비-침략 적 쥐에서 Dorsiflexor 근육 기능 평가

요약

쥐 골격 근육 수축 기능의 측정 치료 개입의 효능 뿐만 아니라 질병의 진행을 추적 하는 데 사용할 수 있는 유용한 도구입니다. 여기 같은 마우스에서 시간이 지남에 따라 반복 될 수 dorsiflexor 근육의 비-침략 적, vivo에서 평가 설명 합니다.

초록

골격 근육 수축 기능의 평가 임상 모두에 중요 한 측정 및 연구 목적. 수많은 조건 수 부정적인 골격 근육에 영향을. 이 근육 질량 (위축)의 손실 및 근육 품질의 손실 귀 착될 수 있다 (근육의 단위 당 힘 감소 질량), 둘 다에서 만성 질환, 근육 관련 질병, immobilization, 그리고 노화 (sarcopenia) 되어 있습니다. 다른 테스트의 범위에 의해 동물에 골격 근육 기능을 평가할 수 있습니다. 모든 테스트는 생리 테스트 환경에 관련 된 제한 사항 그리고 특정 테스트의 선택은 종종 실험의 성격에 따라 달라 집니다. 여기, 우리는 힘 주파수-곡선 (FFC) 시간이 지남에 같은 동물에 수행할 수 있는 마우스의 유용 하 고 쉽게 평가 포함 하는 vivo에서, 비-침략 적 기법을 설명 합니다. 이 질병의 진행 및 잠재적인 치료 치료의 효능의 모니터링을 허용 합니다.

서문

골격 근육은 총 몸 무게의 약 40%를 구성 하는 중요 한 대사 조직. 그것은 에너지 물질 대사 그리고 항상성¹의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 골격 근육 질량 단백질 합성과 저하¹의 속도 사이 좋은 균형에 의해 유지 됩니다. 수많은 질병 조건 골격 근육, 근육 질량 (위축) 당기 순 손실에 지도에서이 프로세스를 영향을 줍니다. 이 포함, 하지만 국한 되지 않습니다, 암, 에이즈, 노화, 금식, 그리고 동원 정지^2,3사지. 고령, 힘의 손실은 근육의 손실과 관련 된 질량 및 모든 경우 사망률⁴의 예측 이다. 이러한 맥락에서 근육 기능 평가 방지 및 골격 근육 낭비 및 기능의 손실을 방지 치료 전략의 효능을 결정할 때 중요 한 조치를 제공 합니다.

연구원은 근육 위축^5,6 의 분자 통로 근육 수축 기능^{2,3에 이러한 메커니즘의 의미를 이해 하 많은 다른 접근 및 동물 모델 사용 ,7}. 분자 수준의 변화 근육 기능에 영향을 줄 수 있습니다 하는 방법 따라서, 연관 근육 기능에 차이를 분자 수준에서 변경 내용을 이해에 필수적입니다.

골격 근육의 기능, 특히 작은 설치류에에서 일반적으로 강제로 생산 장애 감지 및 질병의 진행을 모니터링 3 잘 설명된 절차^8,9 를 사용 하 여 수행 됩니다. (1) 전 비보. 어디 근육 동물에서 제거 하 고 필드 자극¹⁰를 사용 하 여 근육의 기능을 평가 하기 위해 벨의 목욕 솔루션에서 incubated입니다. (2) 현장에서; 어디는 근육의 근 위 부착 동물에 남아 있고 원심 힘 줄 근육 기능 직접 신경 자극¹¹에 의해 수행 될 수 있도록 힘 변환기에 연결 된다. (3) 생체 조건; 전극 피하 배치는 근육 신경 갖는 강제로 생산^9,12. 이러한 세 가지 절차는 다른 목적을 위해 사용 됩니다, 그들은 각각가지고 장점과 단점. 따라서, 그것은 연구의 목적에 따라 적절 한 방법을 선택 하는 것이 중요입니다. Ex vivo 실험과 주요 제한은 그것의 정상적인 환경에서 근육의 제거 및 필드 자극의 사용입니다. 원래의 방법 정상적인 혈액 공급을 유지 하 고, 신경을 통해 자극을 사용 하 여 있지만 정상 해부학 변경 하 고 실험의 본질은 터미널; 따라서, 이것은 후속 근육 기능 측정 불가능 합니다. 여기 가장 밀접 하 게 설명 하는 vivo에서 방법을 모방 정상적인 생리학을 해부학 방해, 신경 근육 학 번들 남아 그대로 이며 실험 터미널,⁸시간 동안 같은 동물 내에서 후속 조치를 허용 하지 않습니다.

여기, 우리는 시간이 지남에 같은 동물에서 근육 기능의 여러 측정을 허용 하는 vivo에서 절차를 설명 합니다. 이 절차는 이전 crural 구획의 근육의 평가 포함 한다-tibialis anterior(TA), 신 근 digitorum longus (EDL), 그리고 신 근 hallicus longus (EHL) 근육, dorsiflexion에 대 한 책임을 포함 하 여-비-침략 적 절차에 의해 fibular (일컬어 비 골) 신경 자극. TA 발목 dorsiflexion¹³, EDL EHL는 발가락의 그 제어 운동에 의해만 최소한의 기여에 대 한 힘의 대부분을 제공합니다. 이 비 터미널 프로토콜 신경 및 혈액 공급의 보존을 보장합니다. 동물 모델에서 현재 사용할 수 있는 가장 생리 적 환경에서 시간이 지남에 질병 진행 및 치료 효능의 조사에 대 한 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 디킨 대학교 동물 윤리 위원회 (프로젝트 #G19/2014)에 의해 승인 되었다.

1. 장비 설치

1. 모든 컴퓨터가 제대로 연결 되어 있는지 확인 합니다.
2. 컴퓨터, 고 전력 bi 단계 자극 및 듀얼 모드 레버 시스템을 켭니다.
3. transductor에 마우스 footplate 뿐 아니라 플랫폼에 마우스 무릎 클램프를 설정 합니다.
4. 37 ° c 난방 플랫폼 설정
5. 바탕 화면에 동적 근육 제어 소프트웨어를 엽니다.
   참고: 기능 테스트를 수행 하는 데 필요한 소프트웨어입니다.

2. 소프트웨어 및 모델 설정

1. 일단 프로그램을 열 (그림 1), 보정 변환기 선택 하 고 설정 | 내 악기 | 보정.
2. "설치" 버튼에서 InstantStim 를 선택 하 고 120 "실행 시간" 매개 변수를 변경 s (그림 1A).
   참고: 최적의 전압 또한 단일 나타낸 수행, 수동으로 설정, 또는 필요에 따라 여러 번으로는 InstantStim를 시작 하 여 얻을 수 있습니다.
3. 자동 이름 입력 "자동 저장 기지" 라는 유형 수 창에서 파일 위치 (예:, mouse1-날짜-timepoint1)를 저장 합니다. "자동 저장 기지" 창 왼쪽에 있는 확인란을 클릭 하 고 자동 저장 가능 하 게변경 합니다.
4. Dmc의 컨트롤의 위쪽 화면 시퀀서, 새로운 팝업 창이 열립니다 있는로 이동 합니다. 오픈 시퀀스 를 선택한 수 premade 프로토콜 사용 (그림 1B). 로드 시퀀스를 클릭 | 창을 닫고.
   참고: 이 단계는 힘 주파수 곡선 (FFC) 테스트를 생성 하는 데 사용 됩니다 (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz).
5. 10 "범위" 노브를 설정 bi 단계 자극에 mA.
   참고: "조정" 노브 (오른쪽 다음 아래) 0에 있는지 확인 합니다. 이 미세 조정 전극의 설치 수 있습니다.

3. 마우스 설정

참고: 모든 힘 측정 나이의 12 주에 남성 야생-타입 마우스 (C57BI/6)에서 수행 했다.

1. 1 L/min (nosecone 흡입)를 통해 5 %isoflurane는 산소 유량과 마 취 실로 각 마우스를 놓고 마우스의 식을 잃는 때까지. 발 반사의 손실을 통해 적절 한 마 취를 확인 합니다.
2. 전기 헤어 클리퍼 스와 함께 면도 여 마우스의 오른쪽 다리에 모든 머리카락을 제거 합니다.
3. 온수 플랫폼에서 부정사 위치에 동물을 놓고 70% 알코올 및 요오드 (양쪽을 사용할 수 있습니다.) 오른쪽 다리를 청소 합니다. 이 시점에서, 2% (1 L/min에 산소 흐름)와 isoflurane 조정 하 고 전극 배치 될 피부에 전도성 젤을 적용.
   참고: 직장 온도 프로브를 사용 하 여 절차 동안 체온을 모니터링 하 고 눈에 어떤 건조 및 피해를 방지 하기 위해 눈 연 고를 적용.
4. Footplate에 발 놓고 의료 테이프를 사용 하 여 연결 합니다. 절차 동안에 다리를 고정을 안정 시키고 무릎을 클램프.
   참고: 일부 연구는 안정화를 제공 하는 근 위 경골 (dorsiflexors 근육에 후부)¹² 삽입 매우 얇은 핀을 사용 하 여 설명 했습니다. 이 프로토콜이 제공 하는 불필요 한 압축/무릎에 손상 없이 충분 한 안정화는 클램프에 대 한 opts. 클램프는 또한 근육 수축에 대 한 정확한 평가 하면서 트랜스-뼈가 있는 핀 만들 수 있는 잠재적인 염증을 방지 합니다. 또한, 마우스 무릎 클램프¹⁴성공적으로 사용된 되었습니다.
5. 이 시점에서, 발목 (그림 2)에서 90 ° 각도 되도록 마우스 hindlimb를 플랫폼에 손잡이 사용 합니다.

4입니다. 전극 위치의 최적화

1. 마우스는 플랫폼에 배치 되 면 오른쪽 다리에 (피하) 피부 아래 전극 위치.
   참고: 이것은 중요 한 단계, 그리고 일부 재배치 단계 4.4에서에서 설치 하는 동안 원하는 위치를 얻기 위하여 필요할 수 있습니다.
2. 오른쪽 다리의 측면에 전극 배치 하나 비와 다른 전극의 머리 근처 더 distally 다리 (그림 2)의 측면에 놓습니다.
   참고: 주문 품 전극 시스템은이 단계를 최적화 하도록 설계 되었습니다. 그러나,이 시스템에는 제조업체에서 제공 하는 전극 바늘으로이 테스트를 수행할 수 있습니다.
3. 일단이 단계는 달성 전력 bi 단계 자극에 최대 dorsiflexion 토크에서 비 골 신경의 자극을 얻기 위해 필요에 따라 "조정"를 표시 하는 노브를 조정 합니다.
   참고: 성인 야생-타입 마우스,이 범위는 2 미만 mA; 그러나, 크기, 나이, 그리고 동물의 섹스에 의존 수 있습니다. 강제로 생산 (곡선의 봉우리) 최대 힘에이 때까지 천천히 증가 한다.
4. 자극 하는 동안 변환기를 전극 비 골 신경에 의해 dorsiflexor 근육만 자극은 되도록 중요 한 음수 값 (그림 3)를 시계 방향으로 설정 합니다. 일단이 단계가 달성 절차 동안 어떤 움직임을 방지 하는 클램프를 사용 하 여 전극에 고정 시켜야 합니다.
   참고: 봉우리는 천천히 크기에서 증가 하 고 최대 암페어는 3 개 이상의 연속 stimulations 동일한 수축 될 수준으로 결정 됩니다. 선회 필요; 보다 더 높은 암페어에 저항 최대 암페어는 이웃과 잠재적으로 계약, 길 항 근 근육의 양수 값을 생성할 수 있는 공동 수축 발생 자극할 것 이다.
5. 소프트웨어에 즉시 Stim를 중지 합니다.
6. 메인 화면에서 "시작 시퀀스" 이전 설치 시퀀스 (단계 2.4에서에서 설명)를 시작 하는 단추를 켭니다.

5. 종료 절차

1. 힘 측정 완료 되 면 전극 제거, 무릎 클램프 놓고 발 테이프를 제거.
2. isoflurane 끄고 동물 복구를 방 조 하는 몇 분 동안 산소 공급을 유지. 일단 마우스 이동 시작 및/또는 의식 회복 자체 오른쪽 수 있습니다, 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다.
   참고: Nonsteroidal 항 염증 약물 (NSAID) 피하 주사 될 수 있다 (1 mg/kg meloxicam) 수술 후 불편 하거나 통증을 방지 하기 위해.

6. 데이터 분석

1. 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다.
2. 높은 처리량 (왼쪽 화면)로 이동 합니다. 위의 분석을 선택 힘 주파수 설치 순서를 설명 합니다.
3. 수동 을 선택 하 고 "끝 커서" 값 3을 변경. 또한 초기 제거를 선택 합니다.
4. 선택 파일 이전 수행된 절차를 액세스 하 여 다음 분석을 클릭 합니다 클릭 하십시오. 이 시점에서 결과 화면에 액세스할 수 있습니다 또는 추가 분석 및 계산 스프레드시트를 내보낼.
   참고: 데이터는 미네소타;에서 측정 그러나, 토크 힘 값 (절대 힘) 레버 팔의 길이 곱하여 계산할 수 있습니다. 정규화 필요 (특정 힘) 인 경우에, 몸 무게, 토크를 정규화 할 수 있습니다 또는 터미널 실험 나이 일치의 근육 질량을 수집을 수행할 수 있습니다.

결과

힘 주파수 곡선 근육 차선 및 최적의 힘 응답¹⁵을 구별 하는 것 및 더 높은 주파수에 의해 자극 될 수 있는 유용한 테스트입니다. 낮은 주파수에서 강제 단일 트 위치, 적고 작은 모터 단위를 활성화 자극 그리고 더 높은 주파수에서 안정 피크에 도달 하면, 절연된 나타낸 융합 (파상풍), 어디에 도달 모든 모터 유닛^{16 활성화를 통해 최대 힘} . 테스트 제시, tetanic 곡선 시작 ~ 60 hz, 어디는 potentiation 구상 될 수 있다 (그림 4A)에 최대 힘에 결정 됩니다 ~ 150 Hz (그림 4B), 고원 완료 된 융합된 곡선^{9에 도달 하면 16}.

이러한 결과의 모든 변화는 근육 안 되 고 제대로 자극 하는 전극에 의해 나타낼 수 있습니다. 전극 배치는 중요 한 단계는이 절차의 준비, 비 골 신경 자극 활성화 하 고 따라서 완전히 dorsiflexion, 근육 전기 자극 제대로 위치 해야 합니다 그것 공급 (TA, EDL, EHL). 올바른 전극 또는 더 높은 암페어의 부정합 주변의 일으키는 공동 수축 근육의 자극으로 이어질 수 있는 반면이 과정 동안, 부정적인 봉우리 (그림 3)의 세대에서 결과 전극 위치는 인접 근육 그리고 차례 차례로 생성 하는 양수의 길 항 근 근육.

그림 5A 는 시간, 절차는 일주일에 한 번 5 timepoints 완료 된 때까지 반복 했다 마우스에서 대표적인 힘 주파수 곡선 데이터를 보여줍니다. 이 관측으로 일관 된 힘 생산 값 timepoints 및/또는 측정 하는 관측 나타났습니다. 이 절차는 또한 있듯이 그림 5B 대표는 보기의 곡선 아래의 영역 자극 6 마우스 테스트를 일주일에 한 번 이상 5 서로 다른 관측 결과 쥐 측정 사이 일관 된로 표시 됩니다.

그림 1 : 소프트웨어 시스템. (A) 소프트웨어 그림의 "인스턴트 Stim" 매개 변수를 설정 하기 위한 단계를 제어. 배경 사진에서 설치 클릭 | 인스턴트 Stim. 작은 팝업 창 (전면 사진)에 매개 변수를 설정 합니다. (B) "시퀀서" 설치 보기의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 마우스 설치. 마 취 동물의 위치 개요입니다. 오른쪽 무릎 클램프는 무릎이 90 °와 90 ° 각도 (점선된 흰색 라인)에 발과 발목에 배치 됩니다. Dorsiflexors 근육의 수축 바로 아래 있는 비 골 신경의 자극에 의해 달성 된다 (에 원심) 비 골의 머리. 우리가 사용 하는 맞춤형 전극 (삽입 된); 그러나, 단위, 제공 되거나 별도로 구입한 바늘 전극 충분 한 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 전극의 배치에서 출력. 일단 전극은 피부 아래에 위치 하 고 전압 시작, 음수 값으로 봉우리 관찰 된다. 이 시점에서 음수 값 (녹색 라인)에 도달 자극에 dorsiflexor 근육만 (TA, EDL, EHL) 달성 된다 확인 하는 중요 한 단계입니다. 실시간 측정 사이 두 개의 빨간 라인 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 대표 곡선. (A) 60 Hz (마우스 #06)에서 힘 곡선의 샘플. (B) 150 hz (마우스 #03) tetanic 곡선의 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 대표 강제로 주파수 곡선 (FFC) 및 곡선 데이터 아래 지역. (A) FFC (x 축) 이상 5 가지 timepoints (1, 2, 3, 4, 및 5 주) 샘플 마우스 (#05). 5 다른 timepoints에 FFC의 곡선 (AU, y 축)에서 (B) 영역 (각각; #01, 02, 03, 04, 05, 그리고 06, 마우스 x 축). 결과 평균 ± 표준 오차 6 쥐에 있는 5 timepoints (테스트)의 측정 (SEM)으로 표현 되 고 일방통행 ANOVA로 분석 되었다 테스트 (p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

토론

정확 하 고 반복 가능한 방식으로 최대한 근육 수축 기능의 측정은 유전, 대사의 진보적인 평가 및 근육 조건¹⁷를 중요 합니다. 마찬가지로, vivo에서 근육 수축 기능 소설 치료 및 근육 상태를 쇠 약에 대 한 치료제의 평가 대 한 수 있습니다. 여기의 vivo에서 프로시저를 통해 마우스 낮은 hindlimb dorsiflexor 근육의 무력 생산의 측정을 설명합니다.

상업 시설 효율적이 고이 비-침략 적 절차를 수행 하는 데 도움이 있습니다. 이 테스트는 혈액에 공급 하 고 신경 분포 그대로 남아 원래 생리 환경 유지 하면서 근육 수축 기능 평가에 관련 된 중요 한 이점이 있습니다. 다른 한편으로, 그것의 불리는 단면적만 실험 후 수확은 고립 된 근육에 ascertained 수 있는 근육 (특정 힘), 십자가 단위 당 힘의 관련이 있습니다. 그러나, 비-침략 적 테스트 여러 측정 가능 flexor 근육의 수축 기능의 같은 동물에 시간이 지남에 목표 상대 변경 (평가 하는 경우에 특히 요구 되는 실험 동물의 감소 번호 결과 시간이 지남에 따라 절대적인 힘의 변화)입니다.

이 절차는 timepoints를 통해 일관 된 데이터를 달성 하기 위해 고려 되어야 하는 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 하나 동물 위치 가능한 표준화 하려고 한다. 둘째, 그것을 설정 하는 동안이 최적의 자극 비 골 신경의 자극을 통해 도달 될 수 있도록 전극 위치와 일치 해야 합니다. 전극의 위치 (그림 2) 다리의 측면 아래로 더 비 골의 머리 및 다른 (이 경우 오른쪽) 다리의 측면 쪽에 있어야 한다. 이에 따라, 주문 품 전극 설계 되었습니다 자체로 둘 다 배치 될 수 있습니다 같은 위치에 때마다. 그러나, 충분 한 자극 또한 얻을 수 있습니다 상업 기구와 함께 제공 된 전극 바늘을 사용 하 여. 셋째, 그것은 시계 방향으로 돌려 footplate에 연결 된 변환기 전압 설치 하는 동안 부정적인 봉우리를 달성 하기 위해 중요 한입니다. 최대 전압 설정으로 마우스 다리 전극의 위치 정확한 시간이 지남에 같은 마우스에 수행할 수 있는 기술 보이고 있다.

평가 같은 동물에 다른 timepoints에서 근육의 기능을 추적 하는 능력은 다른 근육 질병 뿐만 아니라 그들의 진행 하는 중요 한 평가 이다. 또한, 쥐에 있는 근육 dorsiflexion이이 측정 최소 대사 스트레스¹²기본 생리 환경에 잠재적인 치료의 효능을 평가 하는 도구 수 있습니다. 따라서, 그것은 근육 질병의 진행 및 잠재적인 치료 평가 기법을 제공 한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse	Aurora Scientific Inc.	305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus	Complete muscle function system
Conductive gel	Livingstone	ECGEL250	conductive gel used in the mice
Eye ointment	Alcon	Poly Visc	pharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)	Ilium	Metacam	veterinary medicine (injectable 5mg/ml)
Isoflurane	Zoetis	Isoflo	veterinary inhalation Anaesthetic