Ligand bağlayıcı etki Dimerization etkinliği östrojen reseptör Alfa memeli iki-hibrid tahlil kullanarak algılama

Özet

Biz memeli iki-hibrid tahlil kullanarak 4-hidroksi-tamoxifen-bağımlı östrojen reseptör Alfa ligand bağlayıcı etki alanı dimerization etkinliğini analiz etmek için bir yöntem mevcut.

Özet

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. ERα protein dizi türleri arasında son derece korunmuş. İnsan işlevinin ve fare ERαs aynı olduğunu düşündüm. Fare ve insan ERα ligand bağlayıcı etki (yakın) dimerization etkinliği memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak fark 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) etkisi göstermektedir. M2H tahlil kullanan iki protein ifade plazmid (GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı [DBD] füzyon yakın ve VP16 transactivation etki alanı [VP16AD] füzyon yakın) transfection yakın homodimerization aktivite memeli hücrelerinde verimliliğini kanıtlamanın ve bir GAL4 duyarlı öğesi (GAL4RE) luciferase muhabir plazmid erimiş. GAL4DBD fusion yakın ve VP16AD füzyon yakın bir dimer hücrelerde yaptığınızda, bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve sonra bir luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağımlı transkripsiyonu faaliyetleri ile hiçbir devreye giriyor. 4OHT-aracılı luciferase harekete geçirmek fare ERα yakın füzyon protein ifade plazmid insan hücrelerinde ERα yakın füzyon protein ifade transfected plazmid ile transfected HepG2 hücreleri yüksektir. Bu sonuç 4OHT bağımlı fare ERα yakın homodimerization faaliyet etkinliği insan ERα yakın yüksek olduğunu göstermektedir. Genel olarak, M2H tahlil kullanımı agonistik ligandlar yakın etkinlik bazal düzeyini arttırmak ve bu yakın dimerization aktivite tespiti engellemektedir Çünkü nükleer reseptör yakın dimerization etkinlik, değerlendirme için ideal değildir. Bulduğumuz o 4OHT ERα yakın bazal etkinlik geliştirmez. Bu belirlemek ve M2H tahlil başarıyla kullanmak için 4OHT bağlı yakın dimerization aktivite tespit edememek için önemli bir faktördür. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist etkinliği seçici östrojen reseptör modülatörleri (Örneğin, 4OHT) ile çalışmaya çeşitli memeli hücre tiplerinde uygulanabilir.

Giriş

Östrojen reseptör Alfa (ERα) östrojenik ligand-bağımlı transkripsiyonu düzenleyicisidir. Amino asit sequenceof ERα türler arasında son derece korunmuş. İnsan arasında daha yüksek Homoloji nedeniyle ve ERα fare, bu reseptörleri işlevini, aynı düşünce ve östrojenik maddeler (Örneğin, Tamoksifen) bu türlerin farklı etkinlik türün farklılıkları nedeniyle oluşur kimyasal metabolizmaları ERα yapısal farklılıklar tarafından değil. ERα son derece A F etki alanlarına belirlenmiş nükleer reseptör (NR) üst aile arasında yaygın etki alanı yapılarına korunmuş. E veya ligand bağlayıcı etki alanı (yakın)-ligand taşıması cep ve transkripsiyon aktivasyon fonksiyonu 2, içerir AF-2 adlı. F etki alanı hemen E etki alanına bitişik yerelleştirilmiştir ve NRs arasında en değişken etki alanıdır. Hatta insan arasında ve ERα fare, Homoloji F etki alanının önemli ölçüde diğer etki alanları¹daha düşüktür. ERα ligand bağlı yakın (ERα klasik eylem) ligand-bağımlı Gen transkripsiyonu düzenleyen için doğrudan belirli östrojen duyarlı DNA öğeyi bağlamak için ERα protein homodimerization artırır. Helix 12 (AF-2 çekirdek etki alanı) ile estradiol (E2) - ya da 4-hidroksi-tamoxifen (4OHT) - Diferansiyel konumlandırma bağlı yakın dimer^2,3Crystallographic çalışmalar ortaya koymuştur. ERα F etki alanı (45 amino asitler) helix 12 doğrudan bağlayın. Ancak, ERα yakın dimerization bu eklentinin helix 12 üzerinden 45 amino asitlerin (F etki alanı) etkisi ile ilgili hiçbir bilgi yoktur. Bu çalışmada, bir memeli iki-hibrid (M2H) tahlil kullanarak species-specific 4OHT bağlı ERα yakın homodimerization F etki alanına katkısını göstermek.

