הערכה בלתי פולשני של תפקוד השרירים Dorsiflexor בעכברים

Summary

מדידה של הפונקציה כויץ מכרסמים שרירי השלד הוא כלי שימושי, יכול לשמש כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה, כמו גם היעילות של התערבות טיפולית. נתאר כאן את פולשני, אין ויוו ההערכה של השרירים dorsiflexor שיכול לחזור לאורך זמן העכבר באותו.

Abstract

הערכה של הפונקציה כויץ שרירי השלד הוא מדידה חשוב עבור שני קליני לצרכי עיון ומחקר. תנאים רבים יכולים להשפיע לרעה על שרירי השלד. התוצאה יכולה להיות אובדן מסת השריר (ניוון) ו/או אובדן של איכות שריר (מופחת כוח לכל יחידה של שריר המונית), אשר שניהם נפוצים מחלה כרונית, מחלות שרירים ספציפיים, קיבעון, הזדקנות (sarcopenia). ניתן להעריך תפקוד השרירים השלד בבעלי חיים על ידי מגוון של בדיקות שונות. כל הבדיקות יש מגבלות הקשורות סביבת הבדיקות פיזיולוגיים, הבחירה של מבחן מסוים לעתים קרובות תלוי באופי של הניסויים. כאן נתאר שיטת פולשני ויוו, מעורבים הערכה מועיל וקל של כוח תדירות העיקול (מועדון כדורגל) בעכברים שניתן לבצע על החיה אותו לאורך זמן. זה מאפשר ניטור של התקדמות המחלה ו/או יעילות של טיפול פוטנציאלי.

Introduction

שרירי השלד הוא רקמות מטבולי חשוב שכוללת כ 40% ממשקל הגוף הכולל. זה משחק תפקיד מכריע בבקרה על חילוף החומרים, הומאוסטזיס אנרגיה¹. שרירי השלד מסה נשמר על ידי איזון עדין בין המחירים של חלבון סינתזה והשפלה¹. תנאי מחלה רבים להשפיע על תהליכים אלה בשרירי השלד, מוביל לאובדן נטו במסת השריר (ניוון). אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, סרטן, איידס, הזדקנות, צום, ואיברים הנייח^2,3. בהזדקנות האוכלוסייה, אובדן כוח מזוהה עם איבוד שריר המונית, והוא מנבא של כל מקרה תמותה⁴. בהקשר זה, הערכה של תפקוד השרירים מספק אמצעי חשוב בקביעת היעילות של אסטרטגיות טיפוליות לחימה ו/או למנוע שריר השלד ואובדן של הפונקציה.

חוקרים השתמשו הרבה גישות שונות ודגמים בעלי חיים כדי להבין מסלולים מולקולריים של שרירים-ניוון-^5,-⁶ ועל ההשלכות של מנגנונים אלה על השריר הפונקציה כויץ^{2,3 ,7}. לכן, התאמת שינויים ברמה המולקולרית כדי הבדלים בתפקוד השריר הכרחי בהבנה כיצד שינויים ברמה המולקולרית יכולים להשפיע שריר פונקציונליות.

תפקוד שרירי השלד, במיוחד אצל מכרסמים קטנים, מתבצעת בדרך כלל באמצעות הליכים היטב תיאר שלושה^8,9 לזהות ליקויי כוח הייצור ו/או לפקח על התקדמות המחלה. (1) ex-vivo; איפה שריר להסיר את החיה, מודגרות בפתרון אמבט רינגר כדי להעריך את תפקוד השרירים באמצעות גירוי שדה¹⁰. (2) באתרו; כאשר הקובץ המצורף הפרוקסימלית של השריר נשאר החיה ו דיסטלי הגיד מחובר מתמר כוח, המאפשר תפקוד השרירים שיש לבצע על ידי גירוי עצבי ישיר¹¹. (3) In vivo; היכן אלקטרודות ממוקמים subcutaneously להשיג עורר עצב שריר כוח הייצור^9,12. בעוד שלושה הליכים אלה משמשים למטרות שונות, הם אחד יש יתרונות וחסרונות. לכן, חשוב לבחור שיטה המתאימה בהתבסס על מטרת המחקר. המגבלה העיקרית עם ex-vivo ניסויים היא הסרת השריר מהסביבה הרגילה שלו והשימוש של שדה גירוי. השיטה באתרו שומרת על הספקת דם נורמלי ומשתמש גירוי דרך העצב, אך האנטומיה נורמלי היא שונה ומה טיבה של הניסוי מסוף; לכן, זה הופך את השריר מעקב תפקוד מדידות בלתי אפשרי. אין ויוו השיטה המתוארת כאן בצורה הקרובה ביותר מחקה נורמלי פיזיולוגיה בזה האנטומיה ללא הפרעה, הצרור neuromuscular נותר ללא פגע, ואינה הניסוי מסוף, המאפשר אמצעי מעקב בתוך אותה חיה על זמן⁸.

כאן, אנו מתארים הליך ויוו מאפשרת מדידות מרובות של תפקוד השרירים החיה אותו לאורך זמן. הליך זה כרוך את ההערכה של השרירים של תא crural קדמית — לרבות השוקתי anterior(TA), השריר פושט האצבעות הארוך (EDL), השרירים הארוך (EHL) hallicus פושט, אחראי dorsiflexion — בהליך פולשני על ידי גירוי (הידוע גם בשם) שיתוק בעצמות הרגל. ת א מספק את מרבית הכוח עבור הקרסול dorsiflexion¹³, עם רק מינימלי התרומה על ידי אדי EHL את התנועה שליטה של האצבעות. פרוטוקול שאינו-מסוף זה מבטיח שימור אספקת העצבים והדם. דבר זה מאפשר החקירה של יעילות האבולוציה וטיפול המחלה לאורך זמן בסביבה פיזיולוגית הכי זמין כעת במודל חיה.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי ועדת האתיקה של חיה אוניברסיטת דיקין (פרויקט #G19/2014).

1. ציוד התקנה

1. ודא כי כל המכונות מחוברים כראוי.
2. הפעל את המחשב, את ממריץ דו פאזי ובעוצמת ומערכת מצב כפול המנוף.
3. להגדיר את המלחציים הברך העכבר על הרציף, כמו גם את footplate העכבר על transductor.
4. להפעיל את הפלטפורמה חימום כדי 37 מעלות צלזיוס.
5. פתח את תוכנת שליטה שריר דינאמיים על שולחן העבודה.
   הערה: זהו התוכנה הדרושה לביצוע בדיקות פונקציונליות.

2. ההתקנה מודל ותוכנה

1. לאחר פתיחת התוכנית (איור 1), לכייל המתמר ובחר ההתקנה | הכלים שלי | כיול.
2. לחצן "הגדרת", בחר ' InstantStim ' לשנות את הפרמטרים "זמן לרוץ" ל 120 s (איור 1 א').
   הערה: מתח אופטימלית גם יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע אחד מפרכס, הגדרת באופן ידני או מתחיל את InstantStim כמה פעמים לפי הצורך.
3. בחלון סוג-אייבל שכותרתו "שמירה אוטומטית הבסיס" קלט את השם של הרכב שמור מיקום הקובץ (למשל, mouse1-תאריך-timepoint1). לחץ על תיבת הסימון שבצד החלון "שמירה אוטומטית הבסיס" ולשנות אותו כדי לאפשר שמירה אוטומטית.
4. בחלק העליון של הפקד DMC מסך ללכת הרצפים (sequencer), יפתח עד חלון פופ חדשים. בחרו רצף פתוח , בחר את הפרוטוקול premade להיות בשימוש (איור 1B). לחץ על רצף טעינה | סגור חלון.
   הערה: שלב זה משמש כדי לייצר מבחן תדירות העיקול (מועדון כדורגל) כוח (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 הרץ).
5. הגדר את כפתור "טווח" 10 mA בממריץ דו פאזי.
   הערה: ודא כפתור "התאם" (שלאחר מכן למטה) על אפס. התאמה בסדר זו מאפשרת את ההתקנה של האלקטרודות.

3. העכבר ההתקנה

הערה: כוח כל המדידות בוצעו על זכר פראי-סוג עכברים (C57BI/6) רוב בגיל 12 שבועות.

1. הנח את העכבר כל אל החדר הרדמה עם שיעור זרימת החמצן של 1 ליטר/דקה עם 5% איזופלוריין (via nosecone באינהלציה) עד העכבר מאבד את הכרתו. לאשר הרדמה מספקת דרך אובדן של רפלקס רגל.
2. להסיר את כל השיער על רגל ימין של העכבר על ידי גילוח עם קוצץ שיער חשמלי.
3. למקם את החיה במיקום פרקדן על פלטפורמת מחוממת ולנקות את רגל ימין (משני הצדדים יכול לשמש) עם אלכוהול 70% יוד. בנקודה זו, להתאים את איזופלוריין ל-2% (עם זרימת חמצן ב- 1 ליטר/דקה) ולהחיל את ג'ל מוליך על העור שבה יוצבו אלקטרודות.
   הערה: השתמש בדיקה טמפרטורה רקטלית כדי לפקח על טמפרטורת הגוף במהלך ההליך ולהחיל העין משחה למניעת יובש ו/או נזק לעין.
4. מניחים כף הרגל אל footplate וצרף באמצעות הקלטת רפואי. תהדק את הברך כדי לייצב לשתק את הרגל במהלך ההליך.
   הערה: מספר מחקרים תיארו באמצעות סיכה דק מאוד מוכנס דרך צינתור השוקה (האחורי בשריר dorsiflexors)¹² לספק ייצוב. פרוטוקול זה מעדיף מלחציים, כמו זו מספקת ייצוב מספיק ללא דחיסה/נזק מיותר על הברך. המלחציים גם מונע דלקת אפשרית סיכה הטרנס-osseous שעלולים ליצור, תוך מתן אפשרות הערכה מדויקת של שריר contractility. יתר על כן, המלחציים הברך העכבר כבר בשימוש בהצלחה¹⁴.
5. בשלב זה, להשתמש בידית על הפלטפורמה כדי למקם את hindlimb העכבר כך יש זווית 90 מעלות הקרסול (איור 2).

4. אופטימיזציה של מיקום אלקטרודות

1. ברגע העכבר מושם על הרציף, מקם את האלקטרודות מתחת לעור (תת עורי) ברגל ימין.
   הערה: זהו צעד מכריע, שינוי מיקום מסוימים עשויים להידרש כדי להגיע לתנוחה הרצויה במהלך הגדרת בשלב 4.4.
2. מקם את האלקטרודות על הצד הלטראלי של הרגל הימנית; במקום אחד ליד ראש השוקית האלקטרודה אחרים יש יותר על הצד הלטראלי של הרגל (איור 2).
   הערה: מערכת אלקטרודה מחוייט נועד לייעל את שלב זה. עם זאת, ניתן לבצע בדיקה זו עם מחטים אלקטרודה המסופקים על ידי היצרן במערכת זו.
3. לאחר השלבים מושגות, על ממריץ דו פאזי ובעוצמת להתאים את כפתור שכותרתו "התאם" כפי הנצרך גירוי של שיתוק שתוצאתו dorsiflexion מירבית מומנט.
   הערה: עבור מבוגרים פראי-סוג עכברים, טווח זה הוא פחות מ 2 מא; עם זאת, זה עשוי להיות תלוי על גודל, גיל, מין של החיה. כוח הייצור (פסגות של עקומות) צריך להיות מוגברת לאט עד הכוח המרבי.
4. במהלך גירוי, סובב המתמר בכיוון השעון תשואות ערכים שליליים (איור 3), אשר חשובים להבטיח כי הם האלקטרודות מעורר רק השרירים dorsiflexor על ידי שיתוק. לאחר שלב זה מושגת, לייצב את האלקטרודות באמצעות מלחציים, מניעת תנועה במהלך ההליך.
   הערה: הפסגות יגדל לאט בסולם ריכטר, עוצמת הזרם המקסימלי נקבע כרמת שבו שלושה או יותר ברציפות stimulations לגרום contractility זהים. להתנגד מפנה את עוצמת הזרם גבוהה יותר מהנדרש; עוצמת הזרם המרבית יגרה את השכנה ואפשרות לשרירים אנטגוניסט חוזה, גורמת להתכווצות משותף, אשר ניתן להפיק הפסגות של ערכים חיוביים.
5. עוצרים מיידית שלהם. באינקובטור התוכנה.
6. במסך הראשי, הפעל את לחצן בשם "התחל רצף" כדי להתחיל את הרצף ההתקנה הקודמת (כפי שמתואר בשלב 2.4).

5. סיום ההליך

1. ברגע המדידות כוח גמורים, להסיר את האלקטרודות לשחרר את המלחציים הברך, הוצא את הקלטת רגל.
2. לבטל את איזופלוריין ולשמור על אספקת חמצן לכמה דקות בסיוע התאוששות בעלי חיים. ברגע העכבר מתחילה לזוז ו/או להכרה עצמית ישר, להחזיר את העכבר בכלוב.
   הערה: תרופה אנטי דלקתית nonsteroidal (NSAID) יכול להיות מוזרק subcutaneously (meloxicam 1 מ"ג/ק"ג) כדי למנוע כל אי נוחות ו/או כאב לאחר הניתוח.

6. ניתוח נתונים

1. פתח את תוכנת ניתוח נתונים.
2. ללכת תפוקה גבוהה (מכיוון שמאל למעלה על המסך). בחר תדירות כוח לנתח לעיל תיאר רצף ההתקנה.
3. בחר מדריך ושנה את הערך "קצה הסמן" 3. גם לבחור להסיר תוכנית בסיסית.
4. לחץ על קבצים לבחור לגשת ההליך שבוצעו בעבר ולאחר מכן לחץ על ניתוח. בנקודה זו התוצאה ניתן יהיה לגשת אליהם על המסך או יוצאו גיליון אלקטרוני עבור ניתוח נוסף ו/או חישובים.
   הערה: הנתונים נמדדו ב- mN; עם זאת, ניתן לחשב את מומנט על-ידי הכפלת הערך בכוח אורך הזרוע ידית (כוח מוחלט). אם נורמליזציה הנדרש (כוח מסוים), אפשרות לנרמל את מומנט על משקל הגוף, או ניתן לבצע ניסויים מסוף כדי לאסוף את מסת השריר של גיל מתאימים.

תוצאות

עקומת כוח-תדירות הוא מבחן שימושי שבו השרירים יכול להיות מגורה על ידי תדירויות נמוכות וגבוהות להבחין שיוצרת וכוח אופטימלית תגובות¹⁵. הכוח בתדרים נמוכים יכול לעורר עווית יחיד, הפעלת יחידות פחות, מנוע קטן, ואת בתדרים גבוהים יותר הגיע לשיא יציב, במקום מבודד מפרכס התמזגו (טטנוס), להגיע מקסימום כוח באמצעות הפעלת כל יחידות מוטוריות¹⁶ . המבחן שהוצגו, את מתחילה עקומת tetanic ~ 60 הרץ, היכן ניתן לאבחן את potentiation (איור 4A) ואת הכוח המרבי נקבע ב ~ 150 הרץ (איור 4B), כאשר הרמה עם עקומת מאוחה שהושלמו^{9, 16}.

כל וריאציה של תוצאות אלה עלולים להעיד כי השרירים הם לא להיות כראוי גירוי על ידי האלקטרודות. אלקטרודה השמה היא צעד חשוב בהכנת נוהל זה, כמו גירוי חשמלי להיות ממוקם כראוי כדי innervate את שיתוק ובכך להפעיל באופן מלא השרירים של dorsiflexion, וזה מספק (ת א, אדי ו EHL). הנכונה אלקטרודה מיצוב תוצאות הדור של פסגות שלילי (איור 3) במהלך תהליך זה, ואילו אי-התאמות של אלקטרודות או עוצמת הזרם גבוה יכול להוביל הגירוי של סביב השרירים, גורמת להתכווצות שיתוף השכנה שרירים ושרירים אנטגוניסט, אשר בתורו יוצר הפסגות של ערכים חיוביים.

איור 5A מציג נתונים תדר-עקומת כוח נציג עכבר לאורך זמן, איפה ההליך חזר על עצמו פעם בשבוע עד 5 timepoints הושלמו. תצפיות אלה הראו כוח עקבי ערכי הפקה לאורך timepoints ו/או תצפיות נמדדו. הליך זה הראו גם להיות עקבי בין מדידות עכברים, איור 5B מראה הנציג שטח מתחת העקומה של מועדון כדורגל מגורה יותר מ-5 תצפיות שונות בעכברים 6 נבדק פעם בשבוע.

איור 1 : מערכת תוכנה. (א) לשלוט תוכנות איור של השלבים עבור הגדרת הפרמטרים "סאונד מיידית". על רקע התמונה, לחץ על ההתקנה | סאונד מיידית. על הקטן קפץ חלון (צילום קבלה), הגדר את פרמטרי. (B) איור של תצוגת ההתקנה "ברצף". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : הגדרת העכבר. מבט כולל על המיקום של החיה anesthetized. המלחציים ברך ימין מונחת כך הברך הוא ב- 90 מעלות, כך כף הרגל והקרסול יהיו בזווית 90 מעלות (קו לבן מנוקד). התכווצות של השרירים dorsiflexors מושגת על ידי גירוי של שיתוק, אשר ממוקם ממש מתחת (דיסטלי כדי) ראש השוקית. אנו משתמשים שעוצב אלקטרודות (פנימי); עם זאת, אלקטרודות המחט מסופקים עם היחידה, או לרכוש בנפרד, הן גם מספקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : פלט של מיקום האלקטרודות. לאחר האלקטרודות ממוקמות מתחת לעור, המתח הוא יזם, פסגות עם ערכים שליליים הם נצפו. בשלב זה, להגיע ערכים שליליים (הקו הירוק) היא צעד חיוני לוודא כי הגירוי מושגת dorsiflexor היחיד (ת א, אדי, מהשרירים EHL). המדידה בזמן אמת מסומן בין שני הקווים האדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : נציג עקומות. (א) מדגם של עקומת כוח ב- 60 הרץ (עכבר #06). (B) מדגם של העקומה tetanic ב 150 הרץ (עכבר #03). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : נציג כוח תדירות עקומה (מועדון כדורגל) ואזור תחת הנתונים עקומה. Timepoints (א) טורבין (ציר x) מעל 5 שונים (שבועות 1, 2, 3, 4 ו-5) בעכבר לדוגמה (#05). אזור (B) מתחת העקומה (AU, ציר y) של מועדון כדורגל מעל 5 timepoints שונים (עכבר #01, 02, 03, 04, 05, 06, בהתאמה; ציר x). תוצאות מבוטא זאת אומרת ± שגיאת תקן של מדידה (SEM) של חמש timepoints (בדיקות) בעכברים 6, נותחו על ידי חד-כיווני אנובה מבחן (p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Discussion

מדידה של הפונקציה כויץ שריר מקסימלי באופן מדויק, הדיר חיוני הערכת פרוגרסיבי של גנטי, חילוף החומרים, וכן שריר תנאים¹⁷. באופן דומה, הפונקציה כויץ שריר ויוו מאפשר ההערכה של טיפולים חדשניים הרפוי מתישה שריר תנאים. נדגים בזאת את המדידה של כוח הייצור של השרירים dorsiflexor של העכבר hindlimb התחתון בהליך ויוו.

מנגנוני המסחרי הינו יעיל מועיל בביצוע הליך פולשני. בדיקה זו מספקת יתרונות חשובים הקשורים להערכת הפונקציה כויץ שרירים תוך שמירה על סביבה פיזיולוגיים מקורית, דם אספקת העצבוב נותרו ללא פגע. מצד שני, החסרונות קשורים נורמליזציה של הכוח לכל יחידת לחצות שטח המודולרית של השריר (כוח מסוים), אשר ניתן לקביעה רק בשריר מבודד זה קוצרים לאחר ניסויים. עם זאת, הבדיקה לא פולשנית מאפשרת מדידות מרובות של הפונקציה כויץ של השרירים כופף אותה חיה לאורך זמן, וכתוצאה מכך מספר מופחת של חיות ניסוי להדרש, במיוחד אם המטרה היא להעריך שינויים יחסית ( שינויים בכוח מוחלט לאורך זמן).

ישנם צעדים חשובים כי יש לקחת בחשבון במהלך הניתוח על מנת להשיג נתונים עקבי מעל timepoints. ראשית, אחד לנסות לתקנן בעלי חיים, מיקום במידת האפשר. שנית, במהלך הגדרת את זה חשוב להיות עקבית עם אלקטרודה מיצוב כך גירוי אופטימלי ניתן להגיע באמצעות גירוי של שיתוק. מיקום האלקטרודות צריך להיות על הצד הלטראלי של הרגל (במקרה זה מימין), ראש השוקית, אחרים בהמשך הצד הלטראלי של הרגל (איור 2). על סמך זה, האלקטרודות מחוייט מתוכננים ככזה כי שניהם למקמו במיקום זהה בכל פעם. עם זאת, גירוי מספיק גם ניתן להשיג באמצעות המחטים אלקטרודה סיפק על מנגנוני מסחרי. שלישית, זה הכרחי להשיג את פסגות שלילי במהלך הגדרת מתח על-ידי סיבוב עם כיוון השעון מתמר מחובר את footplate. הנכונה מיקום האלקטרודות הרגל העכבר בהתקנת מתח המרבי הוכיחו להיות טכניקה שניתן לבצע על העכבר אותו לאורך זמן.

היכולת להעריך ולנהל מעקב אחר תפקוד השרירים-timepoints שונה על אותה חיה היא הערכה חשובים לאפיון מחלות שרירים שונים, כמו גם את ההתקדמות שלהם. יתר על כן, מדידה זו של שריר dorsiflexion בעכברים יכול להיות כלי כדי להעריך את היעילות של טיפולים פוטנציאליים בסביבת פיזיולוגיים מקורי, עם מינימום מתח מטבולית¹². לפיכך, הוא מספק שיטה בהערכת הטיפול במחלה, שלה התקדמות, פוטנציאל שריר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse	Aurora Scientific Inc.	305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus	Complete muscle function system
Conductive gel	Livingstone	ECGEL250	conductive gel used in the mice
Eye ointment	Alcon	Poly Visc	pharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)	Ilium	Metacam	veterinary medicine (injectable 5mg/ml)
Isoflurane	Zoetis	Isoflo	veterinary inhalation Anaesthetic