포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

요약

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

초록

에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. ERα 단백질의 순서는 높은 종 가운데 보존 됩니다. 그것은 인간의 기능 및 마우스 ERαs는 동일 생각 되었습니다. 우리는 쥐와 인간 ERα ligand 바인딩 도메인 (LBD) 이합체 화 활동 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 차동 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT) 효과를 보여줍니다. M2H 분석 결과 LBD homodimerization 활동의 포유류 세포, 2 개의 단백질 식 플라스 미드 (GAL4 DNA 바인딩 도메인 [DBD] 퓨전 LBD와 VP16 transactivation 도메인 [VP16AD] 퓨전 LBD)의 transfection를 활용 하 여 효율을 보여줄 수와 GAL4 응답 요소 (GAL4RE) 융합 luciferase 기자 플라스 미드. 때 GAL4DBD 퓨전 LBD와 VP16AD 퓨전 LBD는 이합체 셀에, 복잡 한이 단백질이는 GAL4RE를 한다, 다음, VP16AD 종속 전사 활동을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. 4OHT 중재 luciferase 활성화는 마우스 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 보다 인간 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 transfected 세포에서와 페 된 HepG2 세포에서 높다. 이 결과 4OHT 종속 마우스 ERα LBD homodimerization 활동의 효능은 인간의 ERα LBD 보다 나왔다. Agonistic ligands LBD 활동의 기저 수준 향상과 그 LBD 이합체 화 활동의 탐지를 방해 하기 때문에 일반적으로, M2H 분석 결과의 활용, 핵 수용 체 LBD 이합체 화 활동의 평가 위해 적합 하지 않습니다. 우리는 4OHT ERα LBD 기저 활동을 강화 하지 않습니다 발견. 그것은 결정 하 고 성공적으로 M2H 분석 결과 사용 하 여 4OHT 종속 LBD 이합체 화 활동 감지 수 있는 위한 핵심 요소 이다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 선택적 에스트로겐 수용 체 변조기 (예, 4OHT)의 부분적인 주 작동 근 활동 연구에 적용할 수 있습니다.

서문

에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. 아미노산 sequenceof ERα이 높은 종 가운데 보존 됩니다. 인간 사이의 높은 상 동 때문에 및 ERα 마우스,이 수용 체의 기능으로 동일의 생각 하 고 그 종에서 estrogenic 물질 (예, tamoxifen)의 차동 활동은 종족의 차이에 의해 발생 화학 물질 대사 보다는 ERα의 구조적 차이 의해. ERα 높은 F 도메인 A를 지정 하는 핵 수용 체 (NR) superfamily 중 공통 되는 도메인 구조를 보존 했다. E 도메인 또는 ligand 바인딩 도메인 (LBD) 포함 ligand 바인딩 주머니와 transcriptional 활성화 기능 2, AF-2 라는. F 도메인 E 도메인에 인접 한 지역화 이며이 NRs 중 가장 변수 도메인. 인간 사이도 마우스 ERα, F 도메인의 homology 다른 도메인¹보다 크게 낮습니다. Ligand 바인딩 ERα LBD ligand 의존 유전자 전사 (ERα의 고전 액션) 규제에 대 한 직접 특정 스 트로 겐-응답 DNA 요소를 바인딩할 ERα 단백질의 homodimerization 향상. 결정학 연구 LBD 이합체^2,3바운드 나선 estradiol (e 2)-또는 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT)-12 (AF-2 핵심 도메인)의 차동 위치를 계시 했다. ERα F 도메인 (45 아미노산) 나선 12를 직접 연결 합니다. 그러나, ERα LBD 이합체 화에 나선 12에서에서 45 아미노산 (F 도메인)의이 확장의 효과 관한 어떠한 정보도가 있다. 이 연구는 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 종의 4OHT 종속 ERα LBD homodimerization F 도메인의 기여 보여 줍니다.

M2H 분석 결과 3 개의 다른 플라스 미드 DNAs를 소개 하는 포유류 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 설명 하는 방법: GAL4 DNA 바인딩 도메인 (DBD) 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD, 표현 하는 두 단백질 식 플라스와 GAL4RE 융합 luciferase 식 기자 플라스 미드 GAL4DBD 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD의 상호 작용 (게는 이합체)는 세포에이 단백질 복잡 한에 GAL4RE 바인딩하고, 다음, VP16AD-종속 transactivation 기능을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. LBD homodimerization의 수준 luciferase 활동에 의해 평가할 수 있습니다.

효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 호스트 환경으로 누 룩을 사용 하는 동일한 원리에 따라 대체 방법입니다. Y2H 시스템을 사용 하 여 이전 보고서 인간 ERα LBD F 도메인 잘립니다 F 도메인 E2 중재 전사⁴방지 결론 E2-종속 coactivator 모집 증가 설명 했다. 이 결과 포유류 세포^5,6에 인간 ERα F 도메인 잘릴 감쇠 transcriptional 활동 증명 다른 보고서와 일치 하지 않습니다. 최근, M2H 시스템을 사용 하 여 우리의 연구는 인간 ERα LBD의 E2-종속 coactivator 모집 활동 F 도메인 잘림 포유류 세포에 의해 감소 하 고 전사 활동¹와 일치 하는 설명 했다. 이러한 관측 단백질 단백질 상호 작용의 생리 적 역할 컨텍스트에 셀 형식별 방식으로 다른 것이 좋습니다. M2H 분석 transcriptional 활동을 결정 하는 데 사용 되는 동일한 세포 컨텍스트에서 단백질 단백질 상호 작용 활동을 설명할 수 있다. 이 Y2H 또는 다른 시험관에 단백질-단백질 상호 작용 분석에 비해 M2H 분석 결과의 이점을 제공 합니다.

선택적 에스트로겐 수용 체 (serm) (예, 4OHT) ERα 중재 전사 조절 하의 부분적인 주 작동 근 활동의 분자 메커니즘에 대 한 질문에 남아 있다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 SERMs의 부분적인 주 작동 근 활동의 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 포유류 2 하이브리드 분석 결과 대 한 플라스 미드의 준비

1. 다음 플라스 미드를 사용 하 여: pG5 뤽, pBIND-ERαEF, 그리고 협정-ERαEF.
   참고:는 플라스 미드는 요청 시 저자에서 고 필터 종이에 전송 됩니다. pG5 뤽 기자 플라스 미드 GAL4 응답 요소 luciferase 식 장치(그림 1)융합의 5 개의 반복을 포함 하는. pBIND-ERαEF ERα LBD GAL4DBD 융합 단백질의 단백질 식 플라스 미드 이다. pBIND-ERαEF Renilla luciferase 식 단위를 포함 되어 있습니다 transfection 효율 (그림 1B)를 정상화. 협정-ERαEF ERα LBD VP16AD 융합 단백질 (그림 1C)에 대 한 단백질 식 플라스 미드 이다. 표현한 단백질 구조는 플라스 미드에서의 다이어그램은 그림 2에 표시 됩니다.
2. 플라스 미드 DNAs를 준비 합니다.
   1. 깨끗 한가 위를 사용 하 여 용지에서 플라스 미드 로드 영역을 잘라내어 1.5 mL 튜브에 넣어. 장갑을 착용 하 고 깨끗 한 핀셋을 사용 하 여 플라스 미드 로드 종이를 선택. 잘 100 µ L 트리 스-EDTA (테) 버퍼 (pH 8.0)의 소용돌이 추가 합니다.
   2. 1 µ L 추가 단계에서 플라스 미드 DNA 솔루션의 유능한 대장균 을 1.2.1 ( 재료의 표참조) 세포와 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지.
   3. 플라스 미드-추가 열-충격 유능한 세포; 30 42 ° C 물 목욕에 tube(s)를 품 어 s 그리고, 다음, 2 분 동안 얼음에 그들을 유지.
   4. 30 분 동안 37 ° C에서 흔들어와 문화와 tube(s)를 catabolite 억압 (SOC) 매체 (실내 온도)와 슈퍼 최적의 국물의 250 µ L를 추가 합니다.
   5. 하룻밤 100 µ g/mL 암 피 실린 (10 cm 직경 접시)와 문화 37 ° C에서의 prewarmed Luria 국물 (파운드) 접시에 교양된 E. 대장균 100 µ L 플레이트.
   6. 접시에서 한 식민지를 선택 하 고 100 µ g/mL 암 피 실린과 훌륭한 국물 (TB)의 2 개 mL를 포함 하는 14 mL 튜브에 추가. 매체는 희미하게 흐리게 때까지 37 ° C에서 흔들어와 문화.
   7. 100 µ g/mL 암 피 실린과 결핵의 50 mL를 포함 하는 압력가 250 mL 유리 플라스 크를 단계 1.2.6에서에서 교양된 매체의 1 mL를 추가 합니다. 20-24 h에 대 한 37 ° C에서 흔들어와 문화.
   8. 50 mL 원뿔 튜브와 스윙 양동이 터를 사용 하 여 30 분 동안 실내 온도에 3450 x g 에서 원심 분리기를 교양된 대장균 을 전송 합니다. 매체를 버리십시오. -80 ° c.에 대장균 펠 릿 저장
   9. 셀 물의 resuspension 솔루션의 3 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조) 대장균 에 작은 그리고 그것을 완전히 중단. 세포 세포의 용 해 솔루션의 3 개 mL를 추가 (참조 테이블의 자료), 믹스 그것을 반전 하 여 부드럽게 튜브 10 배, 5 분 동안 얼음에 그것을 유지 하 고 (시간을 어기지 유지). 추가 중화 솔루션의 6 mL ( 재료의 표참조), 도청, 꾸준히 튜브 믹스와 다음, 10 분 동안 얼음에 그것을 유지.
   10. 3450 x g 30 분 스윙 양동이 터를 사용 하 여 4 ˚C에에 튜브 원심 새로운 50 mL 원뿔 튜브를 포함 하는 DNA 솔루션을 전송 및 DNA 정제 수 지의 10 mL을 추가 ( 재료의 표참조). 부드럽게 수 지를 일시 중단 합니다.
   11. 625 x g 스윙 양동이 터를 사용 하 여 1 분 동안에 튜브 원심 솔루션을 삭제 하 고 하단에 수 지를 유지.
   12. 추가 열 세척 솔루션의 15 mL (80 mM 칼륨 아세테이트, 8.5 m m Tris HCl [pH 7.5] 40 µ M EDTA, 그리고 55% 에탄올) 50 mL 원뿔 튜브 및 수 지 일시 중지를 부드럽게 흔들어. 1.2.11 단계를 반복 합니다.
       참고: 열 세척 솔루션 준비 해야 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 사용 하 여-물 또는 nuclease 무료 물 처리.
   13. 50 mL 원뿔 튜브를 열 세척 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 5 mL를 피펫으로와 수 지를 중지. 열 수 지를 적용 하는 진공 매니폴드에 설정 ( 재료의 표참조). 수 지 건조 될 때까지 열을 진공. 열 및 진공 열 세척 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.
   14. 일단 수 지 시각적으로 건조, 열에서 저수지를 분리 합니다. 1.5 mL 튜브에 열 (수 지)의 아랫부분을 전송. 열 수 지를 건조 하는 microcentrifuge를 사용 하 여 2 분 동안 최대 속도로 원심
   15. 새로운 1.5 mL 튜브에 열 (수 지)의 아랫부분을 전송. 열에 nuclease 무료 물 300 µ L을 추가 하 고 전체 수 지 젖 될 때까지 기다립니다.
   16. 플라스 미드 DNA를 포함 하는 솔루션 (200-250 µ L) 수집을 1 분 동안 최대 속도로 열 원심
   17. 페 놀-클로 프롬 (1:1), 클로 프롬과 다음을 포함 하는 DNA 솔루션을 다음과 같이 처리 합니다.
       1. 포함 하는 DNA 솔루션 (200-250 µ L) (1:1) 페 놀을 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘, 흔들는 microcentrifuge를 사용 하 여 2 분 동안 최대 속도로 원심. 상위 레이어 (DNA를 포함 하는 솔루션)을 수집 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 추가. 1 x이이 단계를 반복 합니다.
       2. 클로 프롬의 동일한 볼륨을 포함 하는 DNA 솔루션 (200-250 µ L) 추가, 쉐이크, 그리고 분리기 최대 속도에서 1 분에 대 한 상위 레이어 (DNA를 포함 하는 솔루션)을 수집 하 고 1.5 mL 튜브에 추가.
          참고: 내 (lipopolysaccharide) 일부 세포에 세포 신호 유도 합니다. 같은 못했던된 효과 방지 하려면 단계 1.2.17 권장, 내 오염 줄일 수 있습니다.
   18. 플라스 미드 같이 에탄올 강 수 기법을 사용 하 여 DNA를 침전.
       1. 1/9 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5)의 DNA 혼합물 볼륨의 추가 및 포함 하는 DNA 솔루션을 100% 에탄올의 3 M 나트륨 아세테이트 볼륨의 20 배. 예를 들어 3m 나트륨 아세테이트의 27.8 µ L 및 100% 에탄올의 278 µ L (최종 볼륨이 555.8 µ L) DNA 솔루션의 250 µ L를 추가 합니다.
       2. 적어도 20 분 동안-80 ° C에서 유지 솔루션. 4 ˚C에서 20 분 동안 최대 속도로 원심. 솔루션을 삭제 하 고 펠 릿을 유지. 75% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 고 튜브의 내부를 헹 굴. 4 ° C에서 20 분 동안 centrifuge, 솔루션, 삭제 하 고 펠 릿을 유지. 진공 집중 장치를 사용 하 여 DNA 펠 릿 건조.
       3. 튜브를 100-250 µ L의 TE 버퍼 (pH 8.0)를 추가 합니다. DNA 펠 릿을 녹이 고 260의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 확인 nm. 0.5 mg/mL 주위 DNA 농도 유지 합니다.

2. 포유류 2 하이브리드 분석 결과

1. 셀을 유지 합니다.
   1. 750ml, 페 놀 레드 무료 최소 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 175 cm² 조직 배양 플라스 크에에서 인간 간세포 암 HepG2 세포 문화 (FBS; 열 비활성화), 2 m L-글루타민, m 및 1% 페니실린-스 솔루션 (항생제) 세포를 유지 하기 위한.
   2. 문화 5% CO₂세포-세포는 약 90% 합칠 때까지 보충된, 37 ° C 배양 기.
      참고: estrogenic 백그라운드 작업을 줄이기 위해, 페 놀 레드-무료 매체는 모든 M2H 실험 사용 될 해야 합니다. 이 단계는 깨끗 한 벤치/생물 안전 캐비닛 안에 수행 되어야 한다. 셀 일반 포유류 세포 문화 프로토콜⁷다음 유지 되어야 한다.
2. Transfection에 대 한 셀을 준비 합니다.
   참고: 다음 절차 단계 클린 벤치/생물 안전 캐비닛 안에 수행 되어야 한다. 세포가 5% CO₂배양/incubated-때마다가이 단계에서 보충된, 37 ° C 배양 기.
   1. 24 잘 번호판; 90 %confluent 셀 replate 1 셀 린스 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x.
   2. 문화 플라스 크에 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 7 mL을 추가 하 고 실 온에서 깨끗 한 벤치에 문화 플라스 크를 유지 하면서 1-2 분에 대 한 셀을 담근 다. 트립 신-EDTA 솔루션의 일부를 제거 하 고 솔루션의 1-2 mL 문화 플라스 크에서 떠나. 1-2 분 동안 인큐베이터에서 문화 플라스 크를 품 어.
   3. 세포를 분리 하 고 현미경 세포 확인을 플라스 크의 하단을 헤로인.
      참고: 셀 여전히 플라스 크에 연결 하 고, 또 다른 1 2 분 동안 품 어 고, 다음, 단계 2.2.3를 반복.
   4. 페 놀 레드 무료 MEM 10% 보충에 셀 중단 (열 비활성화) 숯 박탈 FBS, 2 m L-글루타민, m 및 1% 페니실린 스 솔루션.
      참고: 숯 박탈 FBS는 파생 하는 혈 청 내 인 성 에스트로겐의 효과 줄이기 위해 사용 되어야 한다.
   5. 셀 수를 계산 하 고 씨앗 10⁵ 셀/잘 x 1.2의 조밀도에 24-잘 접시에 셀. 각 데이터 요소 (triplicate) 3 우물을 할당 합니다.
   6. 문화는 셀 하룻밤입니다. 2.4.1 단계를 계속 합니다.
3. Transfection에 대 한 DNA 혼합물을 준비 합니다.
   참고: 다음 플라스 미드 DNAs는 하나의 잘 페: 100 pG5 뤽 기자 플라스 미드, 50의 ng ng GAL4DBD 융합 단백질 (pBIND)에 대 한 식 플라스 미드의 그리고 50 VP16AD 융합 단백질 (협정)에 대 한 식 플라스 미드의 ng.
   1. Ligand 의존 ERα LBD 이합체 화 활동을 분석 하려면 다음 조합 (그림 3) 준비 합니다. 조합 (i): pG5 Luc pBIND hERαEF 협정, 및 pG5 뤽 + pBIND mERαEF + + 협정. 조합 (ii): pG5 Luc pBIND hERαEF 협정-hERαEF, 및 pG5 뤽 + pBIND mERαEF + + 협정-mERαEF. 조합 (iii): pG5 Luc pBIND 협정-hERαEF, 및 pG5 뤽 + pBIND + + 협정-mERαEF.
      참고: 조합 (i) 나타냅니다 인간 ERα LBD와 마우스 ERα LBD의 기초 실험 수준을 각각. 결과 보여주는 경우 ligand와 현저 하 게 높은 수준의 혼자,이 메서드는 그 ligand (예를 들어, diethylstilbestrol [데스])와 함께 사용 가능. 조합 (ii)는 각각 dimerized 인간 ERα LBD와 dimerized 마우스 ERα LBD의 수준을 나타냅니다. 조합 (iii) 나타냅니다 부정적인 컨트롤을; 이 세트를 사용 하 여 시스템의 배경 수준 평가를 처음으로 실험을 수행 하는 경우에.
   2. 혼합, 이전 계산 총 transfection에 우물의 수에 따라 필요한 DNA 금액. Triplicates와 5 개의 데이터 요소에서 실시 하는 실험에 대 한 조합 (i) 및 (ii)에 대 한 두 개의 1.5 µ L 튜브에 다음 플라스 미드 DNAs를 혼합: 5 (데이터 요소) x 3 (우물) x 100 ng pG5 뤽 1500 = ng (15 µ L); pBIND-mERαEF, 5 (데이터 요소) 3 (우물) x 50 ng x 750 = ng (7.5 µ L); 협정 (조합) 또는 협정-mERαEF (대 한 조합 ii), 3 (우물) x 50 ng x 5 (데이터 요소) 750 = ng (7.5 µ L).
      참고: 각 플라스 미드 DNA 용액의 농도 0.1 µ g / µ L.
   3. 에탄올 강수량 기술을 사용 하 여 DNA 혼합물을 침전. 1/9 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5)의 DNA 혼합물 볼륨의 추가 및 DNA 혼합물을 100% 에탄올의 3 M 나트륨 아세테이트 볼륨의 20 배. 다음,와 동 튜브입니다.
      참고: 예를 들어 단계 2.3.2에서에서 궁 행 하는 플라스 미드 DNA 혼합물의 30 µ L를 3 M 나트륨 아세테이트, 3.4 µ L 100% 에탄올의 34 µ L 추가 합니다. 이 단계는 불변 transfection 상태를 유지 하는 데 도움이 그리고 그것은 생물 안전 캐비닛에서이 단계를 수행할 필요가 없습니다.
   4. -20 ° c.에 하룻밤 혼합물을 유지 4 ° c.에 20 분 동안 최대 속도로 원심 (펠 릿 보이지 않습니다) 솔루션을 삭제 합니다. 추가 75% 에탄올의 120 µ L 튜브; 그런 다음 튜브의 내부를 헹 구 십시오. 4 ° c.에 20 분 동안 원심 분리기 솔루션을 삭제 하 고 30 분 동안 진공 집중 장치를 사용 하 여 DNA 혼합물을 건조.
4. transfection를 수행 합니다.
   참고: 다음 단계는 깨끗 한 벤치 또는 생물 안전 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.
   1. 다음 아침, 린스 (2.2.6 단계)에서 24-잘 접시에 시드 셀 2 x 0.5 mL PBS (실내 온도)의.
   2. 따뜻한 (37 ℃) 신선한 페 놀 레드 무료 MEM 10% 보충 숯 박탈 FBS (열 비활성화) 및 2 m L-글루타민을 각 영역 (0.5 mL 매체/잘) 항생제 없이 추가 합니다. 5% CO₂셀을 유지-보충된, 37 ° C 배양 기.
   3. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) (페 놀 레드-무료, 글루타민 없이 아무 혈 청, 13 µ L/우물)에 (단계 2.3.4)에서 말린된 플라스 미드 DNA 혼합물을 일시 중단 합니다. DMEM transfection에 우물의 수에서의 금액을 계산 합니다.
      참고: (i) x 13 µ L 조합에 대 한 15 우물 = 195 µ L, 및 (ii) x 13 µ L 조합 15 우물 195 µ L =.
   4. Transfection 시 중단 (참조 테이블의 자료; 1.5 µ L/잘) DMEM에 (12.5 µ L/잘) 또 다른 1.5 mL 튜브에. Transfection 시 약 및 DMEM transfection에 우물의 수에서의 양을 계산 합니다.
      참고: 30 [15 우물 조합] (i)과 조합 (ii) 15 우물 transfection 시 약의 1.5 µ L + DMEM의 µ L 30 x 12.5 x 420 µ L =.
   5. (2.4.3 단계)에서 각 관 (2.4.4 단계)에서 transfection 시 매체의 동일한 금액을 추가 합니다. 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 튜브를 품 어.
      참고: transfection 시 매체 + 조합 (i) DNA 혼합물의 195 µ L의 200 µ L = 395 µ L, transfection 시 매체의 200 µ L + 조합 (ii) DNA 혼합물의 195 µ L = 395 µ L. 그것은 조합 (i) 및 (ii)의 관에 transfection 시 매체의 동일한 볼륨을 추가 해야 합니다. 이 단계에서 매체를 사용 하 여 필요는 없습니다.
   6. 각 (에서 단계 2.4.2) 24-잘 접시의 (25 µ L/잘) 잘 (2.4.5 단계)에서 결합 된 혼합물을 추가 하 고 5% CO₂에 6 h에 대 한 셀을 품 어-보충된, 37 ° C 배양 기.
   7. 24-잘 접시에서 transfection 매체를 제거 합니다. 따뜻한 (37 ℃) 신선한 페 놀 레드 무료 MEM 10% 보충 숯 박탈 FBS (열 비활성화), 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린 스 솔루션 및 리간드 (에탄올에 정지) 추가 (0.5 mL 매체/잘). 5% CO₂16-18 h에 대 한 셀 문화-보충된, 37 ° C 배양 기.
5. 샘플을 수확.
   1. 1 mL의 PBS로 세포를 헹 구 고, 다음, 추가 수동 세포의 용 해 버퍼 x 1의 100 µ L ( 재료의 표참조).
   2. 적극적으로 세포 분리와 동 믹서와 24-잘 접시를 흔들.
   3. 고정 플레이트 (세포 lysates) 1 x 액체 질소에 의해 또는 그들을 저장 하기 전에 분석-80 ° C에서. 분석 결과, 직전 적극적으로 흔들 판 통에 실 온에서 때까지.
      참고:이 프로세스 불규칙 luciferase 활동의 비정상적인 값을 표시 하지 못하도록 합니다.
6. 듀얼 luciferase 분석 결과 수행 합니다.
   1. 시 약 듀얼 luciferase 분석 결과 시스템에 대 한 준비 ( 재료의 표참조).
      1. 만들기 위한 luciferase 분석 결과 기판 (라스) 버퍼, 갈색 유리병에 있는 luciferase 분석 결과 기판에 모든 luciferase 분석 결과 버퍼를 추가 합니다. -20 ° c.에 라스 버퍼 저장
         참고: 라스 버퍼 사용 하기 전에 실내 온도를 따뜻하게 해야 합니다.
      2. Renilla luciferase 기판 (RLS) 버퍼를 만들고, Renilla luciferase 기판 및 Renilla luciferase 버퍼 1시 50분의 비율로 섞는다. 신선한 증후군 모든 분석 결과 대 한 버퍼링 하 고 검은 튜브 또는 튜브 은박지로 음영을 사용. RLS 버퍼 만들기 신선한 버퍼의 양을 계산 합니다.
         참고: RLS 버퍼 사용 하기 전에 실내 온도를 따뜻하게 해야 합니다.
   2. Microplate 리더에는 시 약을 설정 합니다.
      1. 워시 주입 라인 70% 에탄올; 2 x 그런 다음 세척 라인 2 x 물.
         참고: 이것은 시험 결과 방해를 방지 하는 것이 중요입니다.
      2. P-인젝터는 라스 버퍼 설정 (첫 번째 주사) 라인과 M 인젝터 라인 RLS 버퍼 설정 (두 번째 주사). 이러한 버퍼를 혼합 하지 마십시오. 하지 불안 증후군 버퍼 luciferase 활동 억제.
   3. 10 µ L의 수확 (2.5.3 단계)에서 96 잘 흰색 플라스틱 접시에 적용 됩니다.
   4. Microplate 리더에 다음 설정을 적용 합니다. P-인젝