JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Abstract

כימות של חלבונים עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE) היא חשובה קלינית ומחקר יישומי. שיטה אופטימלית של כימות מדויק, יש טווח דינמי רחב ליניארי ושומר את השלמות. המבנית של המדגם כדי לאפשר זיהוי של סוגי תאים בודדים. שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC), ספקטרומטר מסה immunoblotting אחד לא לעמוד תנאים אלה בשל טבעם קטגורית או homogenize את הדגימה. כאמצעי חלופי, אנו מציעים את השימוש immunofluorescence (אם) וניתוח התמונה כדי לקבוע את השפע היחסי של חלבון עניין ברקמות FFPE. בזאת אנחנו מדגימים כי שיטה זו ממוטבת בקלות, התשואות טווח דינמי רחב, והוא באופן ליניארי לכימות לעומת תקן הזהב של immunoblotting כמותיים. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת שמירה על שלמות המבנה של המדגם ומאפשר ההבחנה של סוגי תאים שונים, אשר עשוי להיות מכריע ביישומים אבחון. בסך הכל, זהו שיטה חזקה כימות היחסי של חלבונים בדגימות FFPE והוא ניתן להתאים בקלות להתאים קליני או מחקר צרכים.

Introduction

הצורך לכמת חלבונים בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע של דגימות ביופסיה של (FFPE) רקמה קיים בתחומים רפואיים רבים. לדוגמה, כימות של חלבונים סמן בדגימות ביופסיה שגרתית משמש כדי להבהיר פרוגנוזה ולהודיע טיפול עבור סרטן המטופלים1. עם זאת, שיטות הם בדרך כלל סובייקטיבי, חוסר אימות.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמש באופן שגרתי במעבדות פתולוגיה, תלוי בדרך כלל של נוגדן ראשוני מכוונים את חלבון המטרה של נוגדנים משניים מצומדת עם תווית אנזימטי כגון חזרת peroxidase2. IHC קונבנציונלי הוא רגיש, יכול לעשות שימוש של דקה דגימות ושומר על שלמות מורפולוגי של דגימות רקמה ובכך מאפשרת הערכה של חלבון הביטוי בתוך ההקשר היסטולוגית הרלוונטיות שלה. עם זאת, מכיוון שהאות הדפסות כסף שנוצר על ידי IHC מופחתים, הוא סובל טווח דינמי צר יחסית, ומציע פוטנציאל מוגבל ריבוב2,3,4. לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה (MALDI-MSI) שומר על הגינות מורפולוגית. אולם, זו הטכנולוגיה המתפתחת מזוהה עם רזולוציה מורפולוגי צנוע, דורש כיול משמעותית, נורמליזציה, ופוגע שלה היתכנות לשימוש קליני5,6,7. טכניקות חלופיות לכמת חלבון דגימות רקמה כוללים immunoblotting8, ספקטרומטר מסה9,10,11, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)12, כל של שמתחיל עם הומוגני lysate של דגימת רקמה. דגימות רקמה הראשי הם הטרוגנית כי הם מכילים שפע של סוגי תאים. לכן, טכניקות שכרוכים homogenizing את הדוגמאות אינן מתירות כימות של חלבון באוכלוסייה לתא מסוים עניין כגון תאים סרטניים.

כאילו IHC, אם הוא ישים קטן FFPE דוגמאות וההיתרים השמירה של שלמות היסטולוגית13. עם זאת, תודה לטבע מוספים של אותות פלורסצנטיות, אם הוא נוטה היישום של מספר נוגדנים העיקרי ותוויות פלורסנט. לפיכך, חלבון עניין עשוי להיות יחסית לכמת בתוך תאים ספציפיים או תאים סלולריים (לדוגמה, גרעין לעומת הציטופלסמה) המוגדרים באמצעות נוגדנים אחרים. קרינה פלואורסצנטית אותות גם יש את היתרון של13,טווח דינמי גדול14. עליונות הפארמצבטית, ריבוב הפוטנציאל של אם מוחל על דגימות FFPE כבר הפגינו13,14,15.

במסמך זה אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים באמצעות שורות תאים הוקמה כמו תקן הזהב כדי לברר את מהות כמותיים אם בשילוב עם ניתוח תמונות המחשב בסיוע בקביעת שפע יחסי של חלבון עניין ב- סעיפים היסטולוגית של דגימות רקמה FFPE. לנו יש להחיל שיטה זו בהצלחה בגישה מולטיפלקס לכמת חלבונים סמן קליני ביופסיה דגימות16,17,18.

Protocol

האישור לשימוש דגימות רקמה אנושית העיקרי היה מתקבל למדעי הבריאות, המזוהה עם בתי חולים מחקר אתיקה לוח (HSREB) באוניברסיטת קווין.

1. בניית Microarray רקמות של התא-קו (TMA)

  1. הקציר ולשטוף תאים.
    הערה: פרוטוקול זה נבדקו על שורות תאים מונצחים הוקמה שונים (למשל הלה, Jurkat, RCH-ACV).
    1. עבור תאים חסיד, לקצור כ 1.3 x 107 תאים, ברגע שהם יגיעו כ 80% confluency. ניתוק תאים באמצעות ריאגנט המתאים עבור קו תא זה.
      הערה: חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) עדיף בדרך כלל מעל טריפסין כדי להפחית את הסיכון של משפיל חלבונים פני שטח. אם משתמש טריפסין, לנטרל את טריפסין שימוש בסרום שור עוברית (FBS) מיד לאחר הקטיף התאים.
    2. עבור תאים ההשעיה, לקצור כ 8 x 10 תאים7 יומן-שלב הצמיחה.
    3. לאסוף את התאים שנקטפו/מנותק על ידי צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב g x 225 צינור חרוטי 50 מ.
    4. Decant את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב 10 מ ל 1 X באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 225 x g, decant את תגובת שיקוע.
      הערה: 1 X PBS מורכב מ מ 137 NaCl 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, מ מ 1.8 ח'2PO4 במים מזוקקים; להתאים את ה-pH ל 7.4.
  2. לתקן את התאים בפורמלין, גלולה אותם.
    1. להשעות בגדר תא בתוך הצינור חרוט ב 10 מ"ל של 10% פורמלין במאגר נייטרלי (NBF).
      הערה: ניתן להכין NBF על ידי דילול 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד פתרון מניות 9 מ ל 1 X PBS.
      התראה: נקוט זהירות בעת טיפול פורמלין פורמלדהיד. השתמש ברדס fume שלבים פורמלין ופורמלדהיד.
    2. דגירה התאים על כיסא נדנדה ב rpm 24 שעות בטמפרטורת החדר למשך הלילה (כ ג 17).
    3. להכין פתרון 1% של agarose נקודת התכה נמוכה ב- PBS (0.01 גרם של agarose לכל 1 מ"ל PBS).
      1. להכין מספיק בשביל 500 µL של agarose פתרון עבור תא קו דגימה.
      2. להמיס את agarose בבלוק 80 מעלות צלזיוס המים באמבט או חום, עם ערבוב מזדמן למשך 2-5 דקות. ברגע התפרקה, לשמור את הפתרון ב- 37 מעלות צלזיוס המים בלוק אמבט או חום למניעת התקשות.
    4. צניפה תאים קבוע מן צעד 1.2.2 צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב ג x 225 הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 500 ל- PBS 1 x.
    5. להעביר את התאים לתוך צינור 1.5 mL microcentrifuge צנפה מאת צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב x 290 ג לשאוב את כל תגובת שיקוע.
  3. הטיל בתאים agarose.
    1. להוסיף ~ 500 µL של 1% פתרון agarose (מתוך שלב 1.2.3) כל שפופרת המכילות את התאים. בעדינות, אך במהירות, פיפטה תערובת למעלה ולמטה באמצעות micropipette P-1000 לערבב.
      הערה: לחתוך את הקצה של הקצה פיפטה כדי להגדיל את הצמצם ולמנוע יצירת בועות. שמור את הפתרון agarose עובד באמבט מים 37 ° C למניעת התקשות.
    2. לאפשר את הפתרון agarose-תא להקשיח (5-10 דקות) בטמפרטורת החדר. להוסיף 1 מ"ל של 10% NBF כדי microcentrifuge כל צינור המכילה את דגימת ולשמור בטמפרטורת החדר עד פרפין הטבעה (עד 24 שעות).
  4. הכינו את התקע agarose להטבעת פרפין.
    1. . תשאף את NBF מדגם.
    2. הסר את תקע התא באמצעות סכין גילוח כדי לחתוך את הצינור microcentrifuge, למקם את התקע לתוך רקמות פלסטיק קלטת. חנות קסטות ב 10% NBF בטמפרטורת החדר.
  5. לעבד את הדגימות לילה גם באופן ידני או באמצעות מעבד רקמות אוטומטיות, להטביע פרפין בשיטות היסטולוגיה סטנדרטי.
    הערה: ראה פישר ואח. 19 עבור פרוטוקול דוגמה.
  6. באמצעות מיוחדת "רקמת arrayer" כלי, קציר כפולים ליבות 0.6-מ מ מ הפרפין לחסום מכל שורה תא ולהוסיפם, בשורות, בלוק פרפין הנמען ריק כדי ליצור קו תא TMA.
    הערה: יש להשתמש בשיטות הרגילות כמו אלה שתוארו פדור, דה Marzo20.
  7. לשלב ליבות מדגימות העיקרי המייצג 2-3 סוגי רקמות נוספות (למשל, שקדים, המעי הגס, האשכים, וכו ') כפקדים חיובי או שלילי לתוך TMA. לבחור לרקמות המתאימות החלבון עניין.
  8. השתמש מיקרוטום כדי להכין שני היסטולוגית מקטעים, עבה, כ 4-6 מיקרומטר של הקו הסלולרי TMA. הר החלק בשקופית היסטולוגיה, לייבש אותו, deparaffinize (כפי שמתואר פדור, דה Marzo20).

2. דוגמת צביעת על-ידי Immunofluorescence

  1. למטב את הדילול של נוגדן ראשוני.
    הערה: קיימים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור אופטימיזציה של IHC או אם עבור מקטעים FFPE רקמות כגון Kajimura. et al. 21. סקירה קצרה של הגישה מחולקת לרמות כאן.
    1. להכין 4-5 דילולים של נוגדן ראשוני כדי החלבון עניין מונחה על ידי הוראות היצרן.
    2. זיהוי סוג הרקמה של פקד ממקור בעלי חיים או אדם שמבטא החלבון עניין באוכלוסיות תא מורפולוגית ניתן לזיהוי. להכין מקטעים של הרקמה והר אותם בשקופית לפי הנוהלים אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים כגון פדור, דה Marzo20.
      הערה: מספר קטעים הנדרש הוא המספר של נוגדן ראשוני דילולים פלוס תוספת אחת.
    3. באמצעות מערכת אוטומטית או ידנית עבור פראפין, לבדוק את דילולים נוגדן ראשוני מהשלב 2.1.1 כל בשקופית מהשלב 2.1.2. להשמיט היישום של נוגדן ראשוני משקופית נוספות ולהשתמש בו בתור פקד שלילי.
    4. במהלך תהליך צביעת, מכתים כל השקופיות עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) וגם של counterstain הגרעין של נוגדנים משניים מתויגות fluorescently. אם נדרשת רגישות, להשתמש HRP (חזרת peroxidase)-מצומדת נוגדנים משניים, מערכת הגברה אותות מבוסס tyramide (ראה מחסנית. ואח 13).
      הערה: כאשר ריבוב נוגדנים העיקרי, תווית שונה פלורסנט משמש עבור כל חלבון.
    5. סריקת שקופיות immunostained באמצעות מכשיר המתאים מסוגל לייצר קובץ תמונה דיגיטלית באמצעות עירור וזיהוי אורכי הגל המתאים fluorophores ששימשו.
    6. להשתמש בתוכנה המתאימה כדי להציג את התמונות הדיגיטליות ובחרו מדעית דילול נוגדן ראשוני זה מייעל את עוצמת האות יחסית רקע זריחה.
      הערה: אם רצונך בכך, מיטוב זה יכול להתרחש באמצעות מצומדת HRP משני נוגדן, 3, 3'-diaminobenzidine (DAB), מיקרוסקופיה brightfield.
  2. לבצע אם צביעת על הקו תא TMA.
    1. השתמש מערכת אוטומטית או ידנית עבור פראפין כדי להכתים שקופית של הקו הסלולרי TMA עם דילול ממוטבת נוגדן ראשוני (כפי שנקבע בשלב 2.1). להשמיט את היישום של נוגדן ראשוני של השקופית השניה ולהשתמש בו בתור פקד שלילי.
    2. במהלך תהליך צביעת, מכתים כל השקופיות עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כמו counterstain גרעינית, ולא עם נוגדנים משניים, tyramide כמו שלב 2.1.4.
    3. סריקת שקופיות immunostained באמצעות מכשיר המתאים מסוגל לייצר קובץ תמונה דיגיטלית באמצעות עירור וזיהוי אורכי הגל המתאים fluorophores ששימשו.
    4. השתמש בחבילה תוכנת ניתוח התמונה כדי לזהות תא הסלולר עניין (קרי, הציטופלסמה נגד גרעין) ולכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) עבור כל קו תא.
      הערה: חבילות תוכנה שונים יכול לשמש למטרה זו, רבות נידונות מחסנית. et al. 13.

3. כמותית Immunoblotting של שורות תאים

  1. להכין את lysates של תאים.
    1. קציר 2 מיליון תאים של כל קו תא, כמתואר בצעדים 1.1.1 ל 1.1.3.
    2. ספין תאים למטה במשך 5 דקות ב g x 650 צינור חרוטי 50 מ. Decant את תגובת שיקוע.
    3. רחץ תאים עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח. Resuspend ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח, העברת צינור microcentrifuge 1.5 mL. צנטריפוגה לפי שלב 3.1.2, decant, ולהשאיר תאים קרח.
    4. להוסיף כ- 200 µL קר radioimmunoprecipitation (ריפה) מאגר פירוק עם מעכבי פרוטאז (10 µL של מעכבי X 100 לכל מיליליטר ריפה פירוק מאגר) התאים, מערבולת דגירה על קרח למשך 15 דקות.
      הערה: הסכום של פירוק מאגר הדרושים עבור פירוק יעיל משתנה לפי שורת התאים, יכול להיקבע מדעית. ריפה המאגר מורכב 150 מ מ NaCl, 5 מ מ EDTA, 50 מ מ. טריס, 1.0% NP-40, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% מרחביות במים מזוקקים.
    5. כדי להבטיח יחסית גם טעינה-immunoblots, לכמת החלבון הכולל של מדגם 20 µL, כל שימוש lysate שיטה המתאימה כגון וזמינותו ברדפורד. להוסיף כ- 40 µL 6 X Laemmli פירוק מאגר השארית (µL כ- 180) של כל תא lysate, להרתיח ב 100 מעלות צלזיוס באמבט חום בלוק או מים במשך 5 דקות.
      הערה: 6 X Laemmli מאגר מורכב 300 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8), 4% (w/v) מרחביות, 60% גליצרול, 0.6% (w/v) bromophenol כחול, dithiothreitol 50 מ מ (DTT) של מים מזוקקים.
    6. אחסן את הדגימות ב-20 ° C עד שבועיים.
  2. ביצוע של immunoblot של כל תאי שורות כדי לקבוע אילו תאים בטור הוא החלבון הנפוץ ביותר של עניין.
    הערה: בצע את ההליך המתואר בסעיף ורד פנחסוב, טי ויאנג, PC. 22, עם השינויים הבאים.
    1. Aliquot תא lysate (מוכן ב שלב 3.1) המכילה 10-50 µg של חלבון (תלוי השפע של החלבון עניין) לתוך צינורות microcentrifuge. להוסיף 2.5 µL של 6 X Laemmli מאגר, מאגר פירוק ריפה מספיק כדי להפוך את אמצעי האחסון עד 15 µL.
    2. עומס של % 5 לערום וריכוז המתאים לפתרון (למשל, 10% חלבונים בין 15-100 kDa) ג'ל מרחביות-דף עם סולם חלבון, דגימות מן שלב 3.2.1. לטעון מאגר X Laemmli 1 לתוך בארות ריק. להפעיל את אספקת החשמל בכל ההגדרות המתאימות, בדרך כלל 125 V, במשך 80 דקות, או עד לצבוע bromophenol הכחול מגיע החלק התחתון של הלוח.
    3. לבצע העברה חצי יבש חלבון כפי שמתואר Wiedemann. et al. 23.
      הערה: לקבלת תוצאות נציג, קרום ניטרוצלולוזה (אשר אינו צריך להיות ספוגה במתנול), קר מאגר העברה Bjerrum שייפר-נילסן (BSN) שימשו. מאגר BSN מורכב 48 מ מ טריס, גליצין 39 מ מ, 20% מתנול במים מזוקקים.
    4. לאחר ההעברה, השתמש סכין גילוח לחתוך את הממברנה אופקית כדי להפריד בין החלק המכיל את החלבון ריבית חלבון בקרה פנימית המתאים, כגון GAPDH.
    5. המשך incubations חסימה ו נוגדן באמצעות המאגר חסימה המומלץ על ידי היצרן של נוגדנים העיקרי.
      הערה: נוגדן ראשוני אופטימלית דילולים יכול להשתנות באופן דרמטי בהתאם חלבון שפע ורגישות. לקבלת תוצאות נציג להלן, הנוגדן לחלבון עניין נדרש לדילול 1:1,000 בזמן הפקד GAPDH נדרש לדילול 1:40,000. הדילול של נוגדנים משניים בשימוש היה 1:3, 000.
