JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שיטה לניתוח את 4-הידרוקסי-טמוקסיפן-תלוי הקולטן אלפא ליגנד מחייב תחום dimerization פעילות האסטרוגן שימוש בתרבית של שני-היברידית וזמינותו.

Abstract

אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. הרצף של חלבון ERα מאוד כולו בין המינים. זה כבר חשבה כי תפקידו של האדם והעכבר ERαs הוא זהה. נדגים את ההשפעה דיפרנציאלית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן (4OHT) על ERα ליגנד מחייב תחום (LBD) dimerization פעילות אנושית שימוש בתרבית של שני-היברידית (M2H) וזמינותו של עכבר. וזמינותו M2H יכולים להדגים את היעילות של פעילות של homodimerization LBD בתרבית של תאים, ניצול של תקנים של חלבון שני ביטוי פלסמידים (דנ א GAL4 מחייב תחום [DBD] פיוז'ן LBD ו- VP16 transactivation תחום [VP16AD] פיוז'ן LBD) ו- a אלמנט מגיב GAL4 (GAL4RE) התמזגו לוציפראז כתב פלסמיד. כאשר GAL4DBD פיוז'ן LBD ופיוז'ן VP16AD LBD להפוך דיימר בתאים, חלבון זה מורכב נקשר GAL4RE ומפעילה, ואז, ביטוי גנים לוציפראז דרך הפעילות תלויה שעתוק VP16AD. הפעלת לוציפראז בתיווך 4OHT הוא גבוה יותר בתאים HepG2 היו transfected עם העכבר ERα LBD פיוז'ן חלבון ביטוי פלסמידים יותר בתאים אנושיים ERα LBD פיוז'ן חלבון ביטוי פלסמיד transfected. תוצאה זו עולה כי יעילותם של העכבר 4OHT תלויי-ERα LBD homodimerization פעילות הוא גבוה יותר מאשר LBD ERα האנושית. באופן כללי, הניצול של וזמינותו M2H אינה אידיאלית עבור הערכת קולטן גרעיני LBD dimerization פעילות, כי היתה ללא-חת ליגנדים לשפר את רמת הבסיס של הפעילות LBD ופוגע זה הגילוי של פעילות dimerization LBD. . מצאנו שאת 4OHT אינו משפר פעילות הבזליים ERα LBD. זה גורם מפתח עבור היכולת לקבוע ולגלות את הפעילות dimerization LBD תלויי-4OHT לשימוש בהצלחה את הבדיקה M2H. ניתן להחיל מבוסס-ERα LBD מבחני M2H ללמוד את הפעילות אגוניסט חלקי של קולטן אסטרוגן סלקטיבי מאפננים (למשל, 4OHT) בסוגים שונים בתרבית של תאים.

Introduction

אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. Sequenceof חומצת אמינו ERα מאוד כולו בין המינים. בגלל הומולוגיה גבוה יותר בין בני האדם ואת העכבר ERα, הפונקציה של רצפטורים אלו נחשב כזהה ולאחר הפעילות דיפרנציאלית של חומרים אסטרוגניים (למשל, טמוקסיפן) של מינים אלו נגרמת על ידי ההבדלים המינים שיטות ההזנה כימי ולא על-ידי ההבדלים המבניים של ERα. ERα יש מאוד והתפאורה במבנים תחום נפוצה בקרב superfamily גרעיני קולטן (ע נ), איזור A לתחומים F. התחום E או תחום מחייב ליגנד (LBD) כוללת את הכיס ליגנד מחייב והפונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק 2, בשם AF-2. תחום F הוא מקומי ומייד בסמוך לקבוצת המחשבים E, הוא תחום משתנה ביותר בקרב NRs. גם בין האדם העכבר ERα, הומולוגיה של התחום F היא נמוכה באופן משמעותי מזו של שאר התחומים1. LBD ERα של ליגנד מכורך מגביר את homodimerization של החלבון ERα לאגד שהרכיב הספציפי DNA מגיב אסטרוגן ישירות לוויסות שעתוק גנים תלויי-ליגנד (פעולה קלאסי של ERα). מחקרים לחקר הגבישים גילו מיקום דיפרנציאלית של סליל 12 (AF-2 המחשבים) עם אסטרדיול (E2) - או 4-הידרוקסי-טמוקסיפן (4OHT) - מאוגד LBD הדימרים2,3. התחום ERα F (חומצות אמינו 45) להתחבר סליל 12 ישירות. עם זאת, יש אין מידע לגבי ההשפעה של הרחבה זו של חומצות אמינו 45 (תחום F) מ הסליל 12-dimerization ERα LBD. במחקר זה, נדגים את התרומה של התחום F בו homodimerization ERα LBD תלויי-4OHT תלויי מין תוך שימוש assay (M2H) של שני-היברידית יונקים.

הבדיקה M2H היא שיטה להפגין אינטראקציות חלבון בתאים בתרבית של מציגה את DNAs פלסמיד אחר שלושה: שני פלסמידים ביטוי חלבון, אשר אקספרס GAL4 DNA מחייב תחום (DBD) fusion פיוז'ן ERα LBD ו VP16AD ERα LBD, ו- a לוציפראז התמזגו GAL4RE ביטוי כתב פלסמיד. מתי הפיוז'ן GAL4DBD ERα LBD ופיוז'ן VP16AD ERα LBD אינטראקציה (להפוך דיימר) בתאים, חלבון זה מורכב נקשר GAL4RE ומפעילה, ואז, ביטוי גנים לוציפראז באמצעות הפונקציה transactivation תלויי-VP16AD. ניתן להעריך את רמת LBD homodimerization על ידי הפעילות לוציפראז.

וזמינותו שמרים 2-היברידית (Y2H) היא שיטה חלופית המבוססת על אותו עיקרון המשתמשת שמרים כמו הסביבה המארח. בדו"חות קודמים באמצעות מערכת Y2H הוכיח כי F-תחום-קטום LBD ERα האנושי מגביר גיוס coactivator תלויי-E2, מסכמים כי התחום F מונעת שעתוק בתיווך E24. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים אשר הדגימו פעילות גנים ברמת השעתוק הקלוש של F-תחום-נחתך ERα האנושי ב-5,בתרבית של תאים6. לאחרונה, המחקר שלנו, באמצעות מערכת M2H, הפגינו פעילות גיוס coactivator תלויי-E2 LBD ERα האנושי מופחת לפי F לחיתוך תחום בתאים בתרבית של וזה עולה בקנה אחד עם פעילות שעתוק1. מקרים אלה מצביעים על תפקיד פיזיולוגי אינטראקציית חלבון-חלבון שונה באופן ספציפי סוג התא, ההקשר. וזמינותו M2H יכולים להפגין פעילות אינטראקציה חלבון באותו הקשר הסלולר המשמש לקביעת תעתיק הפעילות. זה מספק יתרון של וזמינותו M2H לעומת Y2H או אחרים במבחנה חלבון אינטראקציה ניתוחים.

נותרו שאלות הנוגעות המנגנונים המולקולריים של הפעילות אגוניסט חלקי של קולטן אסטרוגן סלקטיבי מאפננים (SERMs) (למשל, 4OHT) כדי לווסת את תמלול בתיווך ERα. ניתן להחיל מבוסס-ERα LBD מבחני M2H ללמוד את מנגנון הפעילות אגוניסט חלקי של SERMs בסוגים שונים בתרבית של תאים.

Protocol

1. הכנה של פלסמידים וזמינותו שני-היברידית יונקים

  1. להשתמש את פלסמידים הבאים: pG5-לוק ', ' pBIND-ERαEF, ברית-ERαEF.
    הערה: פלסמידים הינם זמינים מן המחברים על פי בקשה, נשלחים על נייר סינון. pG5-לוק הוא פלסמיד כתב המכיל חמש חזרה של GAL4 אלמנטים מגיב התמזגו עם יחידת ביטוי לוציפראז (איור 1א'). pBIND-ERαEF הוא פלסמיד ביטוי חלבון LBD ERα GAL4DBD התמזגו חלבונים. pBIND-ERαEF מכיל יחידה ביטוי לוציפראז Renilla עבור נרמול היעילות תרביות תאים (איור 1B). ברית-ERαEF הוא פלסמיד ביטוי חלבון של החלבונים עם נתיך VP16AD LBD ERα (איור 1C). הדיאגרמה של מבנה החלבון ביטוי של פלסמידים מוצג באיור2.
  2. להכין פלסמיד DNAs.
    1. לחתוך את האזור עמוס פלסמיד מהעיתון באמצעות מספריים נקי והכניס אותו לתוך צינור 1.5 מ. יש ללבוש כפפות ולהשתמש פינצטה נקי כדי לאסוף את הנייר טעון פלסמיד. להוסיף 100 µL טריס-EDTA (TE) מאגר (pH 8.0) ו מערבולת היטב.
    2. להוסיף 1 µL של הפתרון דנ א פלסמיד מהשלב 1.2.1 כדי המוסמכת Escherichia coli תאים (ראה טבלה של חומרים) ולשמור את הצינורית על קרח למשך 15 דקות.
    3. חום-הלם פלסמיד-נוסף תאים המוסמכת; דגירה של צינור באמבט מים 42 ° C ל 30 s ולאחר מכן, לשמור אותם על קרח למשך 2 דקות.
    4. להוסיף 250 µL מרק סופר אופטימלית catabolite הדיכוי (SOC) בינונית (טמפרטורת החדר) צינור והתרבות ברעידות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. צלחת 100 µL של החיידק בתרבית על צלחת מרק (LB) לוריא prewarmed עם 100 אמפיצילין µg/mL (10 ס מ קוטר תבשיל) והתרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    6. לבחור אחד המושבה מהצלחת והוספתו לתוך צינור 14 מ"ל, המכיל 2 מ ל מרק נהדר (TB) עם 100 אמפיצילין µg/mL. תרבות ברעידות ב 37 ° C עד המדיום באופן עמום מטושטשת.
    7. להוסיף 1 מ"ל של המדיום בתרבית מ שלב 1.2.6 הבקבוק בלוק 250 מ ל זכוכית המכיל 50 מ של טרה-בתים עם 100 אמפיצילין µg/mL. תרבות ברעידות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 שעות.
    8. להעביר את בתרבית e. coli צינור חרוטי 50 מ ל ו צנטריפוגה ב x 3,450 g בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות באמצעות הרוטור סווינג-דלי. למחוק את המדיום. שמור בגדר e. coli ב-80 מעלות צלזיוס.
    9. להוסיף 3 מ"ל של תא resuspension פתרון (ראה טבלה של חומרים) e. coli הצניפה ו להשעות אותו לחלוטין. להוסיף 3 מ"ל של פתרון פירוק התא (ראה טבלה של חומרים), ערבוב הצינור בעדינות על-ידי היפוך זה 10 x, לשמור את זה על קרח במשך 5 דקות (לשמור את הזמן בדיוק). להוסיף 6 מ של פתרון ניטרול (ראה טבלה של חומרים), מערבבים את הצינור בהתמדה עם הקשה, אז שיהיה על קרח למשך 10 דקות.
    10. Centrifuge את הצינור x 3,450 g ב- 4 הלעפה תרוטרפמט למשך 30 דקות באמצעות הרוטור סווינג-דלי. להעביר את פתרון ה-DNA המכיל צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של שרף טיהור DNA (ראה טבלה של חומרים). להשעות את השרף בעדינות.
    11. Centrifuge את הצינור ב x 625 גרם עבור 1 דקות באמצעות הרוטור סווינג-דלי. למחוק את הפתרון ולשמור השרף בתחתית.
    12. להוסיף 15 מ"ל של פתרון שטיפת העמודה (80 מ מ אשלגן אצטט, 8.5 מ"מ טריס-HCl [pH 7.5], 40 µM EDTA, ו- 55% אתנול) צינור חרוטי 50 mL וללחוץ בעדינות כדי להשעות את השרף. חזור על שלב 1.2.11.
      הערה: הפתרון שטיפת העמודה חייב להיות מוכן תוך שימוש diethyl pyrocarbonate (DEPC)-יחס מים או מים נטולי נוקלאז.
    13. הוסף 5 מ של פתרון שטיפת העמודה הצינור חרוט 50 מ ל, להשהות את השרף עם pipet מ. חלות השרף העמודה (ראה טבלה של חומרים) זה הינו ממוקם על יריעה ואקום. ואקום העמודה עד השרף יבש. להוסיף 6 מ של פתרון שטיפת העמודה העמודה ואת ואקום.
    14. ברגע השרף מתייבש באופן חזותי, ניתוק המאגר מן העמודה. המקטע התחתון של העמודה (שרף) להעביר צינור 1.5 מ. Centrifuge את העמודה במהירות מקסימלית למשך 2 דקות, באמצעות microcentrifuge להתייבש השרף לגמרי.
    15. המקטע התחתון של העמודה (שרף) להעביר צינור 1.5 מ. להוסיף 300 µL של מים נטולי נוקלאז לעמודה והמתן עד שלמה שרף ספוגה.
    16. Centrifuge את העמודה במהירות המרבית עבור 1 דקות לאסוף את פלסמיד המכיל DNA פתרון (200-250 µL).
    17. לפנק את הפתרון המכילה DNA עם פנול-סם הרדמה (1:1), לאחר מכן עם הכלורופורם כדלקמן.
      1. הוסף באותו אמצעי אחסון של פנול-כלורופורם (1:1) לתמיסה המכילה DNA (200-250 µL), לנער היטב, צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 2 דקות שימוש של microcentrifuge. לאסוף את השכבה העליונה (פתרון המכילה DNA) ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ. חזור על שלב 1 x.
      2. הוסף באותו אמצעי אחסון של כלורופורם לתמיסה המכילה DNA (200-250 µL), לנער היטב, צנטריפוגה במהירות המרבית עבור מינימלית 1 לאסוף את השכבה העליונה (פתרון המכילה DNA) ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ.
        הערה: אנדוטוקסין (ליפופוליסכריד) גורם באיתות בתאים מסוימים. כדי למנוע אפקט כזה unpredicted, שלב 1.2.17 מומלץ, אשר יכול להקטין זיהום אנדוטוקסין.
    18. לזרז את פלסמיד DNA בטכניקה אתנול משקעים כדלקמן.
      1. להוסיף 1/9 DNA נפח התערובת של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.5), 20 x 3 מ' סודיום אצטט נפח של 100% אתנול לתמיסה המכילה DNA. לדוגמה, להוסיף µL 27.8 של 3 מ' סודיום אצטט, 278 µL של 100% אתנול µL 250 של הפתרון דנ א (הכרך האחרון הוא 555.8 µL).
      2. שמור את הפתרון ב-80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות. צנטריפוגה במהירות המרבית עבור 20 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט. למחוק את הפתרון ולשמור בגדר. להוסיף 200 µL של 75% אתנול ולשטוף הפנימי של הצינור. צנטריפוגה כעשרים דקות ב 4 ° C, לבטל את הפתרון ולשמור בגדר. יבש בגדר הדנ א באמצעות רכז ואקום.
      3. להוסיף 100-250 µL טה מאגר (pH 8.0) ברכבת התחתית. להמיס בגדר DNA ולבדוק את ריכוז הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים באורך-גל של 260 ננומטר. שמור את ריכוז הדנ א סביב 0.5 מ"ג/מ"ל.

2. יונקים Assay שני-היברידית

  1. לשמור על התאים.
    1. תרבות קרצינומה hepatocellular האנושי HepG2 בתאים 750 מ ל, 175 ס' ' מ2 תרביות רקמה הבקבוק עם פנול אדום ללא מינימום חיוני התקשורת (מאמ) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS; לא פעיל חום), 2 מ מגלוטמין, ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין פתרון (אנטיביוטיקה) לשמירה על התאים.
    2. התרבות התאים 5% CO2-שהושלם, חממה 37 ° C עד התאים הם כ- 90% confluent.
      הערה: כדי לצמצם את פעילות אסטרוגניים רקע, נטולת פנול אדום בינוני אמור לשמש עבור כל הניסויים M2H. שלב זה צריך להתבצע בתוך ארון ביטחון ספסל נקי/ביולוגיה. התאים צריכים להישמר בעקבות את פרוטוקול התרבות הכללית בתרבית של תאים7.
  2. להכין את התאים תרביות תאים.
    הערה: השלבים הבאים פרוצדורלי צריכה להתבצע בתוך ארון הבטיחות ספסל נקי/ביולוגיה. התאים הם תרבותי/מודגרות ב- 5% CO2-חממה 37 ° C שהושלם, בשלב זה בכל פעם.
    1. Replate התאים confluent 90% הלוחות 24-טוב; לשטוף את התאים 1 x בתמיסת באגירה פוספט (PBS).
    2. להוסיף 7 מ של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון הבקבוק תרבות ומשרים את התאים למשך 1-2 דקות תוך שמירה את הבקבוקון תרבות ספסל נקיים בטמפרטורת החדר. להסיר חלק של הפתרון טריפסין-EDTA, להשאיר 1-2 מ"ל של הפתרון הבקבוקון תרבות. דגירה את הבקבוקון תרבות בחממה למשך 1-2 דקות.
    3. לסטור בתחתית הבקבוק לנתק את התאים ולבדוק את התאים במיקרוסקופ.
      הערה: אם התאים מחוברים עדיין הבקבוק, תקופת דגירה של עוד 1-2 דקות, לאחר מכן, חזור על שלב 2.2.3.
    4. להשעות את התאים MEM נטולת פנול אדום בתוספת 10% FBS הפשיטו פחם (חום-לא פעיל), 2 מ מגלוטמין ו 1% פתרון פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: יש להשתמש FBS הפשיטו פחם כדי להפחית את השפעת סרום-derived אסטרוגן אנדוגני.
    5. לספור את מספר התאים, זרע תאים לתוך צלחת 24-ובכן-צפיפות של 1.2 x 105 תאים/טוב. להקצות משלוש בארות עבור כל נקודת נתונים (triplicate).
    6. התרבות שהתאים בין לילה. ממשיכים לצעוד 2.4.1.
  3. להכין תערובת DNA תרביות תאים.
    הערה: פלסמיד הבאים DNAs הם transfected היטב אחד: 100 ננוגרם של pG5-לוק כתב פלסמיד, 50 ng של פלסמידים ביטוי חלבונים פיוז'ן GAL4DBD (pBIND), ו-50 ננוגרם של פלסמידים ביטוי חלבונים פיוז'ן VP16AD (ברית).
    1. כדי לנתח את הפעילות dimerization תלויות ליגנד-ERα LBD, להכין את השילובים הבאים (איור 3). שילוב (i): pG5-לוק + pBIND-hERαEF + ברית, ו pG5-לוק + pBIND-mERαEF + ברית. שילוב (ii): pG5-לוק + pBIND-hERαEF + ברית-hERαEF, ו pG5-לוק + pBIND-mERαEF + ברית-mERαEF. שילוב (iii): pG5-לוק + pBIND + ברית-hERαEF, ו pG5-לוק + pBIND + ברית-mERαEF.
      הערה: שילוב (i) מייצג את רמת ניסיוני הבזליים של האדם ERα LBD ועכבר ERα LBD, בהתאמה. אם התוצאה מראה רמה גבוהה להפליא עם ליגנד לבד, שיטה זו היא ישים לשימוש עם ליגנד הזה (למשל, diethylstilbestrol [DES]). שילוב (ii) מייצג את רמות dimerized LBD ERα האדם והעכבר dimerized ERα LBD, בהתאמה. שילוב (iii) מייצג פקדים שלילי; השתמש קבוצה זו רק כאשר הניסוי מבוצעת בפעם הראשונה להעריך את רמת רקע של המערכת.
    2. לפני ערבוב, לחשב את סה כ כמות הדנ א נדרש מבוסס על מספר בארות על תרביות תאים. לניסויים שנערכו triplicates ו נקודות נתונים חמש, לערבב את פלסמיד הבאים DNAs µL 1.5 שני צינורות שילובים (i) ו- (ii): pG5-לוק, 5 (נקודות נתונים) x 3 (וולס) x 100 ng = 1,500 ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (נקודות נתונים) x 3 (וולס) x 50 ng = 750 ng (7.5 µL); ברית (שילוב i) או ברית-mERαEF (עבור שילוב ii), 5 (נקודות נתונים) x 3 (וולס) x 50 ng = 750 ng (7.5 µL).
      הערה: הריכוז של כל פתרון דנ א פלסמיד הוא 0.1 µg/µL.
    3. לזרז את התערובת DNA בטכניקה משקעים אתנול. להוסיף 1/9 DNA נפח התערובת של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.5), 20 x 3 מ' סודיום אצטט נפח של 100% אתנול לתערובת הדנ א. לאחר מכן, מערבולת ברכבת התחתית.
      הערה: לדוגמה, להוסיף µL 3.4 של 3 מ' סודיום אצטט, 34 µL של 100% כוהל µL 30 תערובת דנ א פלסמיד שהודגם ב שלב 2.3.2. פעולה זו מסייעת לשמור על תנאי מחזוריים תרביות תאים, זה לא הכרחי לבצע שלב זה בבטיחות ביולוגית ארון.
    4. להשאיר את התערובת למשך הלילה ב-20 ° C. Centrifuge זה במהירות המרבית עבור 20 דקות ב 4 º C. למחוק את הפתרון (בגדר הוא בלתי נראה). להוסיף 120 µL של 75% אתנול הצינור; לאחר מכן, לשטוף הפנימי של הצינור. צנטריפוגה כעשרים דקות ב 4 º C. למחוק את הפתרון ויבש את התערובת הדנ א באמצעות רכז ואקום למשך 30 דקות.
  4. לבצע תרביות של תאים.
    הערה: השלבים הבאים יש לבצעו ספסל נקי או בטיחות ביולוגית ארון.
    1. למחרת בבוקר, לשטוף את התאים נזרע לתוך צלחת 24-טוב (מתוך שלב 2.2.6) 2 x 0.5 מ ל- PBS (טמפרטורת החדר).
    2. הוסף חמים (37 מעלות צלזיוס) MEM נטולת פנול אדום טרי בתוספת 10% פחם-הפשיטו FBS (חום-לא פעיל) ו- 2 מ מגלוטמין ללא אנטיביוטיקה כדי מכל קידוח (0.5 mL בינוני/טוב). להשאיר את התאים ב- 5% CO2-שהושלם, חממה 37 º C.
    3. להשעות את התערובת דנ א פלסמיד מיובשים (מתוך שלב 2.3.4) במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) (אין סרום, פנול אדום-חינם, ללא גלוטמין; µL 13/טוב). חישוב כמויות DMEM ממספר בארות על תרביות תאים.
      הערה: 15 בארות לשילוב (i) x 13 µL = 195 µL, ו- 15 וולס לשילוב (ii) x 13 µL = 195 µL.
    4. להשעות הכימית תרביות תאים (ראה טבלה של חומרים; µL 1.5/טוב) ב DMEM (12.5 µL טוב) עוד צינור 1.5 מ ל. לחשב את הכמויות של תרביות תאים ריאגנט DMEM ממספר בארות על תרביות תאים.
      הערה: 30 [15 בארות לשילוב] (א) ו- 15 וולס שילוב (ii) x 1.5 µL של תרביות תאים ריאגנט + 30 x 12.5 µL של DMEM = 420 µL.
    5. מוסיפים כמות שווה של המדיום ריאגנט תרביות תאים (מתוך שלב 2.4.4) כדי כל שפופרת (מתוך שלב 2.4.3). דגירה הצינורות למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: µL 200 תקנים ריאגנט בינוני + 195 µL של שילוב תערובת (i) DNA = 395 µL, ו µL 200 תקנים ריאגנט בינוני + 195 µL של שילוב תערובת (ii) DNA = 395 µL. חשוב להוסיף אמצעי שווה של תרביות תאים ריאגנט בינוני הצינורות של שילוב (i) ו- (ii). אין צורך לבזבז. את המדיום בשלב זה.
    6. להוסיף את התערובת משולב (מתוך שלב 2.4.5) כל טוב (25 µL טוב) של צלחת 24-טוב (מתוך שלב 2.4.2), דגירה את התאים עבור 6-אייץ ' 5% CO2-שהושלם, חממה 37 º C.
    7. הסר את המדיום תרביות תאים הצלחת 24-. טוב. להוסיף חמים (37 מעלות צלזיוס) MEM נטולת פנול אדום טרי בתוספת 10% פחם-הפשיטו FBS (חום-לא פעיל), 2 מ מגלוטמין, פתרון 1% פניצילין-סטרפטומיצין וליגנד (מושעה אתנול) (0.5 mL בינוני/טוב). התרבות התאים במשך 16-18 h 5% CO2-שהושלם, חממה 37 º C.
  5. לקצור את הדגימות.
    1. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל ל- PBS, לאחר מכן, הוסף µL 100 1 x פירוק פסיבי מאגר (ראה טבלה של חומרים).
    2. נמרצות לנער את הלוחיות. ובכן 24 עם מערבל מערבולת כדי לנתק את התאים.
    3. להקפיא את הצלחות (lysates תא) 1 x על-ידי חנקן נוזלי או להציל אותם ב-80 מעלות צלזיוס לפני ניתוח. מיד לפני וזמינותו, נמרצות לנער את הצלחות על מטרף עד שהם בטמפרטורת החדר.
      הערה: תהליך זה מונע ומתפשטים המופיעים חריגה מערכי פעילות לוציפראז.
  6. ביצוע וזמינותו של כפול-לוציפראז.
    1. להכין את ריאגנטים עבור מערכת כפולה-לוציפראז assay (ראה טבלה של חומרים).
      1. להכנת מאגר המצע (LAS) לוציפראז assay, להוסיף כל מאגר assay לוציפראז לתוך המצע assay לוציפראז אשר הינו בבקבוק זכוכית חום. להציל את המאגר לאס ב-20 ° C.
        הערה: המאגר לאס צריך להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      2. להכנת מאגר Renilla לוציפראז המצע (RLS), מערבבים Renilla לוציפראז המצע ומאגר לוציפראז Renilla על יחס של 1:50. להפוך RLS טריים מאגר עבור כל assay ולהשתמש צינור שחור או צינור המוצלת על ידי נייר כסף. לחשב את כמות מאגר RLS גורם חוצץ טריים.
        הערה: המאגר RLS צריך להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    2. הגדר את ריאגנטים בקורא ה-microplate.
      1. לשטוף הזריקה קווים 2 x עם אתנול 70%; לאחר מכן, לשטוף 2 שורות x עם מים.
        הערה: זה חשוב למנוע מטריד את התוצאות וזמינותו.
      2. סט לאס מאגר ל P-מזרק קו (הזריקה הראשונה) ולהגדיר המאגר RLS לקו M-מזרק (שני הזרקה). אל תערבב בין מאגרים אלה. מאגר RLS מעכב פעילות לוציפראז.
    3. החל µL 10 דוגמאות שנקטפו (מתוך שלב הנגן 2.5.3) לצלחת פלסטיק לבן 96-ובכן.
    4. ההגדרות הבאות חלות לגבי הקורא microplate. לשימוש P-מזרק, נפח של 50 µL, עיכוב של 2 s, ומהירות של 50 µL/s. לשימוש M-מזרק, נפח של 50 µL, עיכוב של 2 s, ומהירות של µL 50/ס לקבוע מועד שילוב של ערכת ס' 15 הטמפרטורה 25 º C.
    5. הפעל את הקורא microplate.
    6. להקליט את הערכים של פעילות לוציפראז (IPValue) ואת הערכים של הפעילות לוציפראז Renilla (IMValue) באמצעות תוכנית רכישת נתונים (ראה טבלה של חומרים).
    7. לשטוף את הקווים הזרקה לאחר איסוף הנתונים (ראה שלב 2.6.2.1).
  7. לבצע ניתוח נתונים.
    1. השתמש בערכים מנורמל (IPValue/IMValue) לניתוח נתונים.
    2. הגדר הערך המנורמל של שילוב (i) [pG5-לוק + pBIND-ERαEF + ברית] עם רכב (ליגנד nM 0) 1 לחישוב רמת הבסיס ולא את homodimerized ERα LBD ברמה. הרמות מיוצגים כפעילות"יחסית".

תוצאות

איור 3 מציגה את הערכה של תגובות אפשריות שילוב (i), שילוב (ii) פלסמיד transfected תאים. תוצאות הניסוי מוצגות באיור4. הפעילות של שילוב (i) (pG5-לוק + pBIND-mERαEF + ברית) מציג גירוי ב-10 ננומטר E2 (איור 4א'), כי LBD ERα מכיל קבוצת המחשבים פונקצי?...

Discussion

במסמך זה, אנחנו תיאר את פרוטוקול וזמינותו M2H, התמקדות התנאים assay לגילוי הפעילות homodimerization של ERα LBD כדוגמה. באופן כללי, וזמינותו M2H הוא לא פופולרי להערכה של תלויות ליגנד-ERα LBD dimerization פעילות. זאת בשל LBD ERα הפו פונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק; הפעילות אשר מפריע, במקרים מסוימים, תוצאות וזמינותו M2H. עם ...

Disclosures

המחברים יש ריהצהל.

Acknowledgements

המחברים מודים ד"ר Sueyoshi ו וואנג-נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) שלהם לקריאה ביקורתית של כתב היד, וכן טאנר ג'פרסון על ביצוע הליכים על הוידאו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1ZIAES070065 (ל K.S.K.) מן החלוקה של מגזר בחקר NIEHS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pG5-LucPromegaE249AComponent of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBINDPromegaE245AComponent of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACTPromegaE246AComponent of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404010
Centrifuge RotorSORVALL75006445
Swing BucketsSORVALL75006441
Cell Resuspension Solution (CRA)PromegaA7112
Cell Lysis Solution (CLA)PromegaA7122
Neutralization Solution (NSA)PromegaA7131
Column Wash Solution (CWB)PromegaA8102
Wizard Midipreps DNA Purification ResinPromegaA7701
Wizard MidicolumnsPromegaA7651
MEM, no glutamine, no phenol redGibco51200038
L-glutamine (200 mM)GibcoA2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x)Gibco15400054
Penicillin-Streptomycin (100x)Sigma-AldrichP0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS)Gemini-Bio100-106Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serumGemini-Bio100-119Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol redGibco31053028for transfection
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027
Passive Lysis 5X BufferPromegaE1941
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1980
SpectraMax L microplate readerMolecular Devices
SoftMax Pro SoftwareMolecular Devices

References

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

142assaydimerization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved