JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод для анализа 4-гидрокси тамоксифен зависимой эстроген рецептор альфа-лиганд привязки димеризации доменами с помощью млекопитающих assay 2 гибрида.

Аннотация

Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Среди видов высоко сохраняется последовательность ERα белка. Считалось, что функция человека и мыши ERαs идентичны. Мы продемонстрировать эффект дифференциальной 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) на мышь и человека ERα лиганд привязки (ОДД) димеризации доменами с помощью млекопитающих assay (м2ч) 2 гибрида. М2ч assay может продемонстрировать эффективность деятельности LBD homodimerization в клетках млекопитающих, используя трансфекции двух плазмид выражение протеина (GAL4 ДНК-связывающих домена [DBD] Сплавливание LBD и VP16 transactivation домена [VP16AD] Сплавливание LBD) и GAL4-отзывчивым элемент (GAL4RE) снаряжен Люцифераза репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion LBD и VP16AD фьюжн LBD димер в клетках, этот комплекс белков связывается с GAL4RE и, затем, активирует экспрессии генов Люцифераза через деятельность зависимых транскрипции VP16AD. Активация 4OHT-опосредованной Люцифераза выше в HepG2 клетки, которые были transfected с мыши ERα LBD синтеза белка выражение плазмид чем ERα LBD синтеза белка выражение плазмида transfected клеток человека. Этот результат свидетельствует о том, что эффективность 4OHT-зависимых мыши ERα LBD homodimerization активность выше, чем человеческий ERα LBD. В общем использование м2ч assay не подходит для оценки деятельности димеризации LBD ядерных рецепторов, потому что агонистических лигандов повысить базальный уровень активности LBD и что затрудняет обнаружение LBD димеризации активности. Мы обнаружили, что 4OHT не повысить ERα LBD базальную активность. Что является ключевым фактором для того определить и обнаружить 4OHT-зависимых LBD димеризации деятельность для успешно используя assay м2ч. На основе ERα LBD м2ч анализов могут применяться для изучения деятельности частичный агонист селективного эстроген модуляторов рецепторов (например, 4OHT) в различных типах клеток млекопитающих.

Введение

Эстрогеновых рецепторов альфа (ERα) является регулятором эстрогенных лиганд зависимых транскрипции. Амино кислоты sequenceof ERα высоко сохраняется среди видов. Из-за более высоких гомологии между человека и мыши ERα, функция этих рецепторов мыслится как идентичные и дифференциального активность эстрогенных веществ (например, тамоксифен) в этих видов вызвана Межвидовые различия в химические метаболизмом, а не структурных различий ERα. ERα хорошо сохранились доменных структур, которые являются общими среди ядерных рецепторов (NR) надсемейства, поручено A F доменов. E домена или лиганд связывающий домен (ОДД) включает в себя лиганд привязки карман и transcriptional активации функции 2, названный AF-2. F домен локализован непосредственно примыкает к области E и является наиболее переменной домен среди НСП. Даже между человека и мыши ERα, гомологии F домена значительно ниже, чем у других доменов1. Лиганд прыгните LBD ERα повышает homodimerization белка ERα, чтобы связать определенный элемент эстроген отзывчивым ДНК непосредственно для регулирования транскрипции гена лиганд зависимые (классическое действие ERα). Кристаллографическая исследования показали дифференциального позиционирования спираль 12 (AF-2 основной домен) с эстрадиола (Е2) - или 4-гидрокси тамоксифен (4OHT) - привязанное LBD димеров2,3. Домен ERα F (45 аминокислоты) Подключите спираль 12 непосредственно. Однако нет никакой информации относительно последствий этого расширения 45 аминокислот (F домен) от спирали 12 на ERα LBD димеризации. В этом исследовании мы продемонстрировать вклад F домена для вегетационных ERα LBD homodimerization 4OHT-зависимых, используя млекопитающих пробирного (м2ч) 2 гибрида.

Assay м2ч способ продемонстрировать белок белковых взаимодействий в mammalian клетках, представляя три различных плазмида ДНК: два белка выражение плазмиды, которые выражают GAL4 ДНК-связывающих доменов (DBD) фьюжн ERα LBD и VP16AD fusion ERα LBD, и GAL4RE-кварцевое Люцифераза выражение репортер плазмиды. Когда GAL4DBD fusion ERα LBD и VP16AD синтеза ERα LBD взаимодействуют (сделать димер) в клетках, этот комплекс белков привязывается к GAL4RE и, затем, активирует Люцифераза экспрессии генов через функцию transactivation VP16AD-зависимых. Уровень LBD homodimerization могут быть оценены Люцифераза деятельности.

Assay (Y2H) 2 гибрида дрождей-альтернативный метод, основанный на тот же принцип, который использует дрожжей в качестве хост-среды. Предыдущие доклады, с использованием системы Y2H продемонстрировал, что F-домен усечение человека ERα LBD увеличивает E2-зависимой coactivator набора, заключение, что домен F предотвращает E2-опосредованной транскрипции4. Этот результат является несовместимым с другими докладами, которые продемонстрировали аттенуированные транскрипционный анализ деятельности F-домен усечение человека ERα в mammalian клеток5,6. Недавно наше исследование, с использованием системы M2H, показали, что активность набора E2-зависимой coactivator человека ERα LBD уменьшается на F домена усечения в mammalian клетках и согласуется с транскрипции деятельность1. Эти наблюдения предполагают, что Физиологическая роль взаимодействия протеин протеина отличается в манере определенного типа клеток и контекст. М2ч assay может продемонстрировать деятельность взаимодействия протеин протеина в том же контексте сотовой, который используется для определения транскрипционный анализ активности. Это обеспечивает преимущество пробирного M2H, по сравнению с Y2H или других в vitro анализ взаимодействия протеин протеина.

Остаются вопросы относительно молекулярные механизмы активность частичный агонист модуляторы рецептора селективного эстрогена (SERM) (например, 4OHT) для регулирования ERα-опосредованной транскрипции. На основе ERα LBD м2ч анализов могут быть применены для изучения механизм частичного агониста деятельности SERM в различных типах клеток млекопитающих.

