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요약

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

초록

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질의 정량화는 임상에서 중요 한 응용 프로그램을 연구 하는 고. 정량화 하는 최적의 방법 정확 하 고 광범위 한 선형 동적 범위를가지고 개별 세포 유형의 식별 수 있도록 샘플의 구조적 무결성을 유지 합니다. Immunohistochemistry (IHC), 질량 분석 등 immunoblotting 현재 방법 각 그들의 범주 특성상 이러한 규정에 맞게 실패 또는 샘플을 균질 필요가 있다. 대체 방법으로 우리는 면역 형광 검사 (IF) 및 FFPE 조직에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 이미지 분석의 사용을 제안 합니다. 여기이 방법은 쉽게 최적화 된 넓은 동적 범위를 산출 및 선형 양적 immunoblotting의 황금 표준에 비해 정량은 설명 합니다. 또한,이 메서드는 샘플의 구조적 무결성의 유지 관리를 허용 하 고 진단 응용 프로그램에 중요 한 있을 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구별 허용 합니다. 전반적으로,이 FFPE 샘플에 있는 단백질의 상대적 정량화에 대 한 강력한 방법 이며 임상 적응 하거나 요구를 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

서문

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 생 검 견본에 있는 단백질을 정할 필요가 많은 임상 분야에 존재 합니다. 예를 들어 일상적인 생 검 표본에서 바이오 마커 단백질의 정량화는 암 환자1에 대 한 치료 예 후를 명료 하 사용 됩니다. 그러나, 현재 메서드는 일반적으로 주관적 및 유효성 검사 부족.

Immunohistochemistry (IHC) 병 리 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 일반적으로 1 차적인 항 체 대상 단백질에 지시 및 양 고추냉이 과산화 효소2등 효소 상표로 활용 된 이차 항 체에 따라 달라 집니다. 기존의 IHC 구분, 만들 수 있습니다 사용 분의 샘플링 하 고 그로 인하여 그것의 관련 조직학 컨텍스트 내에서 단백질 식의 평가 허용 하는 조직 샘플의 형태학 무결성을 보존 한다. 그러나, IHC에 의해 생성 된 비 신호 빼기 때문에, 그것은 상대적으로 좁은 동적 범위에서 겪고 있다 고 멀티플렉싱2,,34에 대 한 제한 된 잠재력을 제공. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI-MSI) 이미징 형태학의 무결성을 유지 합니다. 그러나,이 개발 기술 겸손 형태학 해상도와 연결 하며 중요 한 보정 및 정규화, 일상 임상 사용5,,67에 대 한 그것의 타당성을 방해. 단백질 조직 샘플에서 계량을 대체 기술을 포함 immunoblotting8,11, 질량 분석의9,10,및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)12, 각 이 무 균으로 시작의 샘플 조직의 lysate. 기본 조직 샘플은 다른 유형의 다양 한 세포 유형 포함. 따라서, 조직 샘플 수반 기법 암 세포 같은 관심의 특정 세포 인구에서 단백질의 정량화를 허용 하지 않습니다.

IHC, 만약에 작은 적용 됩니다 처럼 FFPE 샘플링 하 고 조직학 무결성13의 보존 합니다. 그러나, 덕분에 형광 신호, 첨가제 자연 경우 의무가 여러 기본 항 체와 형광 라벨의 응용 프로그램입니다. 따라서, 관심사의 단백질 특정 셀 또는 세포질 구획 (예를 들어 핵 및 세포질) 다른 항 체를 사용 하 여 정의 내에서 상대적으로 측정할 수 있습니다. 형광 신호는 또한 더 큰 동적 범위13,14의 이점을. 우수성, 재현성, 및의 멀티플렉싱 잠재력 FFPE 샘플에 적용 하는 경우 시연된13,,1415되었습니다.

여기 우리 골드 표준으로 설립된 셀 라인을 사용 하 여 만약에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정에서 컴퓨터 기반 이미지 분석의 양적 성격을 확인 하는 양적 immunoblotting의 사용 설명 FFPE 조직 샘플에서 조직학 섹션입니다. 우리는 성공적으로 임상 생 샘플16,,1718바이오 마커 단백질을 계량 하는 다중 접근에서이 메서드를 적용 했습니다.

프로토콜

기본 인간의 조직 샘플을 사용 하 여 승인 보건 복지부 산하 교육 병원 연구 윤리 위원회 (HSREB) 여왕의 대학에서 얻은 했다.

1. 건물 셀 라인 조직 Microarray (TMA)

  1. 수확 하 고 세포를 씻어.
    참고:이 프로토콜 (예: 헬러, Jurkat, RCH ACV) 다양 한 설립된 불멸 하 게 셀 라인에서 테스트 되었습니다.
    1. 부착 세포, 그들은 약 80 %confluency 도달 약 1.3 x 107 셀을 수확. 셀 라인에 대 한 적절 한 시 약을 사용 하 여 셀을 분리 합니다.
      참고: Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)는 표면 단백질을 저하의 위험을 줄이기 위해 트립 신 이상으로 일반적으로 선호. 트립 신을 사용 하는 경우 셀 수확 직후 소 태아 혈 청 (FBS)를 사용 하 여 트립 신을 중화.
    2. 현 탁 액 셀, 약 8 x 10의7 셀 로그-성장의 단계에서 수확.
    3. 50 mL 원뿔 튜브에 225 x g에 5 분 동안 centrifuging 여 수확/분리 된 세포를 수집 합니다.
    4. 가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) X 1의 10 mL에 펠 릿을 중단. 225 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 가만히 따르다.
      참고: 1 X PBS 구성 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4 증류수; pH 7.4에 조정 합니다.
  2. 포 르 말린에 셀을 해결 하 고 그들을 펠 렛.
    1. 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF)의 10 ml 원뿔 관 내의 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
      참고: NBF 9 ml 1 X PBS의 37% 포름알데히드 재고 솔루션의 1 mL를 희석 하 여 준비 될 수 있습니다.
      주의: 포 르 말린 및 포름알데히드 처리 때 주의 사용 합니다. 연기 후드를 사용 하 여 포 르 말린 및 포름알데히드를 포함 하는 단계에 대 한.
    2. 하룻밤 실 온에서 24 rpm (약 17 h) 로커에 셀을 품 어.
    3. PBS에서 낮은 융 점 agarose의 1% 솔루션 (0.01 g 당 1 mL PBS agarose의)을 준비 합니다.
      1. 충분히 500 µ L 셀 라인 샘플 당 agarose 솔루션의 준비.
      2. 80 ° C 물 목욕 또는 열 블록에서 2-5 분에 대 한 비정 기 혼합과 agarose를 녹. 일단 해산, 경화를 방지 하는 37 ° C 물 목욕 또는 열 블록에서 솔루션을 계속.
    4. 펠 릿에서 고정된 셀 225 x g.에서 5 분 동안 centrifuging 1.2.2 단계는 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 1 x PBS의 500 µ L에 셀.
    5. 290 x g.는 상쾌한의 모든 Aspirate에 5 분 동안 centrifuging 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 펠 릿으로 셀을 전송.
  3. Agarose 셀 캐스팅.
    1. 셀을 포함 하는 각 관 (1.2.3 단계)에서 1 %agarose 솔루션의 ~ 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게, 그러나 빨리, P-1000 micropipette 혼합을 사용 하 여 위아래로 혼합 플라스틱.
      참고: 조리개를 확대 하 여 거품을 형성 하지 않도록 피 펫 팁의 끝을 잘라. 경화를 방지 하기 위해 37 ° C 물 목욕에서 작업 agarose 솔루션을 유지.
    2. 실 온에서 (5-10 분)을 강화 하기 위해 agarose 셀 솔루션을 수 있습니다. 각 microcentrifuge에 NBF 튜브 샘플을 포함 하 고 실내 온도에 파라핀 포함 (최대 24 시간)까지 10%의 1 mL를 추가 합니다.
  4. 파라핀 포함 agarose 플러그를 준비 합니다.
    1. 샘플에서 NBF에서 발음.
    2. Microcentrifuge 튜브, 플라스틱 조직 카세트 플러그를 삽입 하는 면도날을 사용 하 여 셀 플러그를 제거 합니다. 10%에서 카세트 저장 NBF 실내 온도에.
  5. 샘플을 처리 하거나 수동으로 하룻밤 또는 자동된 조직 프로세서를 사용 하 여 및 표준 조직학 방법을 사용 하 여 파라핀 왁 스에 포함.
    참고: 피셔 외 예제에서는 프로토콜에 대 한 19 .
  6. 특수화를 사용 하 여 "조직 arrayer" 악기, 추수는 파라핀에서 중복 0.6-m m 코어 각 셀 라인에서 차단 하 고, 행에서에 삽입할 셀 라인 TMA를 만들려면 빈 받는 사람 파라핀 블록.
    참고: 표준 방법 등 표도르와 3 월20에 설명 된 사용 해야 합니다.
  7. TMA에 양수 또는 음수 컨트롤로 2-3 추가 조직 유형 (예: 편도 선, 결 장, 고환, 등)을 나타내는 기본 샘플에서 코어를 통합 합니다. 관심사의 단백질에 대 한 적합 한 조직을 선택 합니다.
  8. 조직학의 두 섹션, 약 4 ~ 6 µ m 두께, 셀 라인 TMA 준비 하는 톰을 사용 합니다. 조직학 슬라이드에 섹션을 탑재, 건조, 그리고 deparaffinize (표도르와 3 월20에서 같이).

2입니다. 면역 형광에 의해 얼룩 샘플

  1. 1 차적인 항 체의 희석을 최적화 합니다.
    참고: Kajimura 그 외 여러분 에서 같은 FFPE 직물 단면도 IHC 또는 경우의 최적화에 대 한 존재 하는 표준 프로토콜 21. 방법의 간략 한 개요는 여기에 설명 된.
    1. 제조업체의 지침에 의해 유도 하는 관심사의 단백질을 기본 항 체의 4-5 희석을 준비 합니다.
    2. 형태학 상으로 인식할 수 있는 세포 인구에 있는 관심사의 단백질을 표현 하는 동물이 나 인간의 소스에서 제어 조직 형식을 식별 합니다. 조직 섹션을 준비 하 고 표도르와 3 월20에 같은 표준 immunohistochemistry 절차 다음 슬라이드에 탑재.
      참고: 필요한 섹션의 수 주 항 체 희석 더하기 하나는 추가의 수가입니다.
    3. Immunohistology에 대 한 자동 또는 수동 시스템을 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석 단계 2.1.2에서에서 슬라이드에 2.1.1 각 단계에서 테스트 합니다. 추가 슬라이드에서 기본 항 체의 응용 프로그램을 생략 하 고 부정적인 제어로 사용.
    4. 착 색 과정에서 모든 슬라이드와 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstain 및 붙일 태그가 이차 항 체로 서 얼룩. HRP (양 고추냉이 과산화 효소)을 사용 하 여 감도 향상이 필요한 경우-활용 된 이차 항 체 및 tyramide 기반 신호 증폭 시스템 (참조 스택 외. 13)입니다.
      참고: 기본 항 체를 멀티플렉싱 때 다른 형광 라벨 각 단백질에 대 한 사용 됩니다.
    5. 사용 된 fluorophores에 적절 한 구동 및 검출 파장을 사용 하 여 디지털 이미지 파일을 생성할 수 있는 적절 한 악기를 사용 하 여 immunostained 슬라이드를 검사 합니다.
    6. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 디지털 이미지를 볼 하 고 경험적으로 선택 배경 형광 상대적 신호 강도 최적화 하는 1 차적인 항 체 희석.
      참고: 원하는 경우,이 최적화 발생할 수 있습니다는 HRP 활용 된 이차 항 체, 3, diaminobenzidine (DAB)-3'와 명시 야 현미경을 사용 하 여.
  2. 셀 라인 TMA에 얼룩 경우 수행 합니다.
    1. Immunohistology에 대 한 자동 또는 수동 시스템을 사용 하 여 최적화 된 기본 항 체 희석 (으로 단계 2.1에서에서 결정)으로 셀 라인 TMA의 슬라이드를 얼룩. 두 번째 슬라이드에서 기본 항 체의 응용 프로그램을 생략 하 고 부정적인 제어로 사용.
    2. 착 색 과정에서 모든 슬라이드 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstain로와 이차 항 체 및 tyramide 단계 2.1.4로 얼룩.
    3. 사용 된 fluorophores에 적절 한 구동 및 검출 파장을 사용 하 여 디지털 이미지 파일을 생성할 수 있는 적절 한 악기를 사용 하 여 immunostained 슬라이드를 검사 합니다.
    4. 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 (즉, 세포질 및 핵)의 세포질 구획을 식별 하 고 각 셀 라인에 대 한 평균 형광 강도 (MFI) 계량.
      참고:이 목적을 위해 다양 한 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다 그리고 많은 스택 외. 에서 설명 13.

3. 양적 Immunoblotting 셀 라인의

  1. 셀의 lysates 준비.
    1. 1.1.1에서 1.1.3 단계에 설명 된 대로 각 셀 라인의 2 백만 세포를 수확.
    2. 50 mL 원뿔 튜브에 650 x g에 5 분에 대 한 셀 아래로 회전 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.
    3. 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL로 세포 세척. 1 ml의 얼음 처럼 차가운 PBS와 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 resuspend. 단계 3.1.2에 의하여 centrifuge, 가만히 따르다, 그리고 얼음 세포를 떠나.
    4. 셀, 프로 테아 제 억제제 (RIPA 세포의 용 해 버퍼의 mL 당 100 X 억제제의 10 µ L)와 찬 radioimmunoprecipitation (RIPA) 세포의 용 해 버퍼의 약 200 µ L를 추가 소용돌이 15 분 동안 얼음에 품 어.
      참고: 효과적인 세포에 필요한 세포의 용 해 버퍼의 양을 셀 선으로 변화 하 고 실험적으로 결정 될 수 있다. RIPA 버퍼는 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1.0 %NP-40, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS 증류수에 구성 됩니다.
    5. 상대적으로 심지어는 immunoblots에 로드 되도록 각 lysate 메서드를 사용 하는 적절 한 Bradford 분석 실험 등에서 20 µ L 샘플에서 총 단백질 계량. 각 세포 lysate의 나머지 (약 180 µ L) 6 X Laemmli 세포의 용 해 버퍼의 약 40 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 열 블록 또는 물 욕조에 100 ° C에서 비등.
      참고: 6 X Laemmli 버퍼 300 mM Tris HCl (pH 6.8), 4% (w/v) SDS, 60% 글리세롤, 블루, 0.6% (w/v) bromophenol의 구성에 50 m m dithiothreitol (DTT) 증류수.
    6. 2 주 동안-20 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
  2. 모든 셀 라인 셀 줄은 관심의 가장 풍부한 단백질 결정의 immunoblot을 수행 합니다.
    참고: 마흐무드, T. 및 양, PC에 설명 된 절차를 따릅니다. 22, 다음 수정입니다.
    1. 약 수 microcentrifuge 튜브 lysate (에서 준비 단계 3.1) 포함 10-50 µ g (관심사의 단백질 풍부)에 따라 단백질의 세포. 6 X Laemmli 버퍼 및 15 µ L까지 볼륨에 충분 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼의 2.5 µ L를 추가 합니다.
    2. 스태킹 5% 고 해결 (예, 15-100 kDa 사이의 단백질에 대 한 10%)는 적절 한 농도 로드 단백질 사다리와 단계 3.2.1에서에서 샘플 SDS 페이지 젤. 빈 우물에 1 X Laemmli 버퍼를 로드 합니다. 적절 한 설정, 일반적으로 125 V, 80 분 또는 bromophenol 파랑 염료에 접시의 바닥을 도달할 때까지 전원 공급 장치를 실행 합니다.
    3. Wiedemann 외 에 설명 된 대로 세미 드라이 단백질 전송을 수행합니다 23.
      참고: 결과 위해 대표, 니트로 막 (이 메탄올에 배어 있이 필요 하지 않습니다), 찬 Bjerrum Schafer 닐슨 (BSN) 전송 버퍼 사용 했다. BSN 버퍼 48 mM Tris, 39mm 글리신, 증류수에 20% 메탄올 구성 됩니다.
    4. 전송 후 가로로 GAPDH 같은 적절 한 내부 통제 단백질에서 관심사의 단백질을 포함 하는 부분을 분리 하는 막 잘라 면도날을 사용 합니다.
    5. 주 항 체의 제조 업체에서 권장 하는 블로킹 버퍼를 사용 하 여 차단 하 고 항 체 외피를 진행 합니다.
      참고: 최적의 기본 항 체 희석 단백질 풍부 및 감도 따라 크게 달라질 수 있습니다. 아래의 대표 결과 대 한 관심사의 단백질에 항 체 GAPDH 컨트롤 필수 1:40,000 희석 1:1,000 희석이 필요 합니다. 사용 하는 이차 항 체의 희석 1:3, 000 이었다.
    6. 항 체 외피 막의 세척 후에, 샌드위치 가방 같은 투명 한 플라스틱 칼 집에서 막 스트립을 놓습니다.
    7. 제조업체의 지침에 따라 enchanced 화학 (ECL) 혼합물을 준비 합니다. P-1000 피 펫을 사용 하 여을 ECL 혼합 막 커버, 칼 집, 1-2 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 혼합 된 멤브레인 스트립을 품 어.
    8. 디지털 이미징 플랫폼에 막 칼을 놓습니다. 화학 및 색도계 마커 검출에 사용 하 여 캡처하는 막의 다양 한 노출.
      참고: 노출 시간 로드 단백질의 금액에 따라 달라 집니다, 그리고 대상 단백질의 풍부, 항 체 친 화력 등 몇 초 단위로 자동 노출 (일반적으로 몇 초), 및 테스트 노출 시간 위와 아래 시작.
    9. 경험적으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 가장 대상 단백질을 표현 하는 셀 줄 결정 또는.
  3. 직렬 희석을 사용 하 여 각 1 차 항 체의 선형 동적 범위를 찾아.
    1. 수행 단계 3.2.1-3.2.8 (단계 3.2.9에서에서 확인) 대상 단백질의 높은 농도 표현 하는 셀 라인에서 직렬 희석의 시리즈를 사용 하 여.
    2. ImageJ 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 노출 이미지에 densitometry 수행.
      1. 예를 들어 ImageJ를 사용 하 여 사각형 선택 도구를 사용 선택할 계량 하 젤의 첫 번째 레인. 이동 분석 | 젤 | 첫 번째 차선을 선택. 마우스를 사용 하 여 다음 차선에 결과 사각형 위로 이동. 이동 분석 | 젤 | 다음 차선을 선택. 반복적으로 다음 차선에는 사각형을 이동 하 고 레인의 나머지 부분에 대 한 차선을 선택 합니다.
      2. 이동 분석 | 젤 | 플롯 레인. 직선 도구를 사용 하 여 배경 소음을 제거 하려면 각 피크의 기지를 통해 라인을 그릴. 자동 선택 도구 사용 하 여 각 피크를 선택 하 고 이제부터 라고도 밴드 강도, 결과 창에서 각 피크의 밀도 수집 합니다.
    3. Densitometry 만들려고 scatterplot는 밴드 강도 대 의 총 단백질의 양을 각 1 차 항 체에 대 한 로드 출력을 사용 합니다. 최적 및 육안 검사의 라인을 사용 하 여 각 항 체의 선형 동적 범위의 위치 (강도 범위)을 결정 합니다.
    4. 모든 셀 라인으로 앞으로 이동 하는 농도 되도록 선형 범위의 높은 끝에 값을 생성 하는 단백질 농도 선택 합니다.
      참고:이 농도이 단백질의 가장 큰 금액으로 셀 라인에서 채도 수준 때문에, 거기 이상 되어야 합니다의 위험 노출 다른 셀 라인에 대 한 밴드.
  4. immunoblot 단계 3.3.4 모든 셀 라인에서에서 선택 단백질 농도 사용 하 여 수행 하 고 단계 3.2.1-3.2.8를 반복 합니다.
    1. 3.3.2 단계에서 디지털 스캔 densitometry를 수행 합니다. 3.3.3 단계에서 식별 된 각 항 체에 대 한 선형 범위 내에서 신호를 생성 하는 노출 이미지를 선택 합니다.
    2. 3.4.1에서 이상적인 노출에서 밴드 강도 신호를 사용 하 여 각 셀 라인에 대 한 컨트롤 밴드 강도 로드 하는 대상 단백질 밴드 강렬의 비율을 계산 합니다. 이 비율 값은 관심의 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 나타냅니다.
    3. 피어슨 상관 관계 테스트 수행 (할 수 있는 통계 소프트웨어 패키지를 사용 하 여) immunoblotting (3.4.2 단계)에서 얻은 그 단계의 경우 얼룩 (2.2) 이미지 분석에서 얻은 값을 연결할.

결과

이 프로토콜 FFPE 직물 구획으로 만든 셀 라인에서 안티-apoptotic 단백질 Bcl-2의 상대 수량을 결정 하는 경우의 기능 확인을 위해 사용 되었다. 암 세포에 선택적으로 측정 Bcl-2 종양 메커니즘을 명료 하 게 수 고 병 적인 진단 및 임상 관리 결정24알리는에서 유용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, Bcl-2 적절 한 B-lymphocyte 개발에 역할 그리고의 식은 일반적으로...

토론

메서드를 설명 하는 우리가 사용 하는 양적 immunoblotting (IB)의 면역 형광 검사 (면)의 유틸리티를 보여 FFPE 조직 샘플에서 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 ascertaining에 대 한. 현재 단백질 정량화 방법 비 IHC2,3, 등 그들의 명백한 자연 또는 균질 샘플, 샘플 구조와 세포 인구에 대 한 조사와 같은 방지 하는 필요에 의해 제한 됩니다. IB 및 질량 분석

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 프레드릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 (오전)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
697DSMZACC 42Cell line
JeKo-1ATCCCRL-3006Cell line
JurkatATCCTIB-152Cell line
RCH-ACVDSMZACC 548Cell line
Granta-519DSMZACC 342Cell line
REHDSMZACC 22Cell line
RajiATCCCCL-86Cell line
HeLaATCCCCL-2Cell line
Trypsin/EDTA solutionInvitrogenR001100For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS)Wisent Inc.81150To neutralize trypsin
Neutral Buffered FormalinProtocol245-684For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agaroseInvitrogen15517-022For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124Dako (Agilent)cat#: M088729-2, RRID: 2064429To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XTRoche-For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)Dako (Agilent)K4000For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)Dako (Agilent)K4002For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagentPerkin ElmerNEL745001KTFor immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-To view scanned slides
HALO image analysis softwareIndica Labs-For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)Thermo Scientific1862209To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)BioShopEDT001For RIPA buffer
NP-40BDH Limited56009For RIPA buffer
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750For RIPA buffer
GlycerolFisherBiotechBP229For Laemlli buffer
Bromophenol blueBioShopBRO777For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)Bio-Rad161-0374For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper)Bio-Rad1703969For blotting transfer
Nitrocellulose membraneBio-Rad162-0115For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cellBio-Rad1703940For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk)Cell Signaling Technology9999SFor blocking buffer
Tween 20BioShopTWN510For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibodyEpitomics2251-1Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibodyabcamcat#: ab6789, RRID: AB_955439Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibodyabcamcat#: ab6721, RRID: AB_955447Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substratesBio-Rad1705060For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600GE Healthcare Life Sciences29083461For immunoblot signal detection
ImageJ softwareFreeware, NIH-For densitometry analysis

참고문헌

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