细胞系定量免疫印迹作为常规组织样本中生物标志物蛋白定量免疫荧光定量的标准

摘要

我们描述了使用定量免疫印迹来验证免疫荧光组织学结合图像分析作为一种手段, 定量的蛋白质感兴趣的福尔马林固定, 石蜡嵌入 (ffpe) 组织样本。我们的研究结果证明了免疫荧光组织学在确定常规活检样本中生物标志物蛋白的相对数量方面的作用。

摘要

福尔马林固定、石蜡包埋 (ffpe) 组织样品中感兴趣的蛋白质的定量在临床和研究应用中具有重要意义。定量的最佳方法是准确的, 具有广泛的线性动态范围, 并保持样品的结构完整性, 以便识别单个细胞类型。目前的方法, 如免疫组织化学 (ihc), 质谱和免疫印迹每个不符合这些规定, 由于其分类性质或需要使样品同质化。作为另一种方法, 我们建议使用免疫荧光 (if) 和图像分析来确定 ffpe 组织中感兴趣的蛋白质的相对丰度。在此基础上, 我们证明了该方法易于优化, 产生了广泛的动态范围, 并与定量免疫印迹的黄金标准相比是线性可量化的。此外, 这种方法允许保持样品的结构完整性, 并允许区分各种细胞类型, 这在诊断应用中可能是至关重要的。总体而言, 这是一种用于 ffpe 样品中蛋白质相对定量的可靠方法, 可轻松适应临床或研究需求。

引言

在许多临床领域都需要量化福尔马林固定、石蜡包埋 (ffpe) 组织活检样本中的蛋白质。例如, 使用常规活检标本中生物标志物蛋白的定量来阐明预后, 并为癌症患者的治疗提供信息¹。然而, 目前的方法通常是主观的, 缺乏验证。

免疫组织化学 (ihc) 通常用于病理实验室, 通常依赖于针对目标蛋白的初级抗体和与酶标签 (如辣根过氧化物酶 2) 结合的二级抗体^.常规 ihc 是敏感的, 可以利用微小样本, 并保持组织样本的形态完整性, 从而允许评估其相关的组织学背景下的蛋白质表达。然而, 由于 ihc 产生的显色信号是减法的, 它的动态范围相对狭窄, 多路复用 2^,3^,4的潜力有限。矩阵辅助激光去光/电离质谱成像 (aldi-msi) 保留了形态完整性。然而, 这种开发的技术与适度的形态分辨率相关, 需要进行大量的校准和归一化, 从而损害了其常规临床使用^{的可行性 5, 6,7.}在组织样本中量化蛋白质的替代技术包括免疫印迹^8、质谱^{法 9、10、11}和酶联免疫吸附法 (elisa)¹², 每个其中开始于样品组织的均质裂解物。主要组织样本是异质性的, 因为它们包含多种细胞类型。因此, 需要对样品进行同质化的技术不允许对特定细胞群 (如癌细胞) 中的蛋白质进行定量。

与 ihc 一样, if 适用于小型 ffpe 样品, 并允许保留组织学完整性¹³。然而, 由于荧光信号的加性, if 适用于多种原生抗体和荧光标签的应用。因此, 感兴趣的蛋白质可以在使用其他抗体定义的特定细胞或细胞隔间 (例如, 细胞核与细胞质) 中相对量化。荧光信号也具有更大的动态范围^13,14的优势。研究了^if在ffpe 样品中的优越性、重现性和复用潜力。

在此, 我们描述了使用定量免疫印迹使用已建立的细胞系作为一个黄金标准, 以确定 if 的定量性质, 并结合计算机辅助图像分析, 以确定感兴趣的蛋白质的相对丰度ffpe 组织样本中的组织学切片。我们已经成功地应用了这种方法在多方法量化生物标志物^蛋白在临床活检样本^16,17,^18.

研究方案

使用初级人体组织样本的申请获得了女王大学卫生科学和附属教学医院研究伦理委员会 (hsreb) 的批准。

1. 建立细胞线组织微阵列 (tma)

1. 收获和清洗细胞。
   注: 该议定书已在各种已建立的永生细胞系 (例如hela、jurkat、rch-acv) 上进行了测试。
   1. 对于粘附细胞, 一旦细胞达到约 80%的融合, 就会收获大约 1.3 x 10 7 细胞。使用适合该细胞系的试剂分离细胞。
      注: 乙二胺四乙酸 (edta) 通常比胰蛋白酶更受欢迎, 以降低表面蛋白质降解的风险。如果使用胰蛋白酶, 在收获细胞后立即使用胎儿牛血清 (fbs) 中和胰蛋白酶。
   2. 对于悬浮细胞, 在生长的逻辑阶段收获大约 8 x^{10 7 细胞}。
   3. 在一个50毫升的锥形管中离心 5分钟, 收集收获/分离细胞。
   4. 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 的10毫升中分解上清液并重新悬浮颗粒。在 225 x g 处离心 5分钟, 并将上清液装饰。
      注: 1x pbs 由 137 mm 氯化钠、2.7 mm kcl_、10 mm na 2 hpo 4、1.8 mmkh kh₂po 4 组成;将 ph 值调整为7.4。
2. 将福尔拉林中的细胞固定在一起, 并将其颗粒状。
   1. 将细胞颗粒悬浮在圆锥管内10% 中性缓冲福尔拉林 (nbf) 的 10 ml 中。
      注: nbf 可通过在 1x pbs 的9毫升中稀释37% 甲醛库存溶液的1毫升来制备。
      注意: 在处理福尔拉林和甲醛时要小心。使用烟罩的步骤涉及福尔拉林和甲醛。
   2. 晚上 2 4 0 转, 在室温下过夜 (约 1 7时), 将细胞培养在摇杆上。
   3. 在 pbs 中制备1% 低熔点琼脂糖溶液 (每1毫升 pbs 琼脂糖 0.01 g)。
      1. 为每个细胞系样品准备足够的500μl 琼脂糖溶液。
      2. 将琼脂糖溶解在80°c 的水浴或热块中, 偶尔混合2-5。溶解后, 将溶液保存在37°c 的水浴或热块中, 以防止硬化。
   4. 在 225 x g. 离心 5分钟, 将固定细胞从步骤1.2.2 颗粒, 取出上清液, 并在500μl 的 1x pbs 中重新悬浮细胞。
   5. 将细胞转移到 1.5 ml 的微离心管和颗粒中, 在 290 x g. 将所有上清液吸走5分钟。
3. 在琼脂糖中铸造细胞。
   1. 在每个含有细胞的管中加入 ~ 500μl 的1% 琼脂糖溶液 (从步骤 1.2.3)。轻轻但快速地, 使用 p-1000 微型移液器混合的移液器混合物上下。
      注: 切断移液器尖端的末端, 以扩大光圈, 避免形成气泡。将工作琼脂糖溶液保存在37°c 的水浴中, 以防止硬化。
   2. 允许琼脂细胞溶液在室温下硬化 (5-10)。在每个含有样品的微离心管中加入1毫升的 10% nbf, 并保持在室温下, 直到石蜡嵌入 (长达 24小时)。
4. 准备琼脂糖插头, 用于石蜡嵌入。
   1. 从样本中吸走 nbf。
   2. 使用剃须刀片取出细胞插头, 切割微离心管, 将插头放入塑料纸巾盒。在室温下将盒式磁带存放在 10% nbf 中。
5. 手动或使用自动组织处理器隔夜处理样品, 并使用标准的组织学方法嵌入石蜡中。
   注: 见 fischer等人。¹⁹用于示例协议。
6. 使用专门的 "组织阵列" 仪器, 从每个细胞系的石蜡块中复制0.6 毫米的核心, 并将它们成排地插入一个空的接收石蜡块, 以创建一个细胞系 tma。
   注: 应使用 fedor 和 de marzo²⁰中所述的标准方法。
7. 将代表2-3 个附加组织类型 (如扁桃体、结肠、睾丸等) 的初级样本的核心作为正或负控制纳入 tma。选择适合感兴趣的蛋白质的组织。
8. 使用微体制备细胞系 tma 的两个组织学切片, 厚度约为4至6μm。将该部分安装在组织学幻灯片上, 将其擦干, 然后离开 (如 fedor 和 de marzo^{20 中}所述)。

2. 免疫荧光样品染色

1. 优化原代抗体的稀释。
   注: 对于 fffpe 组织部分, 例如 kajimura 等地, 存在用于优化 ihc 或 if的标准协议.²¹. 这里概述了这一办法的简要概述。
   1. 在制造商的指导下, 准备4-5 稀释感兴趣的蛋白质的原代抗体。
   2. 从动物或人类来源识别一种控制组织类型, 表达在形态上可识别的细胞群中感兴趣的蛋白质。按照标准的免疫组织化学程序, 如 fedor 和 de marzo²⁰中的方法, 准备组织的各个部分并将其安装在幻灯片上。
      注: 所需的切片数是原发抗体稀释的数量加上一个额外的。
   3. 使用自动或手动免疫组织学系统, 从步骤2.1.1 在步骤2.1.2 的幻灯片上测试主要抗体稀释。从额外的幻灯片中忽略初级抗体的应用, 并将其用作负对照。
   4. 在染色过程中, 用 4 ', 6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi) 染色所有滑块作为核反污剂和荧光标记的二级抗体。如果需要更高的灵敏度, 请使用 hrp (辣根过氧化物酶)-共轭二级抗体和基于类型的信号扩增系统 (见 stack等人).¹³)。
      注: 当多路复用初级抗体时, 每种蛋白质都使用不同的荧光标签。
   5. 使用能够使用适合于所使用的荧光的激发和检测波长生成数字图像文件的适当仪器, 扫描免疫染色幻灯片。
   6. 使用适当的软件查看数字图像, 并根据经验选择主要抗体稀释, 以优化信号强度相对于背景荧光。
      注: 如果需要, 可以使用 hrp 共轭二级抗体、3, 3 '-二胺苯胺 (dab) 和明亮场显微镜进行优化。
2. 在细胞系 tma 上进行 if 染色。
   1. 使用自动或手动免疫组织学系统, 用优化的初级抗体稀释 (如步骤2.1 中确定的) 染色细胞系 tma 的幻灯片。从第二张幻灯片中省略初级抗体的应用, 并将其用作负对照。
   2. 在染色过程中, 用 4 ', 6-二胺-2-苯丙二醇 (dapi) 染色所有幻灯片作为核反污剂, 并与步骤2.1.4 的二级抗体和酪胺染色。
   3. 使用能够使用适合于所使用的荧光的激发和检测波长生成数字图像文件的适当仪器, 扫描免疫染色幻灯片。
   4. 使用图像分析软件包来识别感兴趣的细胞隔间 (即细胞质与细胞核), 并量化每个细胞系的平均荧光强度 (mfi)。
      注: 可用于此目的的各种软件包, 许多软件包在 stack等人中进行了讨论。^13岁

3. 细胞系的定量免疫印迹

1. 准备细胞的裂解液。
   1. 收集每个细胞系的200万个细胞, 如 1.1.1 1.1.3 的步骤中所述。
   2. 在 650 x g 的情况下, 在一个50毫升的锥形管中旋转细胞5分钟。欺骗上清液。
   3. 用10毫升的冰凉 pbs 清洗细胞。在1毫升的冰凉 pbs 中进行再利用, 并转移到 1.5 ml 的微离心管中。按步骤离心 3.1.2, 装饰, 并将细胞留在冰上。
   4. 加入约200μl 的冷放射免疫沉淀 (ripa) 裂解缓冲液与蛋白酶抑制剂 (10μl 的100x 抑制剂每毫升的 ripa 裂解缓冲液) 到细胞, 涡旋和孵育在冰上15分钟。
      注: 有效裂解所需的裂解缓冲量因细胞系而异, 可根据经验确定。ripa 缓冲液由 150 mm 氯化钠、5 mm edta、50 mm tris、1.0% np-40、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% 蒸馏水中的 sds 组成。
   5. 为了确保免疫细胞的负载相对均匀, 请使用适当的方法 (如 bradford 检测) 对每个裂解物中20μl 样本中的总蛋白质进行量化。在每个细胞裂解液的剩余部分 (约 180μl) 中加入约40μl 的 6x laemmli 裂解缓冲液, 并在100°c 的高温下在热块或水浴中煮沸5分钟。
      注: 6x laemmli 缓冲液由 300 mm Tris-HCl (ph 6.8)、4% (w/v) sds、60% 甘油、0.6% (w/v) 溴酚蓝、50 mm 二硫醇 (dtt) 组成。
   6. 将样品存放在-20°c, 最长可达两周。
2. 对所有细胞系进行免疫印迹, 以确定哪种细胞系具有最丰富的蛋白质。
   注: 按照马哈茂德, t. 和杨, pc 中描述的过程。²², 但有以下修改。
   1. 将含有10-50 微克蛋白质 (取决于感兴趣的蛋白质的丰度) 的倾斜细胞裂解液 (在步骤3.1 中制备) 进入微离心管。加入2.5μl 的 6x laemmli 缓冲液和足够的 ripa 裂解缓冲液, 使体积达到15μl。
   2. 加载5% 的堆叠和适当的浓度解析 (例如, 10% 的蛋白质在 15-100 kda 之间) sds-page 凝胶与蛋白质阶梯和步骤3.2.1 的样本。将 1x laemmli 缓冲液装入空井。在适当的设置 (通常为 125 v) 下运行电源, 时间为 80分钟, 或直到溴酚蓝色染料到达板底。
   3. 进行半干蛋白转移, 如 wiedemann 等人所述.^23岁
      注: 为了取得具有代表性的结果, 使用了硝化纤维素膜 (不需要浸泡在甲醇中) 和冷比耶鲁姆·沙弗尼尔森 (bsn) 转移缓冲液。bsn 缓冲液由 48 mm tris、39 mm 甘氨酸、20% 的蒸馏水中甲醇组成。
   4. 转移后, 使用剃须刀片水平切割膜, 将含有感兴趣蛋白质的部分与适当的内部控制蛋白 (如 gapdh) 分离。
   5. 使用原代抗体制造商推荐的阻滞剂进行阻滞和抗体孵育。
      注: 最佳的原代抗体稀释可能会因蛋白质的丰度和敏感性而有很大差异。对于以下代表性的结果, 对感兴趣的蛋白质的抗体需要1:1000 稀释, 而 gapdh 控制需要1:40000 稀释。所使用的二级抗体稀释量为1:3000。
   6. 抗体孵育和洗涤膜后, 将膜条放入透明的塑料护套中, 如三明治袋。
   7. 按照制造商的说明制备迷人的化学发光 (ecl) 混合物。使用 p-1000 移液器用 ecl 混合物覆盖膜, 关闭护套, 并在室温下与混合物在黑暗中孵育膜条1-2分钟。
   8. 将膜鞘放置在数字成像平台中。使用化学发光和比色标记检测来捕捉膜的各种暴露。
      注: 暴露时间将根据负载的蛋白质数量、目标蛋白的丰度、抗体亲和力等而有所不同, 从自动接触 (通常为几秒钟) 开始, 并以几秒的增量测试高于和低于的暴露时间。
   9. 经验上, 或使用图像分析软件, 确定哪种细胞系表达的目标蛋白最多。
3. 使用连续稀释法查找每个主要抗体的线性动态范围。
   1. 执行步骤 3.2.1-3.2.8 使用一系列的连续稀释从细胞系, 表达最高浓度的目标蛋白质 (在步骤3.2.9 中确定)。
   2. 使用 imagej 等图像分析软件对曝光图像执行密度测量。
      1. 例如, 使用 imagej, 使用矩形选择工具选择要量化的凝胶的第一条车道。转到分析凝胶选择 "第一条车道"。使用鼠标将生成的矩形移动到下一个车道。转到分析凝胶选择 "下一条车道"。重复将矩形移动到下一个车道, 并为其余车道选择车道。
      2. 转到分析凝胶剧情车道。使用"直线"工具绘制穿过每个峰值的基部的线条, 以消除背景噪声。使用wand工具从 "结果" 窗口中选择每个峰值, 并收集每个峰值的密度 (以下称为波段强度)。
   3. 使用密度测量输出创建带强度与每个初级抗体加载的总蛋白量的散点图。使用最佳拟合和目视检查线, 确定每个抗体的线性动态范围的位置 (强度范围)。
   4. 选择在线性范围的高端生成值的蛋白质浓度, 使其与所有细胞系一起向前移动。
      注: 由于这种浓度低于这种蛋白质含量最高的细胞系中的饱和度水平, 因此不应存在过度暴露其他细胞系的带的危险。
4. 使用所有细胞系3.3.4 步骤中选择的蛋白质浓度进行免疫印迹, 并重复步骤 3.2.1-3.2.8。
   1. 按照步骤3.3.2 在数字扫描上执行密度测量。为步骤3.3.3 中识别的每个抗体选择在线性范围内产生信号的曝光图像。
   2. 利用3.4.1 理想曝光的带强度信号, 计算出每个细胞系的目标蛋白波段强度与负载控制波段强度的比率。这些比率值表示感兴趣的目标蛋白的相对丰度。
   3. 执行 pearson 相关测试 (可以使用统计软件包完成), 以便将 if 染色的图像分析 (步骤 2.2) 中获得的值与免疫印迹 (步骤 3.4.2) 中获得的值相关联。

结果

该方案用于确定 if 在构建 ffpe 组织块的细胞系中确定抗凋亡蛋白 bcl-2 的相对数量的能力。在癌细胞中选择性地量化 bcl-2 可以阐明致癌机制, 并可用于病理诊断和为临床管理决策^{提供信息 24.}更具体地说, bcl-2 在适当的 b 淋巴细胞发育中起着重要作用, 其表达通常在淋巴瘤^25、26、27的背?...

讨论

我们已经描述了一种方法, 利用定量免疫印迹 (ib) 来证明免疫荧光 (if) 的作用, 以确定在 ffpe 组织样本中的目标蛋白的相对丰度。目前的蛋白质定量方法受到其分类性质的限制, 如显色性 ihc2^,3, 或需要对样品进行同质化, 防止对样本结构和细胞群的调查, 如与 ib 和质谱法^8,9,10,

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
697	DSMZ	ACC 42	Cell line
JeKo-1	ATCC	CRL-3006	Cell line
Jurkat	ATCC	TIB-152	Cell line
RCH-ACV	DSMZ	ACC 548	Cell line
Granta-519	DSMZ	ACC 342	Cell line
REH	DSMZ	ACC 22	Cell line
Raji	ATCC	CCL-86	Cell line
HeLa	ATCC	CCL-2	Cell line
Trypsin/EDTA solution	Invitrogen	R001100	For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS)	Wisent Inc.	81150	To neutralize trypsin
Neutral Buffered Formalin	Protocol	245-684	For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	15517-022	For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124	Dako (Agilent)	cat#: M088729-2, RRID: 2064429	To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XT	Roche	-	For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)	Dako (Agilent)	K4000	For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)	Dako (Agilent)	K4002	For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagent	Perkin Elmer	NEL745001KT	For immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScope	Leica Biosystems	-	To view scanned slides
HALO image analysis software	Indica Labs	-	For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)	Thermo Scientific	1862209	To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop	EDT001	For RIPA buffer
NP-40	BDH Limited	56009	For RIPA buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	For RIPA buffer
Glycerol	FisherBiotech	BP229	For Laemlli buffer
Bromophenol blue	BioShop	BRO777	For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0611	For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB001	For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)	Bio-Rad	161-0374	For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper)	Bio-Rad	1703969	For blotting transfer
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115	For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940	For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk)	Cell Signaling Technology	9999S	For blocking buffer
Tween 20	BioShop	TWN510	For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibody	Epitomics	2251-1	Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody	abcam	cat#: ab6789, RRID: AB_955439	Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody	abcam	cat#: ab6721, RRID: AB_955447	Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substrates	Bio-Rad	1705060	For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	29083461	For immunoblot signal detection
ImageJ software	Freeware, NIH	-	For densitometry analysis