M2H tahlil üç farklı plazmid DNA'lar tanıtımı memeli hücrelerinde protein-protein etkileşimlerini göstermek için bir yöntemdir: GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı (DBD) füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın hızlı, iki protein ifade plazmid ve bir GAL4RE erimiş luciferase ifade muhabir plazmid. Ne zaman GAL4DBD füzyon ERα yakın ve VP16AD füzyon ERα yakın etkileşim (yapmak bir dimer) hücrelerde bu protein kompleksi için GAL4RE bağlar ve, sonra luciferase gen ekspresyonu VP16AD bağlı transactivation işlevi aracılığıyla etkinleştirir. YAKIN homodimerization düzeyini luciferase aktivite değerlendirilebilir.

Maya iki-hibrid (Y2H) tahlil Maya ana bilgisayar ortamı olarak kullanır aynı ilkeye göre alternatif bir yöntemdir. Y2H sistemi kullanarak önceki raporları F-etki alanı-kesme insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım, F etki alanı E2-aracılı transkripsiyon⁴engeller sonuç artar gösterdi. Bu sonuç hangi insan ERα memeli hücreleri^5,6F-etki alanı-kesme zayıflatılmış transkripsiyon faaliyet gösterdiği diğer Özet Tablo raporları ile tutarsız. Son zamanlarda, bizim çalışma M2H sistemiyle, insan ERα yakın E2 bağımlı coactivator işe alım etkinliği tarafından F etki alanı kesme memeli hücrelerinde azalma ve transkripsiyon etkinlik¹ile tutarlıdır gösterdi. Bu gözlemler protein-protein etkileşim fizyolojik rolü bir hücre türüne özgü şekilde ve içeriği farklıdır öneririm. M2H tahlil protein-protein etkileşim Etkinlik transkripsiyon etkinliğini belirlemek için kullanılan aynı hücresel bağlamında kanıtlamanın. Bu Y2H ya da diğer vitro protein-protein etkileşim analizleri ile karşılaştırıldığında M2H testin bir avantaj sağlar.

Seçici östrojen reseptör modülatörleri (SERMs) (Örneğin, 4OHT) ERα-aracılı transkripsiyonu düzenleyen kısmi agonist etkinliğinin moleküler mekanizmaları ile ilgili sorular kalır. M2H deneyleri ERα yakın tabanlı kısmi agonist aktivitesinde SERMs çeşitli memeli hücre türleri mekanizması çalışmaya uygulanabilir.

Protokol

1. hazırlanması plazmid memeli iki-hibrid tahlil için

1. Aşağıdaki plazmid kullanın: pG5-Luc, pBIND-ERαEF ve Paktı-ERαEF.
   Not: Plazmid yazarlardan istek üzerine mevcuttur ve filtre kağıdı gönderilir. pG5-Luc duyarlı öğeleri luciferase ifade birimi (Şekil 1A) ile erimiş GAL4 beş tekrarlar içeren muhabir plazmid var. pBIND-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın GAL4DBD erimiş proteinler için var. pBIND-ERαEF bir Renilla luciferase ifade transfection verim (Şekil 1B) normalleştirme için içerir. Paktı-ERαEF protein ifade plazmid ERα yakın VP16AD erimiş proteinler (Şekil 1C) için olduğunu. Plazmid ifade protein yapısından diyagramı Şekil 2' de gösterilmiştir.
2. Plazmid DNA'lar hazırlayın.
   1. Temiz makas kullanarak kağıt plazmid yüklü alanından dışarı ve 1,5 mL tüp içine koydu. Eldiven giymek ve temiz cımbız plazmid yüklü gazeteyi almak için kullanın. 100 µL Tris-EDTA (TE) arabelleği (pH 8.0) ve girdap de ekleyin.
   2. 1 µL eklemek plazmid DNA çözüm adım yetkili Escherichia coli 1.2.1 hücreleri ( Tablo malzemelerigörmek) ve tüp buz 15 dakika tutun.
   3. Isı şok plazmid eklendi yetkili hücreleri; tüpler için 30 42 ° C su banyosunda kuluçkaya s ve sonra buz 2 min için saklayın.
   4. Tüpler ve kültür için 30 dk 37 ° C'de sallayarak ile 250 µL catabolite baskı (SOC) Orta (Oda sıcaklığında) ile süper en iyi suyu ekleyin.
   5. Kültürlü E. coli prewarmed Luria suyu (LB) plaka üzerine 100 µL gecede 100 µg/mL ampisilin (10 cm çapında çanak) ve 37 ° C'de kültürü ile plaka.
   6. Bir koloni plaka almak ve müthiş suyu (TB) 100 µg/mL ampisilin ile 2 mL içeren bir 14 mL tüp içine ekleyin. Orta hafif bulutlu 's kadar 37 ° C'de sallayarak ile kültür.
   7. Kültürlü orta 1 mL 1.2.6 adımından TB 50 mL 100 µg/mL ampisilin ile içeren bir autoclaved 250 mL Cam şişe ekleyin. 20-24 h 37 ° C'de sallayarak ile kültür.
   8. Kültürlü E. coli 50 mL konik tüp ve 30 dk salıncak-kova rotor kullanarak 3.450 x g oda sıcaklığında, santrifüj aktarın. Orta atın. E. coli Pelet-80 ° C'de kaydetmek
   9. Hücre resuspension çözümü 3 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) E. coli için cips ve tamamen askıya alma. Hücre lizis çözümü 3 mL ekleyin (bakınız Tablo malzemeler), karışımı yavaşça bu ters çevirme tarafından tüp 10 x ve 5 min için buz tutmak (zamanında almak belgili tanımlık zaman). Nötralizasyon çözüm 6 mL ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) tüp giderek dokunarak ile karıştırın ve daha sonra 10 min için buz üzerinde tutmak.
   10. 30 dk salıncak-kova rotor kullanarak için 4 ˚C'de 3.450 x g , tüp santrifüj kapasitesi. DNA içeren çözüm yeni bir 50 mL konik tüp aktarmak ve DNA arıtma reçine 10 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Reçine yavaşça askıya alma.
   11. 625 x g 1dk salıncak-kova rotor kullanarak için de tüp santrifüj kapasitesi. Çözüm atın ve reçine altındaki koruyun.
   12. 15 mL sütun yıkama çözeltisi ekleyin (80 mM potasyum asetat, 8.5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 µM EDTA ve % 55 etanol) 50 mL konik tüp ve yavaşça reçine askıya almak için salla. 1.2.11 arasındaki adımları yineleyin.
       Not: Sütun yıkama çözüm dietil pyrocarbonate (DEPC) kullanılarak hazırlanması gerekir-tedavi su veya su nükleaz ücretsiz.
   13. 5 mL sütun yıkama çözeltisi 50 mL konik tüp ekleyin ve reçine ile 5 mL damlalıklı askıya alma. Reçine sütununa uygulamak vakum manifold üzerinde ayarlanmış ( Tablo malzemelerigörmek) bu. Reçine kuru kadar sütun vakum. 6 mL sütun yıkama çözeltisi sütun ve vakum için ekleyin.
   14. Görsel olarak reçine kurur sonra havzanın sütundan ayırmak. Sütun (reçine) alt bölümünde 1,5 mL tüp aktarın. Sütun 2 min bir microcentrifuge reçine kurumasını kullanmak için maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
   15. Sütun (reçine) alt bölümünde yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Nükleaz ücretsiz su 300 µL sütununu ekleyin ve bütün reçine sırılsıklam olana kadar bekleyin.
   16. Plazmid DNA içeren çözüm (200-250 µL) toplamak 1 dk için maksimum hızda sütun santrifüj kapasitesi.
   17. Fenol-kloroform (1:1), sonra kloroform ile DNA içeren çözümle aşağıdaki gibi davran.
       1. Iyice çalkalayınız ve 2 min bir microcentrifuge kullanarak için maksimum hızda santrifüj kapasitesi fenol kloroform (1:1) aynı hacmi DNA içeren çözüm (200-250 µL) ekleyin. Üst katmanı (DNA içeren çözüm) toplamak ve yeni bir 1,5 mL tüp ekleyin. 1 x bu adımı yineleyin.
       2. Kloroform aynı hacmi DNA içeren (200-250 µL) ekleyin, sallamak iyi ve 1 dk. maksimum hızda santrifüj üst katmanı (DNA içeren çözüm) toplamak ve bir 1,5 mL tüp ekleyin.
          Not: Bazı hücreler hücresel sinyal endotoksin (lipopolysaccharide) neden olmaktadır. Böyle gizemli bir etkisi önlemek için adım 1.2.17, hangi-ebilmek azaltmak endotoksin kirlenme önerilir.
   18. Plazmid DNA gibi etanol yağış tekniği kullanarak çökelti.
       1. 1/9 3 M sodyum asetat (pH 5.5) DNA karışımı hacminin ekleyin ve 20 x 3M sodyum asetat hacminin % 100 etanol DNA içeren çözüm için. Örneğin, 3 M sodyum asetat 27,8 µL ve 278 µL % 100 etanol (son 555.8 µL birimdir) DNA çözüm 250 µL için ekleyin.
       2. Çözüm için 20 dk-80 ° C'de en az tutun. 20 dk 4 ˚C az için maksimum hızda santrifüj kapasitesi. Çözüm atın ve Pelet koruyun. 200 µL % 75 etanol ekleyin ve tüp içine durulayın. 4 ° C'de 20 dk santrifüj kapasitesi, çözüm atın ve Pelet koruyun. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak DNA Pelet kuru.
       3. 100-250 µL TE arabelleği (pH 8.0) tüp ekleyin. DNA Pelet dağıtılması ve dalga boyu 260 bir spektrofotometre kullanarak DNA toplama kontrol nm. DNA konsantrasyonu 0.5 mg/mL etrafında tutmak.

2. memeli iki-hibrid tahlil

1. Hücreleri korumak.
   1. İnsan hepatosellüler karsinom HepG2 hücrelerde 750 mL, 175 cm² doku kültürü şişesi ile fenol red ücretsiz minimum temel medya (MEM) % 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş Kültür (FBS; ısı inaktive), 2 mM L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin çözüm (antibiyotik) hücreleri korumak için.
   2. %5 CO₂hücrelerinde kültür-hücreleri yaklaşık % 90 birleşmesi olana desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
      Not: östrojenik arka plan etkinliğini azaltmak için orta fenol red-ücretsiz tüm M2H deneyler için kullanılmalıdır. Bu adım bir temiz tezgah/biyolojik güvenlik kabin içinde gerçekleştirilmelidir. Hücreleri genel memeli hücre kültür protokol⁷takip sağlanmalıdır.
2. Hücreleri transfection için hazır olun.
   Not: Aşağıdaki yordam adımları kabine temiz tezgah/biyolojik güvenlik içinde gerçekleştirilmelidir. Hücreler kültürlü/inkübe bir % 5 CO₂'-Bu adımda her zaman desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
   1. 24-şey plakaları % 90 konfluent hücrelere replate; hücreleri 1 durulama x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile.
   2. Kültür şişeye 7 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 1-2 min için hücreleri kültür balonun içinde temiz bir Bank oda sıcaklığında tutarken ıslatın. Tripsin-EDTA çözümünün bir parçası kaldırmak ve 1-2 mL çözüm kültür şişeye bırakın. 1-2 min için kuluçka kültür şişeye kuluçkaya.
   3. Hücreleri ayırmak ve mikroskop altında hücreleri denetleyin şişeye alt şaplak at.
      Not: hücreleri için şişesi hala iliştirilmişse, başka bir 1-2 min için kuluçkaya ve, sonra 2.2.3 arasındaki adımları yineleyin.
   4. % 10 ile desteklenmiş fenol red ücretsiz MEM hücrelerde askıya alma (ısı-inaktive) kömür elimden FBS, 2 mM L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin çözüm.
      Not: Kömür elimden FBS serum kaynaklı endojen östrojen etkisini azaltmak için kullanılmalıdır.
   5. Hücre sayısı ve yoğunluğu 1.2 x 10⁵ hücreleri/iyi bir 24-şey plaka hücrelerde tohum. Üç kuyular (onaylatılacak) her veri noktası için atayın.
   6. Hücreleri gecede kültür. 2.4.1 adıma devam edin.
3. Bir DNA karışımı transfection için hazır olun.
   Not: Aşağıdaki plazmid DNA'lar transfected bir kuyuda: 100 pG5-Luc muhabir plazmid, 50 ng ng GAL4DBD füzyon protein (pBIND) için ifade plazmid ve 50 ifade plazmid VP16AD füzyon protein (anlaşma) için ng.
   1. Ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinliğini çözümlemeye, aşağıdaki kombinasyonları (Şekil 3) hazırlayın. Kombinasyon (ı): pG5-Luc pBIND-hERαEF + Paktı ve pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı. Kombinasyon (II): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + Paktı-hERαEF ve pG5-Luc + Paktı-mERαEF pBIND-mERαEF. Kombinasyon (III): pG5-Luc + pBIND + Paktı-hERαEF ve pG5-Luc + pBIND + Paktı-mERαEF.
      Not: Kombinasyon (i) insan ERα yakın ve fare ERα yakın, bazal deneysel düzeyde sırasıyla temsil eder. Sonuç ligand ile son derece yüksek bir düzeyde yalnız gösteriyorsa, bu olanaksız bu ligand (Örneğin, dietilstilbestrol [DES]) ile kullanmak için bir yöntemdir. Kombinasyon (II) dimerized insan ERα yakın ve dimerized fare ERα yakın, düzeyleri sırasıyla temsil eder. Kombinasyon (III) negatif denetimlerinizi temsil eden; sadece deneme sistemi arka plan düzeyini değerlendirmek ilk kez gerçekleştirildiğinde bu seti kullanın.
   2. Karıştırma önce toplam hesaplamak transfection için kuyu sayısı dayalı gerekli DNA miktarı. Triplicates ve beş veri noktalarında yapılan deneylerde, iki 1,5 µL tüpler kombinasyonları (i) ve (II) için aşağıdaki plazmid DNA'lar karıştırmak: pG5-Luc, 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 100 ng x 1500 = ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 50 ng x 750 = ng (7,5 µL); Paktı (kombinasyon i) veya Paktı-mERαEF (için kombinasyon II), 5 (veri noktaları) 3 (kuyu) x 50 ng x 750 = ng (7,5 µL).
      Not: Her plazmid DNA çözüm 0.1 µg/µL bölgedir.
   3. Etanol yağış tekniği kullanarak DNA karışımı çökelti. 1/9 3 M sodyum asetat (pH 5.5) DNA karışımı hacminin ekleyin ve 20 x 3M sodyum asetat hacminin % 100 etanol DNA karışımı için. O zaman, girdap tüp.
      Not: Örneğin, 3 M sodyum asetat 3.4 µL ve 34 µL % 100 etanol 30 µL adım 2.3.2 örneği plazmid DNA karışımı ekleyin. Bu adım bir değişmez transfection durumu tutmaya yardımcı olur ve biyolojik emanet dolabı bu adımı gerçekleştirmek gerekli değildir.
   4. Karışımı bir gecede-20 ° C'de tutmak 4 ° C'de 20 dk için maksimum hızda santrifüj kapasitesi (Pelet görünmez) çözüm atın. 120 µL % 75 etanol tüp ekleyin; o zaman, tüp içine durulayın. 4 ° C'de 20 dk santrifüj Çözüm atmak ve vakum yoğunlaştırıcı için 30 dk kullanarak DNA karışımı kurumasını bekleyin.
4. Transfection gerçekleştirin.
   Not: Aşağıdaki adımları temiz bir Bank ya da biyolojik Emanet kabine içinde gerçekleştirilmelidir.
   1. Ertesi sabah, bir 24-şey plaka (Kimden adım 2.2.6) numaralı seribaşı hücreleri durulama 2 x 0.5 mL PBS (Oda sıcaklığında) ile.
   2. Taze fenol red ücretsiz MEM % 10 ile desteklenmiş sıcak (37 ° C) kömür-(ısı-inaktive) FBS ve her şey (0.5 mL orta/de) antibiyotiklere olmadan 2 mM L-glutamin elimden ekleyin. Hücreleri bir % 5 CO₂' deki tutmak-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
   3. Kurutulmuş plazmid DNA karışımı (Kimden adım 2.3.4) Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) (hiçbir serum, fenol red içermeyen, glutamin; 13 µL/iyi) askıya alma. DMEM kuyu transfection için dizi tutarlarını hesaplamak.
      Not: 15 wells (i) x 13 µL birleşimi için 195 µL ve (ii) x 13 µL birleşimi için 15 wells = 195 µL =.
   4. Transfection reaktif askıya alma ( Tablo reçetesi; görmek 1,5 µL/iyi) DMEM içinde (12.5 µL/de) başka bir 1,5 mL tüp içinde. Transfection reaktif ve kuyular için transfection dizi DMEM miktarlarını hesaplamak.
      Not: 30 [kombinasyon için 15 wells] (i) ve 15 kuyular için kombinasyon (II) transfection reaktif 1,5 µL + 30 x 12.5 µL DMEM, x 420 µL =.
   5. Her tüp (Kimden adım 2.4.3) transfection reaktif ortamına (Kimden adım 2.4.4) eşit miktarda ekleyin. Tüpler, oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya.
      Not: 200 µL transfection reaktif orta + 195 µL birleşimi (i) DNA karışımı 395 µL ve 200 µL transfection reaktif orta + 195 µL birleşimi (II) DNA karışımı = 395 µL =. Bu kombinasyon (i) ve (ii) tüpler transfection reaktif orta eşit bir birim eklemek önemlidir. Bu adımda orta kullanmak gerekli değildir.
   6. Her kuyudan (25 µL/de) 24-şey plaka (adım 2.4.2) kombine karışıma (Kimden adım 2.4.5) ekleyin ve %5 CO₂6 h için hücreleri kuluçkaya-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
   7. Transfection orta 24-şey plaka kaldırın. Taze fenol red ücretsiz MEM takıma % 10 ile sıcak (37 ° C) kömür-mahrum (ısı-inaktive) FBS, 2 mM L-glutamin, % 1 penisilin-streptomisin çözüm ve ligand (etanol askıya) ekleyin (0.5 mL orta/de). 16-18 h % 5 CO₂için hücreleri kültür-desteklenmiştir, 37 ° C kuluçka makinesi.
5. Örnekleri hasat.
   1. PBS 1 mL hücrelerle durulama ve daha sonra 1 pasif lizis arabellek x 100 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
   2. Şiddetle 24-şey plakaları hücreleri ayırmak için bir girdap mikser ile çalkalanır.
   3. Tabak (hücre lysates) dondurma analiz önce-80 ° C'de 1 x sıvı azot veya kaydedin. Oda sıcaklığında onlar kadar tahlil hemen önce tabakları bir shaker şiddetle çalkalanır.
      Not: Bu işlem düzensiz luciferase aktivitesinin anormal değerler görünmesini engeller.
6. Bir çift-luciferase tahlil gerçekleştirin.
   1. Reaktifler çift-luciferase tahlil sistemi için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).
      1. Luciferase tahlil substrat (LAS) tampon yapmak için tüm luciferase tahlil arabellek cam kahverengi şişede olan luciferase tahlil substrat içine ekleyin. -20 ° C'de LAS arabelleğe kaydetme
         Not: Kullanmadan önce oda sıcaklığına LAS arabellek ısınma.
      2. Renilla luciferase substrat (RLS) tampon yapmak için Renilla luciferase substrat ve 1:50 oranında Renilla luciferase arabellek karıştırın. Taze HBS her tahlil için tampon ve siyah bir tüp veya folyo tarafından gölgeli bir tüp kullanmak olun. Taze bir arabellek yapma HBS arabellek miktarını hesaplamak.
         Not: HBS arabellek için oda sıcaklığında kullanmadan önce ısınma.
   2. Reaktifleri Mikroplaka Okuyucu ayarlayın.
      1. Yıkama enjeksiyon % 70 etanol ile 2 x hatlarını; sonra yıkama hatları 2 x su ile.
         Not: Bu tahlil sonuçları rahatsız edici önlemek önemlidir.
      2. LAS P-enjektör için arabellek kümesi satır (ilk enjeksiyon) ve HBS arabellek M-Enjektör hattı (ikinci enjeksiyon). Bu arabellekleri birlikte kullanmayın. HBS arabellek luciferase etkinliği engeller.
   3. 96-şey beyaz plastik levha (Kimden adım 2.5.3) hasat örnekleri 10 µL uygulanır.
   4. Aşağıdaki ayarları Mikroplaka Okuyucu için geçerlidir. P-enjektör için 50 µL, bir gecikme 2 hacmi kullanın s ve 50 µL/s hızında. M-enjektör için 50 µL, bir gecikme 2 hacmi kullanın s ve 50 µL/s hızında 15 s. kümesinin bir entegrasyon zaman sıcaklık 25 ° C'ye ayarla.
   5. Mikroplaka Okuyucu çalıştırın.
   6. Luciferase aktivitesi (IPValue) değerleri ve veri satın alma programı kullanarak Renilla luciferase etkinliğini (IMValue) değerlerini kaydedin (bkz. Tablo malzeme).
   7. Veri toplama sonra enjeksiyon hatları yıkama (bkz. Adım 2.6.2.1).
7. Veri çözümlemesi gerçekleştirin.
   1. Normalleştirilmiş değerleri (IPValue/IMValue) veri analizi için kullanın.
   2. Araç (0 nM ligand) ile birlikte (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + Paktı] normalleştirilmiş değerini düzeyi bazal düzeyi ve ERα yakın homodimerized hesaplanması için 1 olarak ayarlayın. Düzeyleri "Göreceli etkinlik" olarak gösterilir.

Sonuçlar

Şekil 3 olası yanıtları düzeni kombinasyonu (i) ve kombinasyon (II) plazmid transfected hücreleri görüntüler. Deneysel sonuçları Şekil 4' te gösterilmiştir. Kombinasyon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Paktı) faaliyet stimülasyon 10 tarafından gösteren nM E2 (Şekil 4A), ERα yakın ligand-bağımlı transactivation işlev etki alanı, AF-2 içerdiğinden. ERα yakın...

Tartışmalar

Burada, ERα yakın homodimerization aktivite örnek olarak algılamak için tahlil koşullar odaklanan M2H tahlil için protokol açıkladığımız. Genel olarak, M2H tahlil ligand-bağımlı ERα yakın dimerization etkinlik değerlendirmesi için popüler değil. Bu ERα bir transkripsiyon etkinleştirme işlev sahip yakın nedeniyle. Hangi etkinlik rahatsız ediyor, bazı durumlarda, M2H tahlil sonuçları. Biz burada göstermek gibi ancak, M2H tahlil yakın (Örneğin, 4OHT, SERMs) AF-2 transactivation iş...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
pG5-Luc	Promega	E249A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND	Promega	E245A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT	Promega	E246A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010
Centrifuge Rotor	SORVALL	75006445
Swing Buckets	SORVALL	75006441
Cell Resuspension Solution (CRA)	Promega	A7112
Cell Lysis Solution (CLA)	Promega	A7122
Neutralization Solution (NSA)	Promega	A7131
Column Wash Solution (CWB)	Promega	A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin	Promega	A7701
Wizard Midicolumns	Promega	A7651
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054
Penicillin-Streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS)	Gemini-Bio	100-106	Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-119	Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red	Gibco	31053028	for transfection
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027
Passive Lysis 5X Buffer	Promega	E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1980
SpectraMax L microplate reader	Molecular Devices
SoftMax Pro Software	Molecular Devices