протокол

1. Подготовка плазмид млекопитающих Assay 2 гибрида

  1. Используйте следующие плазмидов: pG5-люк, pBIND-ERαEF и Пакт ERαEF.
    Примечание: Плазмиды доступны от авторов по запросу и отправляются на фильтровальной бумаге. pG5-Люк является репортером плазмида, содержащий пять повторяет GAL4 реагировать элементы сливается с блоком выражения Люцифераза (рис. 1A). pBIND-ERαEF является плазмида выражение протеина для GAL4DBD-кварцевое LBD ERα белков. pBIND-ERαEF содержит блок выражения Люцифераза Renilla для нормализации эффективность трансфекции (рис. 1Б). Пакт ERαEF является белок выражение плазмида VP16AD-плавленый ERα LBD белков (рис. 1C). Схема структуры выразили белков от плазмид показан на рисунке 2.
  2. Подготовьте плазмида ДНК.
    1. Вырезать из области плазмида загружен из бумаги с использованием чистого ножницы и положил его в 1,5 мл трубку. Надевайте перчатки и использовать чистые пинцет, чтобы забрать плазмида загружена бумага. Добавьте 100 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE) (рН 8.0) и вихревой хорошо.
    2. 1 мкл раствора плазмида ДНК из шага 1.2.1 сведущее Escherichia coli клетки (см. Таблицу материалы) и держать трубку на льду за 15 мин.
    3. Теплового шока плазмида Добавлено сведущие клетки; инкубировать трубки в ванну воды 42 ° C за 30 s и, затем, держать их на льду на 2 мин.
    4. 250 мкл супер оптимального бульон с catabolite репрессий (SOC) среднего (комнатной температуры), трубки и культуру с тряску при 37 ° C за 30 мин.
    5. Пластина 100 мкл культивировали E. coli на подогретую тарелку Лурия бульон (LB) 100 мкг/мл ампициллин (10 см диаметр блюдо) и культуры при 37 ° C на ночь.
    6. Выбрать один из колонии от плиты и добавить его в 14 мл, содержащих 2 мл потрясающий бульон (ТБ) с 100 мкг/мл ампициллина. Культура с тряску при 37 ° C, до тех пор, пока средство слегка дымчатый.
    7. Добавьте 1 mL культурной среды из шага 1.2.6 для газобетона 250 мл стеклянную колбу, содержащие 50 мл с 100 мкг/мл ампициллин ТБ. Культура с тряску при 37 ° C для 20-24 ч.
    8. Передача культивировали E. coli к 50 мл Конические трубки и центрифуги на 3,450 x g при комнатной температуре за 30 мин, с использованием swing ведро ротора. Отказаться от среднего. Сохранить E. coli Пелле-80 ° c.
    9. Добавить 3 мл раствора ресуспендирования клеток (см. Таблицу материалы) для е. coli окатышей и приостановить его полностью. Добавить 3 мл раствора лизис клеток (см. Таблицу материалы), смесь трубка мягко, переворачивать его 10 x и держать его на льду в течение 5 мин (держать время пунктуальн). Добавить 6 мл нейтрализации раствора (см. Таблицу материалы), смешать трубка постоянно с выстукивать и затем, держать его на льду за 10 мин.
    10. Центрифуга трубку 3,450 x g при 4 ° c на 30 мин, с использованием swing ведро ротора. ДНК содержащие решение передать новой 50 мл Конические трубки и добавляют 10 мл ДНК очистки смолы (см. Таблицу материалы). Осторожно приостановите смолы.
    11. Центрифуга трубки на 625 x g за 1 мин, с использованием swing ведро ротора. Отменить решение и сохранить смолы на дне.
    12. Добавить 15 мл промывочного раствора столбца (ацетат калия 80 мм, 8,5 мм трис-HCl [pH 7.5], 40 мкм ЭДТА и 55% этиловом спирте) 50 мл конические пробки и встряхните его осторожно, чтобы приостановить смолы. Повторите шаг 1.2.11.
      Примечание: Промывочный раствор столбца должны подготавливаться с использованием диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-лечение воды или воды, свободной от нуклеиназы.
    13. Добавить 5 мл промывочного раствора столбец в 50 мл Конические трубки и приостановить смолы с 5 мл пипетки. Применить к столбцу смолы (см. Таблицу материалы), для которого задается на вакуумный коллектор. Вакуумные столбца до тех пор, пока сухие смолы. Добавьте 6 мл промывочного раствора столбец в столбец и вакуума.
    14. Как только смола сохнет визуально, отсоедините резервуар из столбца. Передать в нижней части столбца (смола) 1,5 мл. Центрифуга для столбца максимальная скорость за 2 мин, с использованием microcentrifuge полностью высохнуть смолы.
    15. В нижней части столбца (смола) передать новой 1,5 мл трубки. Добавить 300 мкл нуклеиназы свободной воды в столбце и подождать до тех пор, пока вся смола пропитанной.
    16. Центрифуга для столбца максимальная скорость за 1 мин для сбора плазмида ДНК содержащих решения (200-250 мкл).
    17. Лечить ДНК содержащие решение с фенол хлороформ (1:1), затем с метилхлороформа следующим образом.
      1. Добавьте такой же объем фенол хлороформ (1:1) в ДНК содержащие решение (200-250 мкл), взболтайте и центрифуги с максимальной скоростью за 2 мин, с использованием microcentrifuge. Собирать верхний слой (ДНК содержащих раствор) и добавить его к новой 1,5 мл трубки. Повторите этот шаг 1 x.
      2. Добавьте такой же объем хлороформ в ДНК содержащие решение (200-250 мкл), хорошо встряхнуть и центрифуги на максимальной скорости на 1 мин собирать верхний слой (ДНК содержащих раствор) и добавить его в 1,5 мл.
        Примечание: Эндотоксина (липополисахарида) индуцирует клеточных сигналов в некоторых клетках. Чтобы избежать такой неожиданный эффект, шаг 1.2.17 рекомендуется, который может уменьшить загрязнение эндотоксин.
    18. Осадок плазмидной ДНК с помощью метода осадков этанола следующим.
      1. Добавить 1/9 ДНК смесь объема ацетат натрия 3 M (рН 5,5) и 20 x 3M натрия ацетата объема 100% этанола в ДНК содержащие решение. К примеру добавьте 27.8 мкл ацетат натрия 3 M и 278 µL 100% этанола в 250 мкл раствора ДНК (окончательный объем является 555.8 мкл).
      2. По крайней мере сохранить решение на-80 ° C в течение 20 мин. Центрифуга для максимальной скоростью 20 мин на 4 градусов. Отменить решение и держать гранулы. Добавить 200 мкл 75% этанола и ополосните внутреннюю трубку. Центрифуга для 20 минут при температуре 4 ° C, отменить решение и держать гранулы. Сухие гранулы ДНК с помощью вакуумного концентратор.
      3. Добавьте 100-250 мкл буфера TE (рН 8.0) в трубку. Растворяют гранулы ДНК и проверьте концентрации ДНК, используя спектрофотометр на длине волны 260 Нм. Держите концентрации ДНК вокруг 0.5 мг/мл.

2. млекопитающих 2 гибрида Assay

  1. Сохранить клетки.
    1. Культура человека гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 клетки в 750 мл, флакон культуры ткани2 175 см с свободного фенола Красного минимальных основных СМИ (MEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС; инактивированная тепла), 2 мм L-глютамином и 1% пенициллин стрептомицином решение (антибиотики) для поддержания клеток.
    2. Культура клетки в 5% CO2-дополнениями, инкубатора 37 ° C до тех пор, пока клетки являются около 90% притока.
      Примечание: Для уменьшения эстрогенных фоновой активности, свободного фенола Красного среднего должно использоваться для всех м2ч экспериментов. Этот шаг должен выполняться внутри чистый скамейке/биологической безопасности кабинета. После общего mammalian клетки культуры протокола7следует сохранить клетки.
  2. Подготовьте для transfection клетки.
    Примечание: Следующие процедурные шаги должны выполняться внутри чистый скамейке/биологической безопасности кабинета. Клетки культивировали/инкубировали в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора в этот шаг каждый раз.
    1. Replate 90% вырожденная клетки 24-ну пластины; Промойте клетки 1 x с фосфат амортизированное saline (PBS).
    2. Добавить 7 мл 0,05% раствора трипсина ЭДТА в колбу культуры и замочить клетки для 1-2 мин при сохранении культуры колбу в лавочке чистой при комнатной температуре. Удалите часть решения трипсина ЭДТА и оставить 1-2 мл раствора в колбу культуры. Инкубируйте культуры колбу в инкубаторе для 1-2 мин.
    3. Привкус в нижней части Фляга для отсоединения клетки и проверить клетки под микроскопом.
      Примечание: Если клетки по-прежнему привязаны к колбе, инкубировать еще 1-2 мин и затем повторите шаг 2.2.3.
    4. Приостановить клетки в свободного фенола Красного MEM, дополнена 10% древесный уголь раздели FBS (тепло инактивированная), 2 мм L-глютамина и 1% раствора пенициллина и стрептомицина.
      Примечание: Уголь раздели FBS должны использоваться для уменьшения эффекта сыворотки производные эндогенных эстрогенов.
    5. Подсчитать ячейки и семян клетки в 24-ну пластины на плотности 1.2 x 105 клеток/хорошо. Назначьте трех скважин для каждой точки данных (в трех экземплярах).
    6. Культура клетки на ночь. Продолжать шаг 2.4.1.
  3. Подготовка смеси ДНК для transfection.
    Примечание: Следующие плазмида ДНК являются transfected в одной скважины: 100 нг pG5-Люк репортер плазмида, 50 нг выражение плазмид GAL4DBD синтез белков (pBIND) и 50 нг выражение плазмид VP16AD синтез белков (Пакт).
    1. Для анализа активности димеризации лиганд зависимой ERα LBD, подготовьте следующие комбинации (рис. 3). Комбинация (i): Пакт + Пакт и pG5-люк, pG5-Люк + pBIND-mERαEF + pBIND-hERαEF. Комбинация (ii): Пакт mERαEF + Пакт hERαEF и pG5-люк, Люк pG5 + pBIND-mERαEF + pBIND-hERαEF. Комбинация (iii): Пакт mERαEF + Пакт hERαEF и pG5-люк, Люк pG5 + pBIND + pBIND.
      Примечание: Комбинация (i) представляет собой базальной экспериментальной уровень человека ERα LBD и мыши ERα LBD, соответственно. Если результат показывает удивительно высокий уровень с лигандом только, этот метод является невозможным для использования с этой лиганда (например, диэтилстильбестрол [DES]). Комбинация (ii) представляет уровень димерной человека ERα LBD и димерной мыши ERα LBD, соответственно. Комбинация (iii) представляет собой негативный контроль; Используйте этот набор, только когда эксперимент проводится впервые оценить уровень фона системы.
    2. Перед смешиванием, вычислить сумму ДНК, необходимое на основании числа скважин для transfection. Для экспериментов, проведенных в triplicates и пяти данных точках, смесь следующих плазмида ДНК в две 1,5 мкл трубы для комбинации (i) и (ii): pG5-люк, 5 (точек) x 3 (скважин) x 100 ng = 1500 нг (15 мкл); pBIND-mERαEF, 5 (точек) x 3 (скважин) x 50 ng = 750 нг (7,5 мкл); Пакт (для комбинации i) или Пакт mERαEF (для комбинации ii), 5 (точек) x 3 (скважин) x 50 ng = 750 нг (7,5 мкл).
      Примечание: Концентрация каждого решения плазмида ДНК — 0,1 мкг/мкл.
    3. Осадок ДНК смесь с использованием метода осадков этанола. Добавить 1/9 ДНК смесь объема ацетат натрия 3 M (рН 5,5) и 20 x 3M натрия ацетата объема 100% этанола в ДНК смесь. Затем вихревой трубе.
      Примечание: К примеру, добавьте 3.4 мкл ацетат натрия 3 M и 34 µL 100% этанола 30 мкл плазмида ДНК смесь в шаге 2.3.2. Этот шаг помогает сохранить неизменной трансфекции условие и нет необходимости выполнять этот шаг в биологической безопасности кабинета.
    4. Хранить смесь на ночь при-20 ° C. Центрифуга с максимальной скоростью 20 мин при 4 ° C. Отменить решение (гранулы невидимым). 120 мкл 75% этанола на трубу; затем промойте внутри трубки. Центрифуги для 20 мин при 4 ° C. Отменить решение и сухие смеси ДНК, с помощью вакуума концентратор для 30 мин.
  4. Выполните transfection.
    Примечание: Следующие шаги должны выполняться в чистой скамейке или биологической безопасности кабинета.
    1. Следующее утро промойте клетки, посеяна в 24-ну пластины (от шага 2.2.6) 2 x 0.5 мл PBS (комнатной температуры).
    2. Добавьте, теплые (37 ° C) свежие свободного фенола Красного MEM дополнена 10% древесный уголь раздели FBS (тепло инактивированная) и 2 мм L-глютамин без антибиотиков для каждой скважины (0,5 мл средний/хорошо). Держите клетки в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора.
    3. Приостановите сушеные плазмида ДНК смесь (из шага 2.3.4) в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) (не сыворотки, фенола Красного бесплатно, без глютамина; 13 мкл/хорошо). Рассчитайте количество DMEM из числа скважин для transfection.
      Примечание: 15 скважин для комбинации (i) x 13 мкл = 195 мкл и 15 скважин для комбинации (ii) x 13 мкл = 195 мкл.
    4. Приостановить трансфекции реагента (смотрите Таблицу материалов; 1,5 мкл/хорошо) в среде DMEM (12,5 мкл/а) в другой 1,5 мл. Рассчитайте количество трансфекции реагента и DMEM из числа скважин для transfection.
      Примечание: 30 [15 скважин для комбинации] (i) и 15 скважин для комбинации (ii) x 1.5 мкл Реагента трансфекции + 30 x 12,5 мкл DMEM = 420 мкл.
    5. Добавьте равное количество трансфекции реагент средних (от шага 2.4.4) для каждой трубы (от шага 2.4.3). Инкубируйте трубы для 5-10 мин при комнатной температуре.
      Примечание: 200 мкл трансфекции реагент средний + 195 мкл комбинации (i) ДНК смесь = 395 мкл и 200 мкл трансфекции реагент средний + 195 мкл комбинации (ii) ДНК смесь = 395 мкл. Важно добавить равный объем трансфекции реагент средних трубы комбинации (i) и (ii). Нет необходимости использовать средство в этом шаге.
    6. Добавить комбинированного смесь (из шага 2.4.5) для каждой скважины (25 мкл/хорошо) 24-ну пластины (от шага 2.4.2) и инкубации клеток для 6 ч в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора.
    7. Удалите средство transfection с 24-ну пластины. Добавить, теплые (37 ° C) свежие свободного фенола Красного MEM дополнена 10% древесный уголь раздели FBS (тепло инактивированная), 2 мм L-глютамином, раствор 1% пенициллин стрептомицином и лигандом (приостановлено в этиловом спирте) (0,5 мл средний/хорошо). Культура клетки для 16-18 ч в 5% CO2-дополнениями, 37 ° C инкубатора.
  5. Сбор образцов.
    1. Промойте клетки с 1 мл раствора PBS и, затем, 100 мкл 1 x пассивной литического буфера (см. Таблицу материалы).
    2. Энергично встряхните 24-ну пластины с вихревой смеситель для отсоединения клетки.
    3. Заморозить пластины (lysates клетки) 1 x жидким азотом или сохранить их на-80 ° C до анализа. Непосредственно перед assay энергично встряхните пластины на шейкер до тех пор, пока они находятся при комнатной температуре.
      Примечание: Этот процесс предотвращает нерегулярно появление аномальных значений Люцифераза деятельности.
  6. Выполните двойной Люцифераза assay.
    1. Подготовка реагентов для двойной Люцифераза пробирного системы (см. Таблицу материалы).
      1. Для изготовления Люцифераза пробирного субстрата (ЛАГ) буфера, добавьте все Люцифераза аналитического буфера в субстрат пробирного Люцифераза, который находится в коричневый стеклянной бутылке. Сохранить буфер Лас-20 ° c.
        Примечание: Лас буфер должен быть разогрет к комнатной температуре перед использованием.
      2. Для изготовления Renilla Люцифераза субстрата (RLS) буфер, смесь Renilla Люцифераза субстрата и Renilla Люцифераза буфер в пропорции 1:50. Сделать свежий RLS буфер для каждого пробирного и использовать черная труба или труба тени фольги. Рассчитайте количество RLS буфера, делая свежий буфера.
        Примечание: RLS буфер должен быть разогрет до комнатной температуры перед использованием.
    2. Набор реагентов в Считыватель микропланшетов.
      1. Мыть инъекции линии 2 x с 70% этиловом спирте; затем вымойте линии 2 x с водой.
        Примечание: Это имеет важное значение для предотвращения тревожные результаты анализа.
      2. Лас буфера P-инжектор линии (первая инъекция) и установить RLS буфера линии M-инжектор (второй инъекции). Не следует смешивать эти буферы. RLS буфера подавляет активность Люцифераза.
    3. Примените 10 мкл собранных образцов (от шага 2.5.3) 96-луночных Белые пластиковые пластины.
    4. Задайте следующие параметры в Считыватель микропланшетов. Для P-инжектор, используйте объем 50 мкл, задержка 2 s и скорость 50 мкл/сек. Для M-инжектор, используйте объем 50 мкл, задержка 2 s и скорость 50 мкл/s. задать время интеграции 15 s. набора при температуре до 25 ° C.
    5. Запустите Считыватель микропланшетов.
    6. Запись значения Люцифераза деятельности (IPValue) и значения деятельности Люцифераза Renilla (IMValue), с помощью программы сбора данных (см. Таблицу материалы).
    7. Мыть топливопроводы после сбора данных (см. шаг 2.6.2.1).
  7. Выполните анализ данных.
    1. Используйте нормализованные значения (IPValue/IMValue) для анализа данных.
    2. Установите уровень нормализованное значение (i) [pG5-Люк + pBIND-ERαEF Пакт] комбинации с транспортного средства (0 Нм лигандом) как 1 для расчета базального уровня и homodimerized ERα LBD. Уровни представлены как «Относительная активность».

Результаты

Рисунок 3 показывает схема возможных ответов в сочетании (i) и (ii) плазмида transfected клеток комбинации. Экспериментальные результаты показаны на рисунке 4. Деятельность комбинации (i) (pG5-Люк + pBIND-mERαEF пакт) показывает стимуляции на 10 Нм E2 (

Обсуждение

Здесь мы описали протокол M2H assay, сосредоточив внимание на условиях анализа для обнаружения homodimerization деятельность ERα LBD качестве примера. В общем м2ч пробирного не популярен для оценки лиганд зависимой ERα LBD димеризации активности. Это объясняется ERα LBD, обладающие transcriptional активации фун?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего объявить.

Благодарности

Авторы благодарят Drs. отдела и Ван на Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS) за их критического чтения рукописи и Таннер Джефферсон для выполнения процедуры на видео. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения грант 1ZIAES070065 (для K.S.K.) из отдела интрамуральных исследования NIEHS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
pG5-LucPromegaE249AComponent of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBINDPromegaE245AComponent of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACTPromegaE246AComponent of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404010
Centrifuge RotorSORVALL75006445
Swing BucketsSORVALL75006441
Cell Resuspension Solution (CRA)PromegaA7112
Cell Lysis Solution (CLA)PromegaA7122
Neutralization Solution (NSA)PromegaA7131
Column Wash Solution (CWB)PromegaA8102
Wizard Midipreps DNA Purification ResinPromegaA7701
Wizard MidicolumnsPromegaA7651
MEM, no glutamine, no phenol redGibco51200038
L-glutamine (200 mM)GibcoA2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x)Gibco15400054
Penicillin-Streptomycin (100x)Sigma-AldrichP0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS)Gemini-Bio100-106Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serumGemini-Bio100-119Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol redGibco31053028for transfection
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027
Passive Lysis 5X BufferPromegaE1941
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1980
SpectraMax L microplate readerMolecular Devices
SoftMax Pro SoftwareMolecular Devices

Ссылки

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. . Human Cell Culture Protocols. , (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1422

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены