessori gli)¹² per fornire la stabilizzazione. Questo protocollo si opta per un morsetto, come questo fornisce sufficiente stabilizzazione senza inutili compressione/danni al ginocchio. Il morsetto evita anche infiammazione potenziale che potrebbe creare un pin trans-ossei, pur consentendo una valutazione accurata della contrattilità muscolare. Inoltre, il morsetto del ginocchio del mouse è stato utilizzato con successo¹⁴.
5. A questo punto, utilizzare le manopole sulla piattaforma per posizionare l'arto posteriore del mouse in modo che c'è un angolo di 90° alla caviglia (Figura 2).

4. ottimizzazione della posizione elettrodi

1. Una volta che il mouse viene posizionato sulla piattaforma, posizionare gli elettrodi sotto la pelle (sottocutanea) alla gamba destra.
   Nota: Questo è un passo cruciale, e qualche riposizionamento può essere richiesto per ottenere la posizione desiderata durante l'installazione nel passaggio 4.4.
2. Posizionare gli elettrodi sulla parte laterale della gamba destra; posto uno vicino alla testa del perone e l'altro elettrodo più distalmente sulla parte laterale della gamba (Figura 2).
   Nota: Un sistema su misura elettrodo è progettato per ottimizzare questo passaggio. Tuttavia, questo test può essere eseguito con elettrodi ad ago forniti dal costruttore in questo sistema.
3. Una volta che questi passaggi sono raggiunti, sullo stimolatore bi-fase ad alta potenza regolare la manopola con l'etichetta «Regola» come necessario per ottenere una stimolazione del nervo peroneo che si traduce in coppia massima dorsiflessione.
   Nota: Per adulti topi wild-type, questa gamma è meno di 2 mA; Tuttavia, questo può dipendere la dimensione, età e sesso dell'animale. La produzione di forza (picchi di curve) dovrebbe essere aumentata lentamente fino a quando non viene raggiunta la forza massima.
4. Durante la stimolazione, girare il trasduttore per produrre valori negativi (Figura 3), che sono importanti per garantire che gli elettrodi sono stimolando solo i muscoli di dorsiflexor dal nervo peroneo. Una volta che questo passaggio è raggiunto, stabilizzare gli elettrodi utilizzando un morsetto, impedendo qualsiasi movimento durante la procedura.
   Nota: Le cime aumenterà lentamente in grandezza, e l'amperaggio massimo è determinato come il livello in cui tre o più consecutivi stimolazioni risultato nella contrattilità identici. Resistere girando l'amperaggio superiore rispetto al necessario; l'amperaggio massimo stimolerà la vicina e potenzialmente muscoli antagonisti a contrarsi, causando co-contrazione, che possa generare picchi di valori positivi.
5. Interrompere la Stim istantanea sul software.
6. Sulla schermata principale, attivare il pulsante con l'etichetta "Avvio sequenza" per avviare la sequenza di installazione precedente (come descritto al punto 2.4).

5. terminata la procedura di

1. Una volta che le misurazioni di forza sono finite, rimuovere gli elettrodi, allentare il blocco del ginocchio e rimuovere il nastro di piede.
2. Spegnere l'isoflurano e mantenere la consegna dell'ossigeno per pochi minuti aiutando il recupero degli animali. Una volta che il mouse inizia a muoversi e/o riprende conoscenza e può auto-destra, è possibile restituire il mouse alla sua gabbia.
   Nota: Un antinfiammatorio non steroideo (FANS) può essere iniettato per via sottocutanea (1 mg/kg di meloxicam) per evitare qualsiasi disagio e/o dolore dopo la procedura.

6. analisi dei dati

1. Aprire il software di analisi dati.
2. Vai a High Throughput (alto a sinistra sullo schermo). Selezionare Forza frequenza per analizzare quanto sopra descritto la sequenza di installazione.
3. Selezionare manuale e modificare il valore di "Fine cursore" a 3. Anche selezionare Rimuovere Baseline.
4. Fare clic su Scegli file per accedere alla procedura precedentemente svolte e quindi fare clic su analizza. A questo punto, il risultato può essere letta sullo schermo o esportato in un foglio di calcolo per ulteriori analisi e/o calcoli.
   Nota: I dati sono stati misurati in mN; Tuttavia, la coppia può essere calcolata moltiplicando il valore della forza per la lunghezza del braccio di leva (forza assoluta). Se la normalizzazione è richiesto (force specifica), coppia possa essere normalizzata in peso corporeo, o esperimenti terminali possono essere eseguiti per raccogliere la massa muscolare di pari età.

Risultati

La curva di forza-frequenza è un utile banco di prova in cui i muscoli possono essere stimolati dalle frequenze inferiori e superiori per distinguere vigore non ottimali e ottimale le risposte¹⁵. La forza a bassa frequenza in grado di stimolare una contrazione singola, attivazione unità motore più piccolo e meno, e alle frequenze più alte è raggiunto un picco stabile, dove contrazioni isolati fuso (tetano), raggiungendo la massima forza attraverso l'attivazione di tutte le unità motorie¹⁶ . Nel test presentato, la curva tetanica inizia a ~ 60 Hz, dove possa essere visualizzato il potenziamento (Figura 4A) e la forza massima è determinate a ~ 150 Hz (Figura 4B), quando l'altopiano è raggiungibile con una curva fusa completato^{9, 16}.

Qualsiasi variazione di questi risultati può indicare che i muscoli non sono essere adeguatamente stimolati dagli elettrodi. Posizionamento degli elettrodi è un passo importante nella preparazione di questa procedura, come la stimolazione elettrica deve essere correttamente posizionata per innervano il nervo peroneo e così completamente attivare i muscoli di dorsiflessione, che esso rifornisce (TA, EDL ed EHL). Corretto posizionamento elettrodi determina la generazione di picchi negativi (Figura 3) durante questo processo, considerando che il disallineamento di elettrodi o di amperaggio superiore può portare alla stimolazione di che circonda i muscoli, causando co-contrazione della i muscoli vicini e muscoli antagonisti, che a sua volta genera picchi di valori positivi.

Figura 5A Mostra forza rappresentativa curva di frequenza dati da un mouse attraverso il tempo, dove la procedura è stata ripetuta una volta alla settimana fino a 5 punti temporali furono completate. Queste osservazioni hanno dimostrato forza costante valori di produzione in tutto i punti temporali e/o osservazioni misurate. Questa procedura è anche indicato per essere coerente tra le misurazioni di topi, come figura 5B Mostra rappresentante dell'area sotto la curva di FFC ha stimolato più di 5 diverse osservazioni in 6 topi testati una volta a settimana.

Figura 1 : Software di sistema. (A) illustrazione di software di passaggi per la configurazione dei parametri di "Instant Stim" di controllo. L'immagine di sfondo, fare clic su installazione | Stim immediata. Sulla piccola spuntato finestra (foto anteriore), impostata i parametri. (B) illustrazione della vista di configurazione "Sequencer". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Installazione Mouse. Panoramica della posizione dell'animale anestetizzato. Il morsetto del ginocchio destro è posto così che il ginocchio è a 90° e in modo che il piede e la caviglia sono ad angoli di 90° (linea punteggiata di bianco). Contrazione dei muscoli muscoli dorsiflessori gli è raggiunto dalla stimolazione del nervo peroneo, che si trova appena sotto (distale) la testa del perone. Usiamo elettrodi personalizzati (nel riquadro); Tuttavia, gli elettrodi ad ago che forniti con l'unità, o acquistati separatamente, sono anche sufficienti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Uscita dal posizionamento degli elettrodi. Una volta che gli elettrodi siano posizionati sotto la pelle e la tensione è avviata, si osservano picchi con valori negativi. A questo punto, raggiungendo valori negativi (linee verdi) è un passo cruciale nel fare in modo che la stimolazione è realizzata in dorsiflexor muscoli solo (TA, EDL ed EHL). La misurazione in tempo reale è indicata tra le due linee rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Curve rappresentative. (A) esempio di curva di forza a 60 Hz (topo #06). Campione (B) della curva tetanica a 150 Hz (topo #03). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Rappresentante della forza area sotto i dati della curva e curva di frequenza (FFC). (A), FFC (asse x) oltre 5 diversi punti temporali (settimane 1, 2, 3, 4 e 5) in un mouse di campione (n. 05). (B) Area sotto la curva (AU, asse y) di FFC sopra 5 punti temporali differenti (rispettivamente; il mouse #01, 02, 03, 04, 05 e 06, asse x). Risultati sono espressi come media ± errore standard di misura (SEM) di cinque punti temporali (test) in 6 topi e sono stati analizzati da One-way ANOVA test (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Discussione

Misurazione della funzione contrattile del muscolo massima in modo preciso e ripetibile è fondamentale per la valutazione progressiva di genetica, metabolica e muscolo circostanze¹⁷. Allo stesso modo, la funzione contrattile del muscolo in vivo consente la valutazione di nuovi trattamenti e terapie per muscolo condizioni debilitanti. Qui dimostriamo la misura della produzione di forza dei muscoli dorsiflexor del hindlimb inferiore del mouse attraverso una procedura in vivo.

Apparati commerciali sono efficienti e utili nell'esecuzione di questa procedura non invasiva. Questa prova fornisce importanti vantaggi connessi alla valutazione della funzione contrattile del muscolo, mantenendo un ambiente fisiologico nativo, in cui il sangue alimentatore e innervazione rimangono intatti. D'altra parte, gli svantaggi sono legati alla normalizzazione della forza per unità di area trasversale del muscolo (forza specifica), che può essere accertato solo in un muscolo isolato che è raccolto dopo una sperimentazione. Tuttavia, il test non invasivo permette misurazioni multiple della funzione contrattile dei muscoli flessori nello stesso animale nel tempo, con conseguente riduzione del numero di animali da esperimento sia necessari, soprattutto se l'obiettivo è quello di valutare le variazioni relative ( cambiamenti nella forza assoluta nel tempo).

Ci sono passi importanti che devono essere considerati durante questa procedura al fine di ottenere dati consistenti sopra i punti temporali. In primo luogo, si dovrebbe tentare di standardizzare animale posizionamento quando possibile. In secondo luogo, durante la messa in opera è importante essere coerenti con il posizionamento elettrodi affinché stimolazione ottima può essere raggiunta tramite la stimolazione del nervo peroneo. La posizione degli elettrodi deve essere sulla parte laterale della gamba (in questo caso a destra), vicino alla testa del perone e ulteriormente verso il basso il lato laterale della gamba (Figura 2). Su questa base, gli elettrodi su misura sono realizzati come tali che entrambi possono essere posizionati nella stessa posizione ogni volta. Tuttavia, stimolazione sufficiente può essere ottenuta anche utilizzando gli elettrodi ad ago forniti con gli apparati commerciali. In terzo luogo, è fondamentale raggiungere picchi negativi durante l'installazione di tensione ruotando in senso orario il trasduttore collegato alla pedana. Corretto posizionamento degli elettrodi del mouse gamba con setup tensione massima ha dimostrato di essere una tecnica che può essere eseguita sul mouse stesso nel tempo.

La capacità di valutare e tenere traccia di funzione muscolare timepoints differenti lo stesso animale è una valutazione importante per caratterizzare malattie muscolari differenti come pure la loro progressione. Inoltre, questa misura di dorsiflexion del muscolo nei topi può essere uno strumento per valutare l'efficacia di trattamenti potenziali in un ambiente fisiologico nativo, con minimo sforzo metabolico¹². Così, esso fornisce una tecnica nel valutare il trattamento di malattia, la sua progressione e potenziale muscolare.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse	Aurora Scientific Inc.	305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus	Complete muscle function system
Conductive gel	Livingstone	ECGEL250	conductive gel used in the mice
Eye ointment	Alcon	Poly Visc	pharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)	Ilium	Metacam	veterinary medicine (injectable 5mg/ml)
Isoflurane	Zoetis	Isoflo	veterinary inhalation Anaesthetic