利用哺乳动物双杂交法检测雌激素受体α的配联域二维化活性

摘要

我们提出了一种方法来分析 4-羟基他莫西芬依赖雌激素受体α配体结合域二聚化活性的哺乳动物双杂交法。

摘要

雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。在物种中, erα蛋白的序列高度保守。人们认为人和小鼠的 erα功能是相同的。我们证明了差异 4-羟基他莫西芬 (4oht) 对小鼠和人 erα配体结合域 (lbd) 二聚化活性的影响, 使用哺乳动物双杂交 (m2h) 法。m2h 分析可以利用两个蛋白质表达质粒 (gal4 dna 结合域 [dbd] 融合 lbd 和 vp16 转活化域 [vp16ad] 融合 lbd) 的转染, 证明 lbd 在哺乳动物细胞中的共读活性的有效性。gal4 反应元件 (gal4re) 熔融荧光素酶报告质粒。当 gal4dbd 融合 lbd 和 vp16ad 融合 lbd 在细胞中产生二聚体时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 依赖转录活性激活荧光酶基因表达。用小鼠 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染的 hepg2 细胞的 4 oh 介导的荧光素酶激活率高于人 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染细胞。结果表明, 4oht 依赖性小鼠 erαlbd 共读活性高于人 erαlbd。一般来说, m2h 分析的使用并不理想于评估核受体 lbd 二聚化活性, 因为抗性配体增强了 lbd 活性的基础水平, 并阻碍了 lbd 二聚体活性的检测。我们发现4oht 不能增强 erα lbd 的基础活性。这是能够确定和检测与4oht 相关的 lbd 二聚化活性的关键因素, 以便成功地使用 m2h 检测。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究选择性雌激素受体调节剂 (如4oht) 在不同哺乳动物细胞类型中的部分激动剂活性。

引言

雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。erα的氨基酸序列在物种中高度保守。由于人类和小鼠 erα的同源性较高, 这些受体的功能被认为是相同的, 而这些物种中雌激素物质 (如他莫西芬) 的差异活性是由该物种在化学代谢, 而不是由 erα的结构差异。erα具有高度保守的域结构, 这些结构在核受体 (nr) 超家族中很常见, 被指定为 a 到 f 域。e 域或配体结合域 (lbd) 包括配体结合口袋和转录激活功能 2, 名为 af-2。f 域紧邻 e 域进行本地化, 是 nr 中变化最大的域。即使在人和小鼠 erα之间, f 域的同源性也明显低于其他域¹。erα的配体 lbd 增强了 erα蛋白的同质化, 直接结合特定的雌激素反应 dna 元素, 以调节木质依赖性基因转录 (erα的经典作用)。晶体学研究揭示了螺旋 12 (af-2 核域) 与雌二醇 (e2) 或 4-羟基-他莫西芬 (4oht) 结合 lbd 二聚体^2,3的差异定位。erαf 域 (45个氨基酸) 直接连接螺旋12。然而, 没有关于这种扩展45氨基酸 (f 域) 从螺旋12对 erα lbd 二聚化的影响的信息。在这项研究中, 我们证明了 f 域的贡献, 特定于物种依赖的 eα lbd 同质化使用哺乳动物双杂交 (m2h) 的分析。

m2h 检测是一种证明哺乳动物细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的方法, 它引入了三种不同的质粒 dna: 两种蛋白表达质粒, 表达了 gal4 dna 结合域 (dbd) 融合 erαlld 和 vp16ad 融合 erαldd, 和gal4re 熔融荧光素酶表达报告质粒。当 gal4dbd 融合 erαlbd 和 vp16ad 融合 erα lbd 在细胞中相互作用 (使二聚体) 时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 相关的转活化功能激活荧光酶基因表达。lbd 共氧化水平可以通过荧光素酶活性来评价。

酵母双杂交 (y2h) 检测是一种基于与宿主环境相同的原理的替代方法。以前使用 y2h 系统的报告表明, f-域截断人 erα lbd 增加了 e2 依赖协同剂的招募, 结论是 f 域阻止 e2 介导^的转录4。这一结果与其他报告不一致, 这些报告表明 f-域截断人 erα在哺乳动物细胞^5,6中的衰减转录活性。最近, 我们的研究表明, 利用 m2h 系统, 人类 erαlbd 的 e2 依赖共激活剂的招募活性在哺乳动物细胞中的 f 域截断降低, 并与转录活性¹一致。这些观察表明, 蛋白质-蛋白质相互作用的生理作用在细胞类型特定的方式和背景不同。m2h 检测可以在用于确定转录活性的同一细胞环境中显示蛋白质-蛋白质相互作用。与 M2H 或其他体外蛋白质-蛋白质相互作用分析相比, 这提供了 m2h 分析的优势。

关于选择性雌激素受体调节剂 (serm) (例如, 4oht) 调节 erα介导的转录的部分激动剂活性的分子机制仍存在疑问。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究各种哺乳动物细胞类型中 serm 的部分激动剂活性的机制。

研究方案

1. 哺乳动物双杂交法质粒的制备

1. 使用以下质粒: pg5-luc、pbind-erαef 和 apst-erαef。
   注: 这些质粒可根据要求从作者处获得, 并通过滤纸发送。pg5-luc 是一种带记者的质粒, 它包含与荧光素酶表达单元融合的 gal4 反应元素的5次重复 (图 1a)。pbind-erαef 是 gal4dbd-熔融 erα lbd 蛋白的蛋白表达质粒。pbind-erαef 包含一个雷尼利亚荧光素酶表达单位, 用于使转染效率正常化 (图 1b)。pact-erαef 是 vp16ad-融合 erα lbd 蛋白的蛋白表达质粒 (图 1c)。从质粒中表达的蛋白质结构图如图 2所示。
2. 准备质粒 dna。
   1. 用干净的剪刀将塑料装载区域从纸张上剪下, 放入 1.5 ml 管中。戴上手套, 用干净的推子拿起装有等离子体的纸。加入100μl 的 tris-edta (te) 缓冲液 (ph 8.0) 和涡旋。
   2. 从步骤1.2.1 到合格的大肠杆菌细胞 (见材料表), 加入 1μl 的质粒 dna 溶液, 并将管放在冰上15分钟。
   3. 热休克等离子体添加的有能力细胞;在42°c 的水浴中孵育管 30秒, 然后在冰上保持2分钟。
   4. 在试管中加入250μl 的超最佳肉汤, 并在管道中进行分解代谢抑制 (soc) 介质 (室温), 并在37°c 下晃动30分钟培养。
   5. 将培养的大肠杆菌板100μl 放在预热的尿液 (lb) 板上, 并在37°c 下培养。
   6. 从盘子中取出一个菌落, 加入一个14毫升的管中, 其中含有2毫升的了不起的肉汤 (tb), 含有100μml 的氨匹西林。在37°c 时晃动直到介质被微弱地笼罩的培养。
   7. 从步骤1.2.6 将培养的培养基添加1毫升, 加入装有50毫升结核病的高压灭菌250毫升玻璃瓶, 并含有100μgml 氨匹西林。在37°c 下晃动20-24小时的培养。
   8. 使用摇桶转子, 在室温下将培养的大肠杆菌转移到50毫升锥形管和离心机 , 温度为 3450 x g, 时间为30分钟。丢弃介质。将大肠杆菌颗粒保存在-80°c。
   9. 在大肠杆菌颗粒中加入3毫升细胞再悬浮液 (见材料表), 并将其完全悬浮。加入3毫升的细胞裂解溶液 (见材料表), 将管轻轻搅拌 10倍, 并将其保持在冰上 5分钟 (准时保持时间)。加入6毫升的中和溶液 (见材料表), 将管材稳定地与攻丝混合, 然后在冰上保持10分钟。
   10. 使用摇桶转子, 在4°c 下以 3450 x g的温度离心管30分钟。将含有 dna 的溶液转移到新的50毫升锥形管, 并添加10毫升的 dna 纯化树脂 (见材料表)。轻轻悬挂树脂。
   11. 用摇桶转子以 625 x 克的速度离心管1分钟。丢弃溶液并将树脂保持在底部。
   12. 在50毫升锥形管中加入15毫升柱状洗涤液 (80 mm 醋酸钾、8.5 mm Tris-HCl [ph 7.5]、40μm edta 和55% 乙醇), 轻轻摇匀以树脂。重复步骤1.2.11。
       注: 柱状洗涤液必须使用经过二乙基碳酸氢盐 (depc) 处理的水或无核酸水制备。
   13. 在50毫升锥形管中加入5毫升柱状洗涤液, 用5毫升管悬浮树脂。将树脂涂在真空歧管上设置的柱 (见材料表) 上。将色谱柱吸尘, 直到树脂干燥。在柱和真空中加入6毫升柱状洗涤液。
   14. 一旦树脂在视觉上干燥, 将储层从柱中分离出来。将色谱柱 (树脂) 的底部转移到 1.5 ml 管中。用微型离心机将树脂以最大速度离心2分钟。
   15. 将色谱柱 (树脂) 的底部转移到新的 1.5 ml 管中。在柱中加入300μl 的无核酸酶水, 并等待整个树脂被浸泡。
   16. 以最大速度离心柱 1分钟, 收集含有 dna 的质粒溶液 (200-250μl)。
   17. 用酚氯仿 (1:1) 处理含有 dna 的溶液, 然后用氯仿处理, 如下所示。
       1. 在含 dna 的溶液 (200-250μl) 中加入相同体积的苯酚-氯仿 (1), 用微型离心机以最大速度摇匀和离心机2分钟。收集上层 (含 dna 溶液), 并将其添加到一个新的 1.5 ml 管。重复此步骤1x。
       2. 将相同体积的氯仿添加到含有 dna 的溶液 (200-250μl) 中, 以最大速度摇匀, 离心机1分钟收集上层 (含 dna 溶液), 并将其添加到 1.5 ml 管中。
          注: 内毒素 (脂多糖) 在某些细胞中诱导细胞信号。为了避免这种不可预测的影响, 建议采取步骤 1.2.17, 这样可以减少内毒素污染。
   18. 利用乙醇沉淀技术沉淀质粒 dna, 如下所示。
       1. 在含 dna 溶液中加入 3 m 醋酸钠 (ph 5.5) 和2倍的3m 醋酸钠体积, 即100% 乙醇。例如, 在 dna 溶液的250μl 中加入27.8μl 的 3 m 醋酸钠和278μl 的100% 乙醇 (最终体积为 555.8μl)。
       2. 将溶液保持在-80°c, 至少20分钟。在4°c 下以最大速度离心20分钟。丢弃溶液并保留颗粒。加入200μl 的75% 乙醇, 并冲洗管内。在4°c 下离心 20分钟, 丢弃溶液, 并保留颗粒。使用真空集中器擦干 dna 颗粒。
       3. 在管中加入 100-250μl te 缓冲液 (ph 值 8.0)。溶解 dna 颗粒, 并使用分光光度计检查 dna 浓度的波长为260纳米。将 dna 浓度保持在 0.5 mg/ml 左右。

2. 哺乳动物双杂交法

1. 维护单元格。
   1. 用750毫升、175^{厘米 2}组织培养瓶培养人类肝癌 hepg2 细胞, 用无酚最低必需培养基 (mL) 补充10% 的胎牛血清 (fbs; 热灭活)、2mm l-谷氨酰胺和1%青霉素链霉素溶液 (抗生素) 用于维持细胞。
   2. 在5% 的 co2 补充, 37°c 的孵化器培养细胞, 直到细胞约90% 融合.
      注: 为了减少雌激素的背景活性, 所有 m2h 实验都应使用无酚的无红色介质。这一步骤应在清洁的工作台/生物安全柜内进行。细胞应按照一般哺乳动物细胞培养协议⁷进行维护。
2. 准备转染的细胞。
   注: 应在清洁工作台/生物安全柜内执行以下程序步骤。在这一步中, 细胞每次都在5% 的 co2补充、37°c 的孵化器中培养。
   1. 将90% 的融合细胞重新装上24孔板;用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 冲洗细胞1x。
   2. 在培养瓶中加入7毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta 溶液, 浸泡细胞 1-2分钟, 同时在室温下将培养瓶保持在干净的长凳上。取出部分胰蛋白酶 edta 溶液, 并将溶液的 1-2 ml 留在培养瓶中。在孵化器中孵育培养瓶1-2分钟。
   3. 在烧瓶底部打分离细胞, 并在显微镜下检查细胞。
      注: 如果细胞仍连接到烧瓶上, 再孵育 1-2分钟, 然后重复步骤2.2.3。
   4. 将细胞悬浮在无酚红素 mM 中, 辅以10% 的含焦 fbs (热灭活)、2mm l-谷氨酰胺和1% 的青霉素链霉素溶液。
      注: 必须使用带菌剥离的 fbs 来减少血清中源性雌激素的影响。
   5. 在 1.2 x 10 5 细胞的密度下, 在24孔板中计数细胞数量和种子细胞。为每个数据点分配三口井 (三式三份)。
   6. 培养细胞一夜之间。继续2.4.1 步骤。
3. 准备用于转染的 dna 混合物。
   注: 以下质粒 dna 在一口井中转染: 100 ng pg5-luc 报告质粒、50个 g4dbd 融合蛋白表达质粒 (pbind) 和 50 ng vp16ad 融合蛋白 (pact) 表达质粒。
   1. 要分析配体依赖性 erα lbd 二聚化活性, 请准备以下组合 (图 3)。组合 (i): pg5-luc + pbind-erαef + pact, 和 pg5-luc + pbind-merαef + pact。组合 (二): pg5-luc + pbind-erαef + pact-erαef, 和 pg5-luc + pcind-merαef + pact-erαef。组合 (三): pg5-luc + pG5 + pact-erαef, 和 pg5-luc + pG5 + acct-merαef。
      注: 组合 (i) 分别代表人 erα lbd 和小鼠 erα lbd 的基本实验水平。如果结果显示单独使用配体的水平非常高, 这种方法与该配体一起使用是不可行的 (例如, 二乙基雌石 [des])。组合 (ii) 分别代表二聚体人 erα lbd 和二聚体小鼠 erα lbd 的水平。组合 (三) 表示负对照;仅当第一次执行实验以评估系统的背景级别时, 才使用此集。
   2. 在混合之前, 根据转染井的数量计算所需的 dna 总量。对于在三联和五个数据点进行的实验, 将以下质粒 dna 混合在两个1.5 μl 管中, 用于组合 (i) 和 (ii): pg5-luc, 5 (数据点) x 3 (井) x 100 ng = 1, 500 纳克 (15μl);pbind-merαef, 5 (数据点) x 3 (井) x 50 纳克 = 750 纳克 (7.5μl);pact (组合 i) 或 pact-merαef (组合 ii)、5 (数据点) x 3 (井) x 50 纳克 = 750 纳克 (7.5 μl)。
      注: 每个质粒 dna 溶液的浓度为0.1μμμl。
   3. 利用乙醇沉淀技术沉淀 dna 混合物。在 dna 混合物中加入 3 m 醋酸钠 (ph 5.5) 和2倍的3m 醋酸钠体积, 即100% 乙醇。然后, 旋涡管。
      注: 例如, 在步骤2.3.2 中举例说明的30μl 质粒 dna 混合物中加入3.4 微米的 3 m 醋酸钠, 并加入34μl 的100% 乙醇。此步骤有助于保持不变的转染条件, 并且不需要在生物安全柜中执行此步骤。
   4. 将混合物保持在-20°c 过夜。在4°c 下, 以最大速度离心20分钟。丢弃溶液 (颗粒是不可见的)。在试管中加入120μl 的75% 乙醇;然后, 冲洗管的内部。在4°c 下离心20分钟。丢弃溶液, 使用真空集中器将 dna 混合物干燥30分钟。
4. 执行转染。
   注: 应在干净的长凳或生物安全柜中执行以下步骤。
   1. 第二天早上, 用 0.5 ml 的 pbs (室温) 冲洗24孔板 (从步骤 2.2.6) 2 x 中播种的细胞。
   2. 在每口井 (0.5 ml/井) 中加入温热 (37°c) 新鲜的无红的 mM, 再加上10% 的带木炭的 fbs (热灭活) 和 2 mm l-谷氨酰胺, 而不添加抗生素。将细胞保存在5% 的二氧化碳_补充, 37°c 的孵化器中。
   3. 悬浮在 dulbecco 改性的 eagle 培养基 (dmem) 中的干质粒 dna 混合物 (从步骤 2.3.4) (无血清, 不含苯酚红色, 无谷氨酰胺; 13μl/well)。根据转染井的数量计算 dmem 的数量。
      注:15 口井用于组合 (i) x 13μl = 195μl, 15 口井用于组合 (ii) x 13μl = 195μl。
   4. 将转染试剂 (见材料表; 1.5μl/well) 悬浮在另一个 1.5 ml 管中的 dmem (12.5μl·well) 中。从转染井的数量计算转染试剂和 dmem 的数量。
      注:30 [15 口井用于组合 (i) 和15口组合 (ii)] x 1.5μl 转染试剂 + 30 x 125μl 的 dmem = 420μl。
   5. 在每个管中添加相同数量的转染试剂介质 (从步骤 2.4.4) (从步骤 2.4.3)。在室温下将管材孵化5-10分钟。
      注: 转染试剂介质 + 195μl 组合 (i) dna 混合物 = 395μl, 转染试剂介质 + 195μl 组合 (ii) dna 混合物 = 395μl。在组合 (i) 和 (ii) 的试管中添加等量的转染试剂介质是很重要的。在这一步中, 没有必要用完介质。
   6. 将组合混合物 (从步骤 2.4.5) 添加到24井板的每口井 (25μl·well) 中 (从步骤 2.4.2), 并在 5% co 2-补充的37°c 孵化器中孵育细胞6小时。
   7. 从24孔板上取出转染介质。加入温热 (37°c) 新鲜的无红蛋白 mM, 辅以10% 的含焦 fbs (热失活)、2 mm l-谷氨酰胺、1% 的青霉素链氨酸溶液和配体 (悬浮在乙醇中) (0.5 ml medium/well)。在 5% co 2 补充、37°c 孵化器中培养细胞 16-18小时.
5. 收集样品。
   1. 用1毫升的 pbs 冲洗细胞, 然后加入100μl 的1x 被动裂解缓冲液 (见材料表)。
   2. 用涡流混合器大力摇晃24孔板, 使细胞分离。
   3. 用液氮将板材 (细胞裂解物) 冷冻 1x, 或在分析前将其保存在-80°c。在检测前, 用力摇晃振动台上的盘子, 直到它们处于室温。
      注: 此过程可防止不规则地出现不规则的荧光素酶活性值。
6. 进行双荧光素酶检测。
   1. 为双荧光素酶检测系统准备试剂 (见材料表)。
      1. 为使荧光素酶分析底物 (las) 缓冲液中加入所有荧光素酶分析缓冲液, 并将其添加到玻璃棕色瓶中的荧光素酶分析基板中。将 las 缓冲区保存在-20°c。
         注: las 缓冲液在使用前应加热至室温。
      2. 为了使雷尼利亚荧光素酶底物 (rls) 缓冲液, 将雷尼拉荧光素酶底物和雷尼拉荧光素酶缓冲液混合在1:50 的比例下。为每次检测制作新鲜的 rls 缓冲液, 并使用黑色管或被锡油遮挡的管。计算 rls 缓冲区的数量, 使一个新的缓冲区。
         注: 使用前, rls 缓冲液应加热至室温。
   2. 在微板读取器中设置试剂。
      1. 用70% 乙醇清洗注塑生产线 2倍;然后, 用水清洗2倍的线路。
         注: 这对于防止干扰检测结果非常重要。
      2. 将 las 缓冲区设置为 p 型喷射器线 (第一次注入), 并将 rls 缓冲区设置为 m 型喷射器线 (第二次注入)。不要混合这些缓冲区。rls 缓冲抑制荧光素酶活性。
   3. 将10μl 采集的样品 (从步骤 2.5.3) 涂在96井白色塑料板上。
   4. 将以下设置应用于微板读取器。对于 p 型喷射器, 使用50μl 的体积, 2秒的延迟, 速度为50μls/。对于 m 型喷射器, 使用50μl 的体积, 延迟为 2秒, 速度为 50μlss. 将积分时间设置为 15秒. 将温度设置为25°c。
   5. 运行微板读取器。
   6. 使用数据采集程序记录荧光素酶活性值 (ipvalue) 和雷尼利亚荧光素酶活性 (imvalue) 的值 (见材料表)。
   7. 数据收集后清洗注入行 (请参阅步骤 2.6.2.1)。
7. 执行数据分析。
   1. 使用规范化值 (ipvalue/imvalue) 进行数据分析。
   2. 将组合 (i) [pg5-luc + pbind-erαef + pact] 与车辆 (0 nm 配体) 的归一化值设置为 1, 用于计算基底水平和同读 erα lbd 水平。级别表示为 "相对活动"。

结果

图 3显示了组合 (i) 和组合 (ii) 等离子体转染细胞中可能的响应方案。实验结果如图 4所示。组合 (i) (pg5-luc + pbind-merαef + pact) 的活性显示 10 nm e2 的刺激 (图 4a), 因为 erα lbd 包含配体依赖性的失活功能域 af-2。与 erα lbd 结合的农学体 (例如e2) 招募转录共动剂到 af-2 域。此事件导致转录激?...

讨论

在此, 我们描述了 m2h 检测的方案, 重点介绍了检测 erα lbd 共读活性的检测条件。一般来说, m2h 检测是不受欢迎的评估配体依赖 erα lbd 二聚化活性。这是由于 erα lbd 具有转录激活功能;在某些情况下, 其活性会干扰 m2h 测定的结果。然而, 正如我们在这里所证明的, m2h 分析可用于分析某些不激活 lbd af-2 转化功能的物质 (例如, 4oht, serm) 的 lbd 二聚体活性。为了减少 lbd (背景活动) 的内在活性, 我?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pG5-Luc	Promega	E249A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND	Promega	E245A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT	Promega	E246A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010
Centrifuge Rotor	SORVALL	75006445
Swing Buckets	SORVALL	75006441
Cell Resuspension Solution (CRA)	Promega	A7112
Cell Lysis Solution (CLA)	Promega	A7122
Neutralization Solution (NSA)	Promega	A7131
Column Wash Solution (CWB)	Promega	A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin	Promega	A7701
Wizard Midicolumns	Promega	A7651
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054
Penicillin-Streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS)	Gemini-Bio	100-106	Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-119	Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red	Gibco	31053028	for transfection
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027
Passive Lysis 5X Buffer	Promega	E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1980
SpectraMax L microplate reader	Molecular Devices
SoftMax Pro Software	Molecular Devices