ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

要約

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルに興味の蛋白質を定量化するための手段として画像解析と相まって蛍光組織学を検証する定量的免疫ブロットの使用について述べる。ルーチン生検試料中のバイオ マーカー タンパク質の相対的な量を判別する蛍光組織学の有用性を示した。

要約

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルの興味の蛋白質の定量化は臨床的に重要なアプリケーションを研究。定量化の最適なメソッドが正確で、線形ダイナミック レンジが広い、個々 のセルの種類を識別するためにできるようにするサンプルの構造の整合性を維持します。免疫組織染色 (IHC)、質量分析法、免疫ブロットなど現在メソッドが各はそのカテゴリの性質のためこれらの規定を満たすために失敗したりサンプルを均質化する必要があります。別の方法として蛍光抗体法 (IF) と画像解析 FFPE 組織の興味の蛋白質の量を決定するための使用を提案します。ここは、このメソッドは簡単に最適化し、広いダイナミック レンジが得られますは定量的免疫ブロットのゴールド スタンダードと比較して直線的に定量化を示します。さらに、このメソッドは、サンプルの構造の整合性の維持が可能、診断アプリケーションで重要となる可能性がありますさまざまなセルタイプの区別のためことができます。全体的にみて、これは FFPE サンプルの蛋白質の相対的な定量化のための堅牢な方法で、簡単に合わせて臨床や研究のニーズに適応することができます。

概要

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織生検試料中のタンパク質を定量化する必要が多くの臨床現場であります。たとえば、ルーチン生検のマーカー蛋白質の定量は予後の解明し、癌患者¹の治療に知らせるためです。ただし、現在の方法は通常主観的であり、検証がないです。

免疫組織染色 (IHC) は病理学研究室で日常的に使用、通常ターゲット蛋白質の一次抗体と二次抗体酵素西洋わさびの過酸化酵素²などラベル付き共役によって異なります。従来の IHC は敏感で、作ることができる分の使用サンプルし、その関連する組織コンテキスト内でタンパク質発現の評価が行え組織サンプルの形態学的整合性を維持します。しかし、IHC によって生成された発色の信号は減算、のでそれが比較的狭いダイナミック レンジに苦しんで、^2,3、4を多重化するため限られた可能性を提供しています。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングには、形態学的整合性が維持されます。しかし、発展するこの技術はささやかな形態の解像度に関連付けられて、大幅な校正と標準化、日常的に臨床使用^5,6、7の可能性を損なうことが必要です。組織サンプル中のタンパク質を定量化するための代替技術は、免疫ブロット⁸質量^9,10,11,、酵素免疫測定法 (ELISA)¹²、各均質化、始まるのサンプル組織ライセート。主な組織サンプルは、細胞の種類の多数を含む異種。したがって、サンプルの均質化を伴う技術が癌細胞のような興味の特定のセル人口のタンパク質の定量を許可しません。

場合、IHC の小に適用できるような FFPE サンプルし、組織学的整合性¹³の保持が可能します。場合、ただし、蛍光信号の添加物の性質のおかげで複数の一次抗体、蛍光ラベルの適用を受けやすいです。したがって、特定の細胞または細胞コンパートメント (たとえば、核と細胞質) 他の抗体を使用して定義内で比較的興味の蛋白質を定量化することがあります。蛍光信号も大きいダイナミック レンジ^13,14の利点があります。優位性、再現性、多重性 FFPE サンプルに適用される場合は、実証された^13,14,15をされています。

ここで興味の蛋白質の相対量を決定する際にコンピューター支援画像解析と組み合わされる場合の計量的性質を確認するためのゴールド スタンダードとして確立されたセルラインを使用して定量的免疫ブロットの使用について述べるFFPE 組織サンプルからの組織学的セクション。我々 は臨床の生検サンプル^16,17,18バイオ マーカー蛋白質を定量化するための多重アプローチで正常にこのメソッドを適用しました。

プロトコル

主な人体組織サンプルを使用する健康科学関連教育病院研究倫理委員会 (HSREB) 女王の大学から承認されました。

1. 細胞ティッシュのマイクロ アレイ (TMA) の構築

1. 収穫や洗浄のセルです。
   注: このプロトコルは、様々 な確立の不死化細胞株 (例えばhela 細胞の Jurkat、RCH ACV) でテストされています。
   1. 付着性のセルの約 80% の confluency に達すれば約 1.3 倍 10⁷セルを収穫します。そのセルの行の適切な試薬を使用してセルをデタッチします。
      注: エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、トリプシン表面蛋白質を分解のリスクを軽減する以上一般に好ましい。トリプシンを使用している場合は、セルを収穫後すぐにウシ胎児血清 (FBS) を使用してトリプシンを中和します。
   2. 浮遊細胞の場合約 8 × 10⁷細胞成長のログ段階を収穫します。
   3. 50 mL の円錐管に 225 x g で 5 分間遠心分離によって収穫戸セルを収集します。
   4. 上清をデカントし、再リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) X 1 の 10 mL にペレットを中断します。225 x g で 5 分間遠心し、上清をデカントします。
      注: 1x PBS、1.8 mM KH₂PO₄蒸留水; 10 mM Na₂HPO₄、2.7 mM KCl 137 mM の NaCl ので構成されます。7.4 に pH を調整します。
2. ホルマリンのセルを修復して、それらをペレットします。
   1. 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) の 10 mL のコニカル チューブ内細胞ペレットを中断します。
      注: NBF は、9 mL の 1x PBS で 37% ホルムアルデヒド原液 1 mL を希釈して準備できます。
      注意: は、ホルマリンやホルムアルデヒドを取り扱うときに注意を使用します。ホルマリンとホルムアルデヒドを含む手順のヒューム フードを使用します。
   2. (約 17 時間) 一晩室温で 24 回転でロッカーに細胞を孵化させなさい。
   3. PBS で低融点アガロースの 1% 溶液 (1 mL PBS あたり agarose の 0.01 g) を準備します。
      1. 500 μ L 細胞ラインのサンプルあたりアガロース溶液のための十分を準備します。
      2. 80 ° C 水お風呂や熱ブロックで、2-5 分の臨時混合アガロースを溶解します。解散後は、硬化を防ぐために 37 ° C 水バスまたは熱ブロックのソリューションを保持します。
   4. ペレットから固定セル 1.2.2 ステップ 225 x g. で 5 分間遠心分離は、上澄みを除去し、500 μ L の 1x PBS で細胞を再懸濁します。
   5. 1.5 mL 遠心チューブ、ペレットに 290 x g. 上澄みのすべてを吸引で 5 分間遠心分離によって細胞を転送します。
3. アガロースのセルをキャストします。
   1. セルを含む各管に (ステップ 1.2.3) から 1% アガロース溶液の 〜 500 μ L を追加します。優しく、しかし、すぐにはピペット P-1000 マイクロ ピペットを使用してミックスする上下の混合物です。
      注: は、開口部を拡大し、泡の形成を避けるためにピペット チップの端を切り落とします。硬化を防ぐために 37 ° C の水浴中作業アガロース溶液を維持します。
   2. (5-10 分) を常温で硬化する agarose 携帯ソリューションを許可します。10%、NBF を各遠心チューブのサンプルを含む、(最大 24 時間) を埋め込むパラフィンまで室温で維持の 1 つの mL を追加します。
4. パラフィン包埋用アガロース プラグを準備します。
   1. サンプルから NBF を離れて吸い出しなさい。
   2. かみそりの刃を使用して遠心チューブを切断、プラスチック組織カセットにプラグインを配置するセルのプラグを取り外します。10% でカセットを保存常温 NBF。
5. サンプルを処理手動で夜通しまたは自動ティッシュ プロセッサを使用して、標準組織学方法を使用してパラフィン ワックスで埋め込みます。
   注: は、フィッシャーらを参照してください。¹⁹例プロトコル。
6. 特殊なを使用して"組織 arrayer"楽器、パラフィンから重複する 0.6 mm コア各セルラインからブロックし、TMA 培養細胞株を作成するために空の受信者パラフィン ブロックに行を挿入する、収穫。
   注: 標準的な方法はヒョードルと De Marzo²⁰に記載されているなど使用必要があります。
7. TMA に正または負のコントロールとして 2-3 追加の組織型 (例えば、扁桃、コロン、精巣、等) を表す主なサンプルからコアを組み込みます。興味の蛋白質の適切な組織を選択します。
8. ミクロトームを使用して 2 標本、約 4 に 6 μ m 厚い、セルライン TMA を準備します。組織学のスライドのセクションをマウント、乾燥させ、(前述のヒョードルと De Marzo²⁰) を deparaffinize します。

2. サンプルの蛍光抗体法による染色

1. 一次抗体の希釈を最適化します。
   注: 標準のプロトコルは、梶村らのように FFPE 組織セクションの IHC かの最適化²¹. アプローチの概要を紹介します。
   1. 製造元の指示に導かれる興味の蛋白質に一次抗体の希釈を 4-5 を準備します。
   2. 形態学的に認識可能な細胞集団の興味の蛋白質を表現する動物や人間のソースからコントロール組織型を識別します。組織のセクションを準備し、ヒョードルと De Marzo²⁰のように標準的な免疫組織化学の手順スライドにそれらをマウントします。
      注: 必要なセクションの数は、一次抗体希釈液に加えて、1 つ余分な数です。
   3. Immunohistology の自動または手動のシステムを使用して、テスト ステップ 2.1.2 からスライドで 2.1.1 各手順の一次抗体希釈液です。余分なスライドから一次抗体のアプリケーションを省略し、ネガティブ コントロールとして使用します。
   4. 染色の過程では、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核対比染色と蛍光タグ二次抗体を持つすべてのスライドを染色します。高い感度が必要な場合使用、HRP (西洋わさびペルオキシダーゼ)-共役二次抗体とパスチラミドシグナル ベースの信号増幅システム (スタックらを参照してください。¹³)。
      注: 一次抗体を多重化、各蛋白質の別の蛍光ラベルが使用されます。
   5. 励起と検出波長使用された蛍光物質に適切なを使用してデジタル画像ファイルを生成することができる適切な装置を使用して immunostained スライドをスキャンします。
   6. 適切なソフトウェアを使用して、デジタル画像を表示および経験的背景の蛍光性の相対的な信号強度を最適化する一次抗体希釈を選択します。
      注: 必要な場合は、HRP 標識二次抗体、3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打)、明視野顕微鏡を使用してこの最適化が発生することができます。
2. セルライン TMA に染色する場合を実行します。
   1. Immunohistology の自動または手動システムを使用して、最適化された一次抗体希釈 (定める手順 2.1) でセル行 TMA のスライドを染色します。2 番目のスライドから一次抗体のアプリケーションを省略し、ネガティブ コントロールとして使用します。
   2. 染色の過程では、すべてのスライドおよび二次抗体とステップ 2.1.4 のようにパスチラミドシグナルが 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核の対比染色としてを染色します。
   3. 励起と検出波長使用された蛍光物質に適切なを使用してデジタル画像ファイルを生成することができる適切な装置を使用して immunostained スライドをスキャンします。
   4. 画像解析ソフトウェア パッケージを使用して興味 (すなわち、細胞質と核) の細胞内コンパートメントを識別し、各セルラインの平均蛍光強度 (MFI) を定量化します。
      注: さまざまなソフトウェア パッケージはこの目的に使用することができます、多くはスタックらで説明されます。¹³。

3 細胞の定量的免疫ブロット

1. セル lysates を準備します。
   1. 1.1.1 から 1.1.3 への手順の説明に従って各セルラインの 200 万セルを収穫します。
   2. 50 mL コニカル チューブ 650 x g で 5 分間細胞をスピンダウンします。上清をデカントします。
   3. 10 ml の氷冷 PBS のセルを洗浄します。1 mL の氷冷 PBS と 1.5 mL 遠心チューブに転送で再懸濁します。3.1.2 のステップに従って遠心分離機、デカント、氷の上のセルのまま。
   4. 細胞に冷たい radioimmunoprecipitation (RIPA) 換散バッファーとプロテアーゼ阻害薬 (RIPA 溶解バッファーの mL あたり 100 X 阻害剤の 10 μ L) の約 200 μ L を追加渦と 15 分間氷の上を孵化させなさい。
      注: 効果的な換散のため必要な換散バッファー量細胞によって異なりますが、経験的に決定できます。RIPA バッファーは、150 mM の NaCl、5 mM, 50 mM Tris, EDTA 1.0 の NP 40%、0.5% デオキシ コール酸ナトリウム、蒸留水で 0.1 %sds で構成されます。
   5. 比較的、immunoblots に荷を積むためには、各ライセート ブラッドフォードの試金など適切な方法を使用から 20 μ L のサンプルで総蛋白を定量化します。各細胞ライセートの残りの部分 (約 180 μ L) 6 X Laemmli 換散バッファーの約 40 μ L を追加し、5 分間熱ブロックや水浴 100 ° C で沸騰します。
      注: 6 X 塩化物イオン バッファーは 300 mM トリス-HCl (pH 6.8) 4% (w/v) SDS、60% のグリセロール、0.6% (w/v) プロムフェノール ブルーとから成る 50 mM ジチオトレイトール (DTT) の蒸留水。
   6. 2 週間の-20 ° C でサンプルを格納します。
2. どのセルの行に興味の最も豊富な蛋白質を確認するすべての細胞ラインのイムノブロットを実行します。
   注: マフムード、t. と陽、PC で説明されている手順に従います。²², 以下の変更。
   1. 因数は (興味の蛋白質の豊富) によって蛋白質のライセート (の準備ステップ 3.1) 含む 10 50 μ g をセル マイクロ遠心チューブ用にします。2.5 μ L の 6 X 塩化物イオンとバッファーと 15 μ L にボリュームを作るに十分な RIPA 溶解バッファーを追加します。
   2. スタッキング 5% と (例えば、15 100 kDa のタンパク質の 10%) を解決する適切な濃度を読み込む蛋白質の梯子とステップ 3.2.1 からサンプル SDS ページのゲル。空井戸 1 X Laemmli バッファーに読み込みます。125 V、80 分またはブロモフェノール ブルー色素プレートの底に達するまで通常の適切な設定で電源を実行します。
   3. ヴィーデマンらと半乾燥タンパク質の転送を実行します。²³。
      注: の代表的な結果、(これはメタノール中で浸漬する必要はありません) 硝酸セルロースの膜、冷たい Bjerrum シェーファー ニールセン (BSN) 転送バッファーが使用されました。BSN バッファーは、48 mM トリス、39 mM グリシン、蒸留水で 20% メタノールで構成されます。
   4. 編入後、かみそりの刃を使って水平 GAPDH などの適切な内部統制蛋白質からの興味の蛋白質を含んでいる部分を分離する膜をカットできます。
   5. 一次抗体の製造元の推奨ブロック バッファーを使用してブロックと抗体の孵化に進みます。
      注: 最適な一次抗体希釈液は、蛋白質量と感性によって大きく異なってきます。以下の代表的な結果の興味の蛋白質に抗体が必要縮尺希釈 GAPDH コントロール 1:40,000 希釈が必要です。使用される二次抗体の希釈は、1:3, 000 だった。
   6. 抗体の孵化と膜の洗浄の後に、サンドイッチ バッグなど透明なプラスチック鞘膜ストリップを配置します。
   7. 製造元の指示に従って誘起化学発光 (ECL) の混合物を準備します。ECL 混合膜をカバーし、シースを閉じて、1-2 分間室温で暗闇の中で混合膜のストリップをインキュベート P-1000 ピペットを使用します。
   8. デジタル イメージング プラットフォームに膜鞘を配置します。膜の様々 なエクスポー ジャーをキャプチャするのに化学発光と比色マーカー検出を使用します。
      注: 露光時間はロードの蛋白質の量によって異なりますが、ターゲット蛋白質の豊富な抗体親和性などを数秒ずつ自動露出 (通常いくつか秒) とテスト露光時間の上と下で開始。
   9. 経験的に、どのセルの行は、最もターゲット蛋白質を表現イメージ解析ソフトウェアを使用してか。
3. シリアル希釈を使用して各一次抗体の線形動的な範囲を見つけます。
   1. 手順 3.2.1-3.2.8 を実行 (手順 3.2.9 で識別される) ターゲット蛋白質の高い濃度を表現する細胞ラインからシリアル希薄の一連を使用して。
   2. ImageJ など画像解析ソフトウェアを使用すると、露出画像の密度測定を実行できます。
      1. たとえば、ImageJ を用いた定量化するのにゲルの最初の車線を選択するのに長方形選択ツールを使用します。への分析 |ゲル |最初のレーンを選択。隣の車線に結果として得られる四角形を移動するのにマウスを使用します。への分析 |ゲル |次のレーンを選択。繰り返し四角形を隣のレーンに移動し、車線の残りの部分のための車線を選択します。
      2. への分析 |ゲル |レーンのプロット。直線ツールを使用して、バック グラウンド ノイズを削除する各ピークの拠点間で線を描きます。杖ツールを使用して、各ピークを選択し、今後に結果ウィンドウからバンド強度と呼ばれる、それぞれのピークにおける密度を収集します。
   3. 総蛋白量各一次抗体のためにロード、バンド強度対の散布図を作成する出力密度を使用します。ベスト フィットと目視検査のラインで、各抗体の線形ダイナミック レンジの場所 (強度範囲) を特定します。
   4. タンパク質濃度より高い濃度のすべての細胞で前進する線形の範囲の端の値を生成するを選択します。
      注: この濃度はこのタンパク質の最大量を持つ細胞における飽和レベル以下なので必要がありますない危険の他の細胞のバンドを公開する以上。
4. すべての細胞の 3.3.4 でタンパク質濃度を使用して、イムノブロットを実行し、手順 3.2.1-3.2.8 を繰り返します。
   1. 3.3.2 のステップのようにデジタル スキャンで密度測定を実行します。3.3.3 のステップで特定した各抗体の線形の範囲内の信号をもたらす露光画像を選びます。
   2. 3.4.1 から理想的な露出からバンドの強度の信号を使用して、コントロール バンド強度の各セルの行を読み込むターゲット蛋白質バンド強度の比を計算します。これらの比の値は、興味のターゲット蛋白質の相対的な豊かさを示します。
   3. ピアソン相関テストを実行 (することができる統計ソフトウェア パッケージを使用して) 免疫ブロット (ステップ 3.4.2) から結果が得られた場合染色 (ステップの 2.2) 画像解析から得られた値を関連付ける。

結果

このプロトコルは FFPE 組織ブロック化細胞において抗アポトーシス蛋白 Bcl 2 の相対的な量を決定する場合の機能を確認するために使用されました。がん細胞に選択的に定量化 Bcl 2 発癌機構を解明することができますおよび病理組織学的診断と臨床管理決定²⁴を通知に便利することができます。具体的には、Bcl 2 適切な b リンパ球の開発の役割を果た...

ディスカッション

については、メソッドを利用する定量的免疫ブロット (IB) 蛍光抗体法 (IF) の有用性を実証する FFPE 組織サンプルのターゲット蛋白質の相対的な豊かさを判別します。現在蛋白質定量方法が発色 IHC^2,3などそのカテゴリ性質またはサンプル、サンプル構造と細胞集団に調査を防止するなどを統一する必要性によって限られています。IB と質量

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
697	DSMZ	ACC 42	Cell line
JeKo-1	ATCC	CRL-3006	Cell line
Jurkat	ATCC	TIB-152	Cell line
RCH-ACV	DSMZ	ACC 548	Cell line
Granta-519	DSMZ	ACC 342	Cell line
REH	DSMZ	ACC 22	Cell line
Raji	ATCC	CCL-86	Cell line
HeLa	ATCC	CCL-2	Cell line
Trypsin/EDTA solution	Invitrogen	R001100	For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS)	Wisent Inc.	81150	To neutralize trypsin
Neutral Buffered Formalin	Protocol	245-684	For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	15517-022	For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124	Dako (Agilent)	cat#: M088729-2, RRID: 2064429	To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XT	Roche	-	For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)	Dako (Agilent)	K4000	For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)	Dako (Agilent)	K4002	For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagent	Perkin Elmer	NEL745001KT	For immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScope	Leica Biosystems	-	To view scanned slides
HALO image analysis software	Indica Labs	-	For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)	Thermo Scientific	1862209	To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop	EDT001	For RIPA buffer
NP-40	BDH Limited	56009	For RIPA buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	For RIPA buffer
Glycerol	FisherBiotech	BP229	For Laemlli buffer
Bromophenol blue	BioShop	BRO777	For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0611	For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB001	For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)	Bio-Rad	161-0374	For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper)	Bio-Rad	1703969	For blotting transfer
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115	For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940	For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk)	Cell Signaling Technology	9999S	For blocking buffer
Tween 20	BioShop	TWN510	For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibody	Epitomics	2251-1	Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody	abcam	cat#: ab6789, RRID: AB_955439	Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody	abcam	cat#: ab6721, RRID: AB_955447	Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substrates	Bio-Rad	1705060	For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	29083461	For immunoblot signal detection
ImageJ software	Freeware, NIH	-	For densitometry analysis