Evaluación no invasiva de la función muscular de los dorsiflexores en ratones

Resumen

Medición de la función contráctil del músculo esquelético roedor es una útil herramienta que puede utilizarse para seguir la progresión de la enfermedad, así como eficacia de la intervención terapéutica. Describimos aquí la evaluación no invasiva, de en vivo de los músculos dorsiflexores que puede repetirse en el tiempo en el mismo ratón.

Resumen

Evaluación de la función contráctil del músculo esquelético es una medición importante para ambos clínicos y con fines de investigación. Numerosas condiciones pueden afectar negativamente al músculo esquelético. Esto puede resultar en una pérdida de masa muscular (atrofia) o pérdida de calidad de músculo (reducción de fuerza por unidad de músculo masa), los cuales son frecuentes en la enfermedad crónica, enfermedad de músculo-específica, inmovilización y envejecimiento (sarcopenia). Función del músculo esquelético en los animales puede evaluarse por una gama de diferentes pruebas. Todas las pruebas tienen limitaciones relacionadas con el entorno de pruebas fisiológico y la selección de una prueba específica a menudo depende de la naturaleza de los experimentos. Aquí, describimos una técnica no invasiva in vivo, que implica una evaluación útil y fácil de fuerza-curva de frecuencia (FFC) en ratones que se pueden realizar en el mismo animal con el tiempo. Esto permite el seguimiento de la progresión de la enfermedad y la eficacia de un tratamiento terapéutico potencial.

Introducción

Músculo esquelético es un tejido metabólico importante que comprende aproximadamente el 40% del peso corporal total. Desempeña un papel crucial en el control del metabolismo y la homeostasis de energía¹. Músculo esquelético masa se mantiene por un equilibrio entre las tasas de síntesis y degradación de proteínas¹. Numerosas condiciones de enfermedad afectan estos procesos en el músculo esquelético, llevando a una pérdida neta de masa muscular (atrofia). Estos incluyen, pero no se limitan a, envejecimiento cáncer, SIDA, ayuno y extremidad inmovilización^2,3. En el envejecimiento de la población, pérdida de fuerza se asocia con una pérdida de músculo masa y es un predictor de mortalidad de todo-caso⁴. En este contexto, evaluación de la función muscular proporciona una medida importante para determinar la eficacia de estrategias terapéuticas para combatir o prevenir la pérdida de músculo esquelético y la pérdida de función.

Los investigadores han utilizado muchos diferentes enfoques y modelos animales para comprender las vías moleculares de la atrofia de músculo^5,6 y las implicaciones de estos mecanismos en la función contráctil del músculo^{2,3 ,7}. Por lo tanto, correlacionar cambios en el nivel molecular a las diferencias en función de la musculatura es imprescindible entender cómo cambios en el nivel moleculares pueden afectar la funcionalidad del músculo.

Función del músculo esquelético, especialmente en pequeños roedores, por lo general se realiza utilizando tres procedimientos bien^8,9 detectar fuerza producción deteriorada o controlar la progresión de la enfermedad. (1) ex vivo; donde músculo es extraído del animal y se incuban en solución de Ringer del baño para evaluar la función muscular mediante la estimulación de campo¹⁰. (2) In situ; donde la fijación proximal del músculo permanece en el animal y el tendón distal está conectado a un transductor de fuerza, lo que permite la función de músculo para realizarla de la estimulación directa del nervio¹¹. (3) In vivo; donde los electrodos se colocan subcutáneamente para obtener evocados nervio músculo fuerza producción^9,12. Mientras que estos tres procedimientos se utilizan para distintos fines, cada uno poseen ventajas y desventajas. Por lo tanto, es importante seleccionar un método apropiado basado en el objetivo del estudio. La principal limitación con ex vivo experimentos es la eliminación de músculo de su ambiente normal y el uso de la estimulación de campo. El método in situ mantiene un suministro normal de sangre y utiliza estimulación a través del nervio, pero se altera la anatomía normal y la naturaleza del experimento es terminal; así, esto hace que las mediciones de la función muscular seguimiento imposible. El método in vivo aquí descrito más estrechamente imita normal fisiología en que la anatomía es imperturbada, el paquete neuromuscular se mantiene intacto y el experimento no es terminal, permitiendo que las medidas de seguimiento dentro de los mismos animales en tiempo de⁸.

Aquí, describimos un procedimiento in vivo que permite múltiples mediciones de la función muscular en el mismo animal con el tiempo. Este procedimiento consiste en la evaluación de los músculos del compartimento crural anterior, incluyendo el anterior(TA) tibial extensor digitorum longus (EDL) y extensor hallicus longus (EHL) los músculos, responsables de dorsiflexión — en un procedimiento no invasivo por el estímulo (también conocido como) del nervio fibular. La TA proporciona la mayor parte de la fuerza para tobillo dorsiflexión¹³, con sólo un mínimo aporte por la EDL y EHL eso movimiento de control de los dedos del pie. Este protocolo no terminal garantiza la preservación de la fuente del nervio y sangre. Esto permite la investigación de la eficacia de evolución y tratamiento de la enfermedad con el tiempo en el ambiente más fisiológico actualmente disponible en un modelo animal.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Deakin Animal (proyecto #G19/2014).

1. equipo instalación

1. Asegúrese de que todas las máquinas están correctamente conectadas.
2. Encienda el ordenador, el estimulador de bifásico de alta potencia y sistema de palanca dual-mode.
3. Ajustar la abrazadera de rodilla de ratón en la plataforma, así como de la placa-base de ratón en el transductor.
4. Encender la plataforma de calentamiento a 37 ° C.
5. Abra el software de control muscular dinámico en el escritorio.
   Nota: Este es el software necesitado para realizar pruebas funcionales.

2. software y configuración del modelo

1. Una vez abierto el programa (figura 1), calibrar el transductor y seleccione Setup | Mis instrumentos | Calibrar.
2. En el botón "Configuración", seleccione InstantStim y cambiar los parámetros de "Tiempo de ejecución" a 120 s (figura 1A).
   Nota: Voltaje óptimo puede lograrse también por realizar contracciones solo, configurar manualmente o a partir de la InstantStim tantas veces como sea necesario.
3. En la ventana tipo capaz con la etiqueta "Autoguardar Base" para introducir el nombre del auto guardar ubicación de archivo (por ejemplo,, mouse1-fecha-timepoint1). Haga clic en la casilla de verificación a la izquierda de la ventana "Base de autoguardado" y cambiar a Activar Autoguardar.
4. En la parte superior del control DMC pantalla ir a secuenciador, que se abre una nueva pop-up ventana. Seleccione Secuencia abierta y seleccione el protocolo predefinido para ser utilizados (figura 1B). Haga clic en secuencia de carga de | Cerrar ventana.
   Nota: Este paso se utiliza para generar una prueba de curva de frecuencia (FFC) fuerza (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz).
5. Coloque el botón "RANGE" en 10 mA sobre el estimulador bifásico.
   Nota: Asegúrese que el botón de "ADJUST" (abajo a la derecha siguiente) está en cero. Este ajuste fino permite la configuración de los electrodos.

3. ratón configuración

Nota: Todas las medidas de fuerza fueron realizadas en ratones machos de tipo salvaje (C57BI/6) a las 12 semanas de edad.

1. Coloque cada ratón en la cámara de anestesia con un caudal de oxígeno de 1 L/min con 5% isoflurano (por inhalación de la nariz) hasta que el ratón pierde la conciencia. Confirmar la anestesia adecuada a través de la pérdida del reflejo del pie.
2. Quite todo el pelo de la pata derecha del ratón afeitado con cortapelos eléctrico.
3. Coloque el animal en posición decúbito supina en la plataforma calentada y limpie la pierna derecha (se puede utilizar cualquiera de los lados) con alcohol al 70% y yodo. En este punto, ajuste el isoflurano al 2% (con flujo de oxígeno a 1 L/min) y aplicar el gel conductor sobre la piel donde se colocarán los electrodos.
   Nota: Utilizar una sonda de temperatura rectal para monitorear la temperatura del cuerpo durante el procedimiento y aplicar ungüento de ojo para evitar cualquier sequedad o daño a los ojos.
4. Colocar el pie sobre la placa base y fíjela con cinta médica. Abrazadera para la rodilla para estabilizar e inmovilizar la pierna durante el procedimiento.
   Nota: Algunos estudios han descrito utilizando un pasador muy fino insertado a través de la tibia proximal (posterior a los músculos dorsiflexors)¹² estabilizador. Este protocolo se opta por una pinza, ya que esto proporciona suficiente estabilización sin compresión o daños innecesarios a la rodilla. La abrazadera también evita la inflamación potenciales que pueda crear un pin trans-osea, mientras sigue permitiendo el gravamen exacto de la contractilidad muscular. Además, la abrazadera de rodilla de ratón ha sido usado con éxito¹⁴.
5. En este punto, utilice las perillas en la plataforma para colocar la trasera del ratón para que haya un ángulo de 90° en el tobillo (figura 2).

4. optimización de la posición de los electrodos

1. Una vez que el ratón se coloca sobre la plataforma, coloque los electrodos bajo la piel (subcutánea) en la pierna derecha.
   Nota: Este es un paso crucial, y reposicionamiento de algunos puede ser necesario para obtener la posición deseada durante la instalación paso 4.4.
2. Coloque los electrodos en la parte lateral de la pierna derecha; coloca uno cerca de la cabeza del peroné y el otro electrodo más distal en el lado lateral de la pierna (figura 2).
   Nota: Un sistema de electrodos a medida está diseñado para optimizar este paso. Sin embargo, esta prueba puede realizarse con agujas de electrodos proporcionadas por el fabricante en este sistema.
3. Una vez que estos pasos se logran, en el estimulador de bifásico de alta potencia Ajuste el botón etiquetado como "Ajuste" como sea necesario para obtener una estimulación del nervio peroneo que se traduce en máxima dorsiflexión par.
   Nota: Para los ratones de tipo salvaje adulto, esta gama es menos de 2 mA; sin embargo, esto puede ser dependiente en el tamaño, edad y sexo del animal. La producción de fuerza (los picos de las curvas) debe aumentarse lentamente hasta que se alcanza la fuerza máxima.
4. Durante la estimulación, gire el transductor para producir valores negativos (figura 3), que son importantes para asegurar que los electrodos están estimulando sólo los músculos dorsiflexores por nervio peroneal. Una vez que este paso se logra, estabilizar los electrodos mediante una pinza, evitando cualquier movimiento durante el procedimiento.
   Nota: Los picos lentamente aumentará en magnitud, y el amperaje máximo se determina como el nivel en que tres o más estímulos consecutivos producir en contractilidad idéntica. Resistir girar el amperaje más de lo necesario; el amperaje máximo estimulará la vecinos y potencialmente músculos antagonista se contraigan, provocando contracción de Co, que puede generar picos de valores positivos.
5. Detener el instante Stim en el software.
6. En la pantalla principal, gire el botón etiquetado como "Secuencia de inicio" para iniciar la secuencia de configuración anterior (como se describe en el paso 2.4).

5. fin del procedimiento

1. Una vez que terminen las medidas de fuerza, retire los electrodos, suelte la abrazadera de la rodilla y retirar la cinta de pie.
2. Apague el isoflurano y mantener oxígeno durante unos minutos, ayudando a la recuperación del animal. Una vez que el ratón se comience a mover o recupera la conciencia y puede uno mismo-a la derecha, volver el ratón a su jaula.
   Nota: Una droga antiinflamatoria nonsteroidal (NSAID) puede ser inyectada por vía subcutánea (meloxicam de 1 mg/kg) para evitar cualquier molestia o dolor después del procedimiento.

6. Análisis de datos

1. Abra el software de análisis de datos.
2. Ir a Alto rendimiento (parte superior izquierda de la pantalla). Seleccione Frecuencia fuerza para analizar lo anterior descrito secuencia de configuración.
3. Seleccione Manual y cambie el valor de "Cursor de extremo" 3. También seleccione Eliminar de la base.
4. Haga clic en Seleccionar archivos para acceder al procedimiento previamente y a continuación, haga clic en analizar. En este punto el resultado se puede acceder en la pantalla o exportado a una hoja de cálculo para mayor análisis o cálculos.
   Nota: Los datos fueron medidos en mN; sin embargo, el esfuerzo de torsión puede calcularse multiplicando el valor de la fuerza por la longitud del brazo de palanca (fuerza absoluta). Si la normalización es necesaria (fuerza específica), par puede normalizarse al peso corporal, o experimentos terminales se pueden realizar para recoger la masa muscular de edad comparable.

Resultados

La curva de fuerza-frecuencia es una prueba útil en el cual los músculos pueden ser estimulados por frecuencias inferiores y superiores para distinguir fuerza subóptima y óptima respuesta¹⁵. La fuerza en frecuencias más bajas puede estimular una contracción individual, activando unidades menos y más pequeño motores, y en frecuencias más altas se llega a un pico estable, donde aisladas contracciones fusionados (tétanos), llegando a fuerza máxima a través de la activación de todas las unidades de motor¹⁶ . En la prueba presentada, la curva tetánica comienza a ~ 60 Hz, donde se puede visualizar la potenciación (Figura 4A) y la fuerza máxima se determinan a ~ 150 Hz (Figura 4B), cuando se alcanza la meseta con una curva fundido terminado^{9, 16}.

Cualquier variación de estos resultados puede indicar que los músculos no son ser estimulados adecuadamente por los electrodos. Colocación del electrodo es un paso importante en la preparación de este procedimiento, como la estimulación eléctrica debe estar correctamente colocada para inervan el nervio peroneo y así activar completamente los músculos de la dorsiflexión, cual provee (TA, EDL y EHL). Correcta colocación del electrodo resulta en la generación de picos negativos (figura 3) durante este proceso, mientras que el desalineamiento de los electrodos o mayor amperaje puede conducir a la estimulación de la que rodea los músculos, causando la contracción de la los vecinos, los músculos y los músculos del antagonista, que a su vez genera picos de valores positivos.

Figura 5A muestra los datos de curva de frecuencia fuerza representativa de un ratón a través del tiempo, donde el procedimiento se repitió una vez por semana hasta 5 puntos de tiempo fueron terminados. Estas observaciones han mostrado fuerza constante valores de producción a lo largo de los puntos de tiempo y/o observaciones medidos. Este procedimiento también ha demostrado para ser consistente entre mediciones de ratones, como figura 5B muestra al representante área bajo la curva de la FFC estimulado más de 5 diferentes observaciones en 6 ratones probadas una vez por semana.

Figura 1 : Sistema de software. (A) ilustración del software de los pasos para configurar los parámetros de "Stim instantánea" de Control. En la foto de fondo, haga clic en Setup | Stim instantánea. El pequeño apareció una ventana (foto anterior), configure los parámetros. (B) ilustración de la vista de configuración de "Secuenciador". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Configuración de ratón. Resumen de la posición del animal anestesiado. La abrazadera de la rodilla derecha se coloca para que la rodilla es de 90° y para que el pie y el tobillo están en ángulos de 90° (línea blanca punteada). Contracción de los músculos dorsiflexors se logra por estimulación del nervio peroneo, que se encuentra justo por debajo (distal) la cabeza del peroné. Usamos electrodos personalizados (recuadro); sin embargo, los electrodos de aguja que son proporcionados con la unidad, o comprados por separado, también son suficientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Salida de la colocación de los electrodos. Una vez que los electrodos se colocan debajo de la piel y la tensión se inicia, se observan picos con valores negativos. En este punto, llegando a valores negativos (líneas verdes) es un paso crucial en asegurarse de que la estimulación se logra en los dorsiflexores músculos solamente (TA, EDL y EHL). Se indica la medición en tiempo real entre las dos líneas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Curvas representativas. (A) muestra de la curva de fuerza en 60 Hz (ratón #06). (B) muestra de la curva tetánica en 150 Hz (ratón #03). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Representante de la fuerza área debajo de los datos de la curva y curva de frecuencia (FFC). (A) FFC (eje x) sobre 5 diferentes puntos de tiempo (semanas 1, 2, 3, 4 y 5) en un ratón de muestra (#05). (B) área bajo la curva (AU, eje y) de la FFC en 5 horarios diferentes (ratón #01, 02, 03, 04, 05 y 06, respectivamente; eje x). Resultados se expresan como media ± error estándar de medición (SEM) de cinco puntos de tiempo (las pruebas) en 6 ratones y fueron analizados por ANOVA unidireccional prueba (p < 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Discusión

Medición de la función contráctil muscular máxima en forma precisa y repetible es crítica para la evaluación progresiva de los genéticos, metabólicos y musculares condiciones¹⁷. Del mismo modo, la función contráctil del músculo in vivo permite la evaluación de nuevos tratamientos y terapias para afecciones musculares debilitantes. Aquí demostramos la medición de la producción de fuerza de los músculos dorsiflexores de trasera inferior del ratón a través de un procedimiento in vivo.

Aparatos comerciales son eficientes y útiles en la realización de este procedimiento no invasivo. Esta prueba proporciona importantes ventajas relacionadas con la evaluación de la función contráctil del músculo mientras que preserva el medio ambiente fisiológico nativo, en el cual la sangre suministro e inervación permanecen intactos. Por el contrario, sus desventajas están relacionadas con normalización de la fuerza por unidad de la Cruz área transversal del músculo (fuerza específica), que sólo puede determinarse en un músculo aislado que se cosecha después de la experimentación. Sin embargo, la prueba no invasiva permite múltiples mediciones de la función contráctil de los músculos flexores en el mismo animal con el tiempo, resultando en números reducidos de animales de experimentación se requiere, especialmente si el objetivo es evaluar cambios relativos ( cambios en la fuerza absoluta en el tiempo).

Hay pasos importantes que deben considerarse durante este procedimiento para obtener datos consistentes sobre los puntos de tiempo. En primer lugar, uno debe intentar estandarizar posicionamiento animal siempre que sea posible. En segundo lugar, durante la puesta en marcha es importante ser constante con electrodo posición de manera que la estimulación óptima puede llegar a través de la estimulación del nervio peroneo. La ubicación de los electrodos debe estar en el lado lateral de la pierna (en este caso la derecha), cerca de la cabeza del peroné y otras más abajo en el lado lateral de la pierna (figura 2). En base a esto, los electrodos a medida están diseñados como tal que ambos pueden colocarse en la misma posición cada vez. Sin embargo, estimulación suficiente puede también lograrse utilizando las agujas electrodo proporcionadas de los aparatos comerciales. En tercer lugar, es crucial lograr picos negativos durante la configuración de voltaje girando el transductor conectado a la placa base. Correcta colocación de los electrodos de la pata de ratón con configuración máxima tensión ha demostrado ser una técnica que puede realizarse en el mismo ratón, con el tiempo.

La capacidad para evaluar y seguir la función muscular en diferentes puntos de tiempo en el mismo animal es una evaluación importante caracterizar enfermedades musculares diferentes, así como su progresión. Además, esta medida de dorsiflexión músculo en ratones puede ser una herramienta para evaluar la eficacia de los tratamientos posibles en un ambiente fisiológico nativo, con estrés metabólico mínimo¹². Por lo tanto, proporciona una técnica para evaluar el tratamiento de la enfermedad, su evolución y potencial muscular.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse	Aurora Scientific Inc.	305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus	Complete muscle function system
Conductive gel	Livingstone	ECGEL250	conductive gel used in the mice
Eye ointment	Alcon	Poly Visc	pharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)	Ilium	Metacam	veterinary medicine (injectable 5mg/ml)
Isoflurane	Zoetis	Isoflo	veterinary inhalation Anaesthetic