    6. לאחר נוגדן incubations, כביסה של הקרום, מקם את רצועות ממברנה נדן פלסטיק שקוף כמו שקית סנדוויץ.
    7. להכין תערובת chemiluminescence (ECL) בבית ההוראות של היצרן. השתמש פיפטה P-1000 כדי לכסות את הקרום עם התערובת ECL לסגור נדן, דגירה את רצועות קרום עם התערובת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 1-2 דקות.
    8. מקום נדן ממברנה פלטפורמה הדמיה דיגיטלית. השתמש chemiluminescence וזיהוי סמן ערכי צבע מוחלטים כדי ללכוד חשיפות שונות של הקרום.
      הערה: פעמים חשיפה ישתנו בהתבסס על כמות חלבון טעון, שפע של חלבון המטרה, נוגדן זיקה וכו מתחילים עם חשיפה אוטומטית (בדרך כלל מספר שניות) ולאחר מבחן פעמים חשיפה מעל ומתחת במרווחים של כמה שניות.
    9. מדעית, או באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, לקבוע אילו תאים בטור מבטא ביותר חלבון המטרה.
  3. למצוא את הטווח הדינמי ליניארי של כל נוגדן ראשוני באמצעות לדילול טורי.
    1. לבצע צעדים 3.2.1-3.2.8 באמצעות סדרה של דילולים טורי משורת תאים אשר מבטאת את הריכוז הגבוה ביותר של החלבון היעד (המזוהה בשלב 3.2.9).
    2. להשתמש בתמונה ניתוח תוכנה כגון ImageJ לביצוע densitometry על התמונות חשיפה.
      1. לדוגמה, באמצעות ImageJ, השתמש בכלי מלבני בחירות לבחירת הנתיב הראשון של הג'ל לכמת. . לך לנתח | ג'לים | בחר קודם ליין. להשתמש בעכבר כדי להעביר את המלבן שנוצר לנתיב הבא. . לך לנתח | ג'לים | בחר ליין הבא. שוב ושוב לעבור את המלבן לנתיב הבא ובחר את ליין למשך שאר המסלולים.
      2. . לך לנתח | ג'לים | להתוות מסלולים. השתמש בכלי קו ישר כדי לצייר קווים לרוחב הבסיסים של כל שיא כדי להסיר את רעשי הרקע. השתמש בכלי מטה לבחירת כל שיא, ולאסוף את הצפיפות של כל שיא, מעתה ואילך המכונה הלהקה עוצמה, מתוך חלון תוצאות .
    3. השתמש את densitometry פלט כדי ליצור scatterplot של הלהקה בעוצמה לעומת כמות החלבון הכולל הטעונה עבור כל נוגדן ראשוני. באמצעות שורה של מיטבית, בדיקה ויזואלית, לקבוע את המיקום (טווח בעוצמה) של הטווח הדינמי ליניארי של כל נוגדן.
    4. לבחור ריכוז חלבון שיוצר ערך על קצה גבוה של הטווח ליניארי להיות הריכוז לנוע קדימה עם כל שורות תאים.
      הערה: מאחר הריכוז הזה מתחת לרמת רוויה בשורת תאים עם הכמות הגדולה ביותר של חלבון זה, צריך להיות אין סכנת מעל חשיפת הלהקות עבור שורות תאים אחרים.
  4. ביצוע של immunoblot באמצעות ריכוז חלבון שבחרת בשלב 3.3.4 עבור כל שורות תאים וחזור על שלבים 3.2.1-3.2.8.
    1. מבצע densitometry סריקות דיגיטליות כמו שלב 3.3.2. בחר את התמונות חשיפות המניבים אותות בטווחים ליניארי עבור כל נוגדן שזוהו בשלב 3.3.3.
    2. באמצעות האותות בעוצמה את הלהקה החשיפות אידיאלי מ 3.4.1, לחשב את היחס שבין עוצמת הלהקה חלבון היעד ומאפשרת לטעון בקרת העוצמה הלהקה עבור כל קו תא. ערכים אלה יחס מציינים את השפע היחסי של החלבון היעד עניין.
    3. לבצע מבחן מתאם פירסון (ניתן לעשות זאת באמצעות חבילת תוכנה סטטיסטית) לתאם הערכים שהתקבלו מניתוח תמונה של אם מכתימים (השלב 2.2) לאלו המתקבלים immunoblotting (שלב 3.4.2).

תוצאות

פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לאשר את היכולת של IF כדי לקבוע את הכמות היחסית של החלבון אנטי-מוות Bcl-2 של שורות תאים הפך גושי רקמה FFPE. לכימות Bcl-2 באופן בררני בתאי סרטן ניתן להסבר מנגנוני oncogenic והוא יכול להיות שימושי באבחון פתולוגי, סיפור קליני ניהול החלטות24. ליתר דיו?...

Discussion

תארנו שיטה לשימוש immunoblotting כמותית (ליברות) כדי להדגים את התועלת של immunofluorescence (אם) עבור ברור שפע יחסי של חלבון המטרה דגימות רקמה FFPE. שיטות הנוכחי של כימות חלבונים מוגבלים לפי טבעם קטגורית, כגון2,הדפסות כסף IHC3, או בצורך homogenize דגימות, מניעת חקירה דוגמת מבנה ותא הא?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרדריק בנטינג ו צ'ארלס הטוב ביותר בקנדה לתואר שני מלגה (בבוקר).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
697DSMZACC 42Cell line
JeKo-1ATCCCRL-3006Cell line
JurkatATCCTIB-152Cell line
RCH-ACVDSMZACC 548Cell line
Granta-519DSMZACC 342Cell line
REHDSMZACC 22Cell line
RajiATCCCCL-86Cell line
HeLaATCCCCL-2Cell line
Trypsin/EDTA solutionInvitrogenR001100For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS)Wisent Inc.81150To neutralize trypsin
Neutral Buffered FormalinProtocol245-684For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agaroseInvitrogen15517-022For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XTRoche-For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)Dako (Agilent)K4000For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)Dako (Agilent)K4002For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagentPerkin ElmerNEL745001KTFor immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-To view scanned slides
HALO image analysis softwareIndica Labs-For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)Thermo Scientific1862209To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)BioShopEDT001For RIPA buffer
NP-40BDH Limited56009For RIPA buffer
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750For RIPA buffer
GlycerolFisherBiotechBP229For Laemlli buffer
Bromophenol blueBioShopBRO777For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper)Bio-Rad1703969For blotting transfer
Nitrocellulose membraneBio-Rad162-0115For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cellBio-Rad1703940For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk)Cell Signaling Technology9999SFor blocking buffer
Tween 20BioShopTWN510For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibodyEpitomics2251-1Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibodyabcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibodyabcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substratesBio-Rad1705060For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461For immunoblot signal detection
ImageJ softwareFreeware, NIH-For densitometry analysis

References

  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. . The Human Protein Atlas BCL2 Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018)
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143Immunofluorescenceimmunoblot

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved