Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

Riepilogo

Descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting per convalidare l'istologia di immunofluorescenza accoppiato con analisi dell'immagine come mezzo di quantificare una proteina di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE). I nostri risultati dimostrano l'utilità dell'istologia di immunofluorescenza per accertare la quantità relativa di proteine biomarcatore nei campioni di biopsia di routine.

Abstract

Quantificazione di proteine di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE) è importante negli studi clinici e applicazioni di ricerca. Un metodo ottimale di quantificazione è accurato, ha un'ampia gamma dinamica lineare e mantiene l'integrità strutturale del campione per consentire per l'identificazione dei tipi di cella singola. Attuali metodi quali immunohistochemistry (IHC), spettrometria di massa e immunoblotting ciascuno non riescono a soddisfare queste stipulazioni dovuto la loro natura categoria o bisogno di omogeneizzare il campione. Come metodo alternativo, proponiamo l'uso di immunofluorescenza (IF) e analisi dell'immagine per determinare l'abbondanza relativa di una proteina di interesse in tessuti FFPE. Qui dimostriamo che questo metodo è facilmente ottimizzato, produce un'ampia gamma dinamica e linearmente quantificabile rispetto il gold standard di immunoblotting quantitativa. Inoltre, questo metodo consente il mantenimento dell'integrità strutturale del campione e per la distinzione dei vari tipi di cellule, che può essere cruciale in applicazioni diagnostiche. Nel complesso, questo è un metodo affidabile per la quantificazione relativa delle proteine in campioni FFPE e può essere facilmente adattato per soddisfare le cliniche o esigenze di ricerca.

Introduzione

La necessità di quantificare le proteine nei campioni di biopsia di tessuto (FFPE) da formalina-fisse, paraffina-incastonato esiste in molti campi clinici. Ad esempio, quantificazione delle proteine di biomarcatore negli esemplari di biopsia di routine è usato per delucidare la prognosi e informare il trattamento per cancro pazienti¹. Tuttavia, gli attuali metodi sono in genere soggettivi e mancano di convalida.

Immunohistochemistry (IHC) è usato ordinariamente nei laboratori di patologia e generalmente dipende da un anticorpo primario direzionati alla proteina bersaglio e un anticorpo secondario coniugato con un'etichetta enzimatica come rafano perossidasi². IHC convenzionale è sensibile, può fare uso di minuto campioni e preserva l'integrità morfologica dei campioni di tessuto, permettendo la valutazione dell'espressione della proteina all'interno del contesto istologico pertinente. Tuttavia, perché il segnale cromogenico generato da IHC è sottrattivo, soffre di un intervallo relativamente ristretto di dinamico e offre un potenziale limitato per multiplexing^2,3,4. Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-MSI) di imaging preserva l'integrità morfologica. Tuttavia, questa tecnologia in via di sviluppo è associata con modesta risoluzione morfologiche e richiede notevole calibrazione e normalizzazione, alterando la sua fattibilità per uso clinico sistematico^5,6,7. Tecniche alternative per quantificare le proteine nei campioni di tessuto comprendono immunoblotting⁸, spettrometria di massa^9,10,11ed enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) dosaggio¹², ogni che comincia con un omogeneizzato lysate del tessuto del campione. Campioni di tessuto primario sono eterogenei, in quanto contengono una moltitudine di tipi di cellule. Di conseguenza, le tecniche che comportano l'omogeneizzazione dei campioni non consentono quantificazione di una proteina in una popolazione particolare cella di interesse come le cellule tumorali.

Come IHC, se è applicabile al piccolo FFPE campioni e consente il mantenimento di integrità istologica¹³. Tuttavia, grazie alla natura additiva dei segnali di fluorescenza, se è favorevole all'applicazione di molteplici anticorpi primari ed etichette fluorescenti. Così, una proteina di interesse può essere quantificata relativamente all'interno di celle specifiche o compartimenti cellulari (ad esempio, nucleo e citoplasma) definite utilizzando altri anticorpi. Segnali di fluorescenza hanno anche il vantaggio di una maggiore gamma dinamica^13,14. La superiorità, la riproducibilità e la potenziale multiplexing di se applicato a campioni FFPE è stata dimostrata^13,14,15.

Qui descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting utilizzando linee cellulari stabilizzate come gold standard per accertare la natura quantitativa di se accoppiato con analisi di immagine computerizzata nel determinare l'abbondanza relativa di una proteina di interesse in sezioni istologiche dai campioni di tessuto FFPE. Abbiamo applicato questo metodo con successo in un approccio multiplex per quantificare le proteine biomarcatore in clinica biopsia campioni^16,17,18.

Protocollo

Approvazione di utilizzare campioni di tessuti umani primari è stata ottenuta dalla Health Sciences e affiliati ospedali d'istruzione ricerca etica Board (HSREB) presso l'Università della Regina.

1. costruzione di un linea cellulare Tissue Microarray (TMA)

1. Raccogliere e lavare le cellule.
   Nota: Questo protocollo è stato testato su varie linee cellulari immortalizzate stabilizzate (per esempio HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
   1. Per le celle aderenti, raccolto circa 1.3 x 10⁷ cellule una volta che raggiungono circa confluency di 80%. Staccare le celle utilizzando un reagente appropriato per tale linea cellulare.
      Nota: Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) è in genere preferibile tripsina per ridurre il rischio di degradare le proteine di superficie. Se si utilizza tripsina, neutralizzare la tripsina utilizzando siero bovino fetale (FBS) immediatamente dopo la raccolta le cellule.
   2. Per cellule in sospensione, raccolto circa 8 x 10⁷ cellule in ritardo-fase di crescita.
   3. Raccogliere le cellule raccolte/staccato mediante centrifugazione per 5 min a 225 x g in una provetta conica da 50 mL.
   4. Decantare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x. Centrifugare per 5 min a 225 x g e decantare il supernatante.
      Nota: 1x PBS è composto da 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄ in acqua distillata; regolare il pH a 7.4.
2. Fissare le cellule in formalina e appallottolarli.
   1. Sospendere il pellet cellulare all'interno del tubo conico in 10 mL di formalina 10% neutra tamponata (NBF).
      Nota: NBF può essere preparata diluendo 1 mL di soluzione di riserva di formaldeide al 37% in 9 mL di 1X PBS.
      Attenzione: Prestare attenzione quando si maneggia la formalina e formaldeide. Utilizzare una cappa aspirante per passaggi riguardanti formalina e formaldeide.
   2. Incubare le cellule su un agitatore meccanico a 24 giri/min a temperatura ambiente durante la notte (circa 17 ore).
   3. Preparare una soluzione di 1% di agarosio basso punto di fusione in PBS (0,01 g di agarosio per 1 mL di PBS).
      1. Preparare abbastanza per 500 µ l di soluzione di agarosio per campione linea cellulare.
      2. Sciogliere l'agarosio in un 80 ° C acqua vasca o calore di blocco, con occasionali di miscelazione per 2-5 min. Una volta sciolto, mantenere la soluzione a 37 ° C acqua vasca o in calore per evitare l'indurimento.
   4. A pellet le celle fisse da passo 1.2.2 mediante centrifugazione per 5 min a 225 x g. eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS 1X.
   5. Trasferire le cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e pellet mediante centrifugazione per 5 min a 290 x g. aspirato tutto del surnatante.
3. Eseguire il cast le cellule in agarosio.
   1. ~ 500 µ l di soluzione di agarosio 1% (dal punto 1.2.3) in ogni provetta contenente le celle. Delicatamente, ma rapidamente, pipettare miscela su e giù utilizzando una micropipetta P-1000 a mescolare.
      Nota: Tagliare l'estremità della punta della pipetta per allargare l'apertura ed evitare la formazione di bollicine. Tenere la soluzione di agarosio di lavoro nel bagno d'acqua di 37 ° C per evitare l'indurimento.
   2. Lasciare la soluzione di agarosio-cella indurire (5-10 min) a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mL di 10% NBF per ogni microcentrifuga provetta contenente un campione e tenere a temperatura ambiente fino a (fino a 24 h) di inclusione a paraffina.
4. Preparare la spina dell'agarosi per inclusione in paraffina.
   1. Aspirate fuori le NBF dal campione.
   2. Rimuovere la spina di cella utilizzando una lama di rasoio per tagliare il tubo del microcentrifuge, inserire la spina in cassetta di plastica tessuto. Conservare le cassette a 10% NBF a temperatura ambiente.
5. Trattare i campioni durante la notte sia manualmente o utilizzando un processatore automatico e incorporare in cera di paraffina utilizzando metodi standard di istologia.
   Nota: Vedere Fischer et al. ¹⁹ per un protocollo di esempio.
6. Utilizzando uno speciale strumento "arrayer tessuto", vendemmia duplicati 0,6-mm anime dalla paraffina bloccano da ogni linea cellulare e inserirli, a righe, in un blocco di paraffina destinatario vuoto al fine di creare una linea cellulare di TMA.
   Nota: I metodi Standard devono essere utilizzati come quelli descritti in Fedor e De Marzo²⁰.
7. Incorporare il core da campioni primari che rappresenta 2-3 tipi di tessuto supplementare (ad es., tonsilla, del colon, testicoli, ecc.) come controlli positivi o negativi in TMA. Scegliere tessuti che sono appropriati per la proteina di interesse.
8. Utilizzare un microtomo per preparare due sezioni istologiche, circa 4-6 µm di spessore, della linea cellulare TMA. Montare la sezione in una diapositiva di istologia, asciugarlo e deparaffinizzare (come descritto in Fedor e De Marzo²⁰).

2. campione di colorazione di immunofluorescenza

1. Ottimizzare la diluizione dell'anticorpo primario.
   Nota: Esistono protocolli Standard per l'ottimizzazione di IHC oppure se per sezioni di tessuto FFPE come in Kajimura et al. ²¹. una breve panoramica dell'approccio è descritta qui.
   1. Preparare 4-5 diluizioni dell'anticorpo primario alla proteina di interesse guidati dalle istruzioni del produttore.
   2. Identificare un tipo di tessuto di controllo da un'origine animale o umana che esprime la proteina di interesse in popolazioni di cellule morfologicamente riconoscibile. Preparare le sezioni del tessuto e montarli su una diapositiva procedura immunohistochemistry standard come Fedor e De Marzo²⁰.
      Nota: Il numero di sezioni necessarie è il numero di diluizioni di anticorpo primario più uno supplementare.
   3. Utilizzando un sistema automatizzato o manuale per il immunohistology, testare le diluizioni di anticorpo primario dal punto 2.1.1 ogni su una diapositiva dal punto 2.1.2. Omettere l'applicazione dell'anticorpo primario dalla diapositiva supplementare e utilizzarlo come controllo negativo.
   4. Durante il processo di colorazione, colorare tutti i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) come una colorazione nucleare e un anticorpo secondario fluorescente contrassegnato. Se una maggiore sensibilità è necessaria, utilizzare un HRP (perossidasi di rafano)-coniugato anticorpo secondario e sistema di amplificazione del segnale basati su microarray (Vedi Stack et al. ¹³).
      Nota: Quando gli anticorpi primari di multiplexing, un'altra etichetta fluorescente viene utilizzata per ogni proteina.
   5. Scansione le diapositive immunostained con apposito strumento in grado di generare un file di immagine digitale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriato per i fluorofori utilizzati.
   6. Utilizzare software appropriato per visualizzare le immagini digitali e scegliere empiricamente la diluizione di anticorpo primario che ottimizza l'intensità del segnale rispetto a fluorescenza di fondo.
      Nota: Se lo si desidera, questa ottimizzazione può verificarsi usando un anticorpo secondario coniugato HRP, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) e microscopia in campo chiaro.
2. Eseguire se macchiatura sulla linea cellulare TMA.
   1. Utilizzare un sistema automatico o manuale per il immunohistology a macchiare una diapositiva della linea cellulare TMA con la diluizione di anticorpo primario ottimizzato (come determinato al punto 2.1). Omettere l'applicazione dell'anticorpo primario dalla seconda diapositiva e utilizzarlo come controllo negativo.
   2. Durante il processo di colorazione, colorare tutti i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) come una colorazione nucleare e con un anticorpo secondario e tyramide come descritto al punto 2.1.4.
   3. Scansione le diapositive immunostained con apposito strumento in grado di generare un file di immagine digitale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriato per i fluorofori utilizzati.
   4. Utilizzare un pacchetto di software di analisi di immagine per identificare il compartimento cellulare di interesse (cioè, citoplasma e nucleo) e quantificare l'intensità media di fluorescenza (MFI) per ogni linea cellulare.
      Nota: Vari pacchetti software possono essere utilizzati per questo scopo e molti sono discussi in Stack et al. ¹³.

3. quantitativo Immunoblotting di linee cellulari

1. Preparare lisati di cellule.
   1. Raccogliere 2 milioni le cellule di ogni linea cellulare, come descritto nei passaggi da 1.1.1 a 1.1.3.
   2. Selezione celle verso il basso per 5 min a 650 x g in una provetta conica da 50 mL. Decantare il supernatante.
   3. Lavare le cellule con 10 mL di PBS ghiacciata. Risospendere in 1 mL di PBS ghiacciata e trasferirlo in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare il secondo passaggio 3.1.2, decantare e lasciare celle sul ghiaccio.
   4. Aggiungere circa 200 µ l di tampone di lisi di radioimmunoprecipitation freddo (RIPA) con inibitori delle proteasi (10 µ l di inibitori di X 100 / mL di tampone di lisi RIPA) alle celle, vortex e incubare in ghiaccio per 15 min.
      Nota: La quantità di tampone di lisi necessaria per lisi efficace varia a seconda della linea cellulare e può essere determinata empiricamente. RIPA buffer è composto di 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% sodio desossicolato, SDS 0,1% in acqua distillata.
   5. Per garantire il caricamento relativamente anche sui immunoblots, quantificare la proteina totale in un campione di 20 µ l di ciascun lisato utilizzando un metodo appropriato, ad esempio, il saggio di Bradford. Aggiungere circa 40 µ l di tampone di lisi 6 X Laemmli per il resto (circa 180 µ l) di ogni cella lysata e far bollire a 100 ° C in un bagno di acqua o blocco di calore per 5 min.
      Nota: 6 X Laemmli buffer è composto di 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (p/v) SDS, 60% glicerolo, bromofenolo 0,6% (p/v), 50 mM dithiothreitol (DTT) in acqua distillata.
   6. Conservare i campioni a-20 ° C fino a due settimane.
2. Eseguire un immunoblot di tutte le linee di celle per determinare quale linea cellulare è la proteina più abbondante di interesse.
   Nota: Seguire la procedura descritta in Mahmood, T. e Yang, PC. ²², con le seguenti modifiche.
   1. In microcentrifuga aliquota cella lysate (preparati in fase 3.1) contenente 10-50 µ g di proteina (a seconda l'abbondanza della proteina di interesse). Aggiungere 2,5 µ l di 6 X Laemmli buffer e buffer di lisi RIPA sufficiente per rendere il volume fino a 15 µ l.
   2. Caricare un accatastamento del 5% e una concentrazione appropriata risoluzione (ad esempio, 10% per le proteine tra 15-100 kDa) gel di SDS-PAGE con una scaletta di proteina e i campioni dal punto 3.2.1. Caricare 1 X Laemmli buffer nei pozzetti vuoti. Eseguire l'alimentazione alle impostazioni appropriate, in genere 125 V, per 80 min o fino a quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del piatto.
   3. Eseguire un trasferimento di proteine semi-secco come descritto in Wiedemann et al. ²³.
      Nota: per ottenere risultati rappresentativi, una membrana di nitrocellulosa (che non deve necessariamente essere imbevuto di metanolo), e tampone di trasferimento freddo Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) sono stati usati. Buffer di BSN è composto da 48 mM Tris, glicina 39 mM, metanolo 20% in acqua distillata.
   4. Dopo il trasferimento, è possibile utilizzare una lama di rasoio per tagliare la membrana orizzontale per separare la parte contenente la proteina di interesse da una proteina di controllo interno appropriato, ad esempio GAPDH.
   5. Procedere al blocco e anticorpo incubazioni usando il tampone bloccante raccomandati dal produttore degli anticorpi primari.
      Nota: Le diluizioni di anticorpo primario ottimale possono variare notevolmente a seconda della sensibilità e abbondanza di proteine. Per i risultati rappresentativi di seguito, l'anticorpo alla proteina di interesse richiesto una diluizione di 1:1,000 mentre il controllo GAPDH richiesto una diluizione di 1: 40.000. La diluizione di anticorpi secondari utilizzati era 1:3, 000.
   6. Dopo le incubazioni dell'anticorpo e il lavaggio della membrana, posizionare le strisce di membrana in una guaina in plastica trasparente come un sacchetto di sandwich.
   7. Preparare enchanced miscela di chemiluminescenza (ECL) seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare una pipetta P-1000 per coprire la membrana con la miscela di ECL, chiudere la guaina e incubare le strisce di membrana con la miscela al buio a temperatura ambiente per 1-2 min.
   8. Posizionare la guaina di membrana in una piattaforma di imaging digitale. Utilizzare la chemiluminescenza e rilevazione colorimetrica marcatore per acquisire varie esposizioni della membrana.
      Nota: I tempi di esposizione variano in base alla quantità di proteina caricata, abbondanza di proteina bersaglio, affinità anticorpale ecc iniziano con un'esposizione automatica (in genere pochi secondi) e tempi di esposizione di prova sopra e sotto da incrementi di pochi secondi.
   9. Empiricamente, o utilizzando software di analisi di immagine, determinare quale linea cellulare esprime più proteina bersaglio.
3. Trovare la gamma dinamica lineare di ogni anticorpo primario utilizzando una diluizione seriale.
   1. Eseguire passaggi 3.2.1-3.2.8 utilizzando una serie di diluizioni seriali dalla linea cellulare che esprime la più alta concentrazione della proteina dell'obiettivo (identificata nel passaggio 3.2.9).
   2. Utilizzare software di analisi di immagine quali ImageJ per eseguire densitometria sulle immagini di esposizione.
      1. Ad esempio, utilizzando ImageJ, utilizzare lo strumento di Selezione rettangolare per selezionare il primo vicolo del gel per quantificare. Vai a analizzare | Gel | Selezionare primo Lane. Utilizzare il mouse per spostare il rettangolo risultante alla corsia accanto. Vai a analizzare | Gel | Selezionare Avanti Lane. Ripetutamente spostare il rettangolo alla corsia accanto e scegliere la corsia per il resto delle corsie.
      2. Vai a analizzare | Gel | Tracciare corsie. Utilizzare lo strumento Linea retta per disegnare linee attraverso le basi di ogni picco per rimuovere il rumore di fondo. Utilizzare la bacchetta magica per selezionare ogni picco e raccogliere la densità di ogni picco, qui di seguito definita intensità di banda, dalla finestra dei risultati .
   3. Utilizzare la densitometria uscita per creare un scatterplot della banda intensità contro la quantità di proteine totali caricati per ogni anticorpo primario. Utilizzando una linea di misura migliore e ispezione visiva, determinare la posizione (intervallo di intensità) della gamma dinamica lineare di ciascun anticorpo.
   4. Scegliere una concentrazione di proteina che genera un valore all'estremità superiore della gamma lineare di essere la concentrazione muovendo in avanti con tutte le linee cellulari.
      Nota: Poiché questa concentrazione è inferiore al livello di saturazione nella linea cellulare con la maggiore quantità di questa proteina, non ci dovrebbe essere alcun pericolo di eccessiva frequenza le bande per le altre linee cellulari.
4. Eseguire un immunoblot usando la concentrazione di proteina scelta al punto 3.3.4 per tutte le linee cellulari e ripetere i passi 3.2.1-3.2.8.
   1. Eseguire densitometria nelle scansioni digitali come descritto al punto 3.3.2. Scegli le immagini di esposizioni che producono segnali all'interno delle gamme lineari per ogni anticorpo identificato nel passaggio 3.3.3.
   2. Utilizzando i segnali di intensità di banda dall'esposizione ideale da 3.4.1, calcolare il rapporto di intensità di banda proteina bersaglio al caricamento di intensità di banda di controllo per ogni linea cellulare. Questi valori di rapporto indicano l'abbondanza relativa della proteina di interesse.
   3. Eseguire un test di correlazione di Pearson (può essere fatto utilizzando un pacchetto di software statistico) per correlare i valori ottenuti dall'analisi di immagine del se colorazione (punto 2.2) a quelli ottenuti da immunoblotting (punto 3.4.2).

Risultati

Questo protocollo è stato usato per confermare la possibilità di se per determinare la quantità relativa della proteina anti-apoptotica Bcl-2 nelle linee cellulari realizzati in blocchi di tessuto FFPE. Bcl-2 quantificare selettivamente nelle cellule tumorali può delucidare i meccanismi oncogenici e può essere utile nella diagnosi patologica e nell'informare le decisioni di gestione clinica²⁴. Più specificamente, Bcl-2 svolge un ruolo nel corretto sviluppo de...

Discussione

Abbiamo descritto un metodo che fa uso di quantitativi immunoblotting (IB) per dimostrare l'utilità di immunofluorescenza (IF) per accertare l'abbondanza relativa di una proteina dell'obiettivo nei campioni di tessuto FFPE. Attuali metodi di quantificazione della proteina sono limitati nella loro natura categorica, come cromogenico IHC^2,3, o dalla necessità di omogeneizzare campioni, impedendo di indagine nelle popolazioni delle cellule e la struttura del campi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
697	DSMZ	ACC 42	Cell line
JeKo-1	ATCC	CRL-3006	Cell line
Jurkat	ATCC	TIB-152	Cell line
RCH-ACV	DSMZ	ACC 548	Cell line
Granta-519	DSMZ	ACC 342	Cell line
REH	DSMZ	ACC 22	Cell line
Raji	ATCC	CCL-86	Cell line
HeLa	ATCC	CCL-2	Cell line
Trypsin/EDTA solution	Invitrogen	R001100	For detaching adhesive cells
Fetal bovine serum (FBS)	Wisent Inc.	81150	To neutralize trypsin
Neutral Buffered Formalin	Protocol	245-684	For fixing cell pellets
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	15517-022	For casting cell pellets
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124	Dako (Agilent)	cat#: M088729-2, RRID: 2064429	To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786
Ventana Discovery XT	Roche	-	For automation of immunofluorescence staining
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse)	Dako (Agilent)	K4000	For immunofluorescence signal amplification
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit)	Dako (Agilent)	K4002	For immunofluorescence signal amplification
Cyanine 5 tyramide reagent	Perkin Elmer	NEL745001KT	For immunofluorescence signal amplification
Aperio ImageScope	Leica Biosystems	-	To view scanned slides
HALO image analysis software	Indica Labs	-	For quantification of immunofluorescence
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)	Thermo Scientific	1862209	To add to RIPA buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop	EDT001	For RIPA buffer
NP-40	BDH Limited	56009	For RIPA buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	For RIPA buffer
Glycerol	FisherBiotech	BP229	For Laemlli buffer
Bromophenol blue	BioShop	BRO777	For Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0611	For Laemlli buffer
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB001	For immunoblot washes
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)	Bio-Rad	161-0374	For running protein gel
Filter paper (Extra thick blot paper)	Bio-Rad	1703969	For blotting transfer
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115	For blotting transfer
Trans-blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940	For semi-dry transfer
Skim milk powder (Nonfat dry milk)	Cell Signaling Technology	9999S	For blocking buffer
Tween 20	BioShop	TWN510	For wash buffer
GAPDH rabbit monoclonal antibody	Epitomics	2251-1	Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C)
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody	abcam	cat#: ab6789, RRID: AB_955439	Secondary antibody for immunoblot
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody	abcam	cat#: ab6721, RRID: AB_955447	Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5)
Clarity Western ECL substrates	Bio-Rad	1705060	For immunoblot signal detection
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	29083461	For immunoblot signal detection
ImageJ software	Freeware, NIH	-	For densitometry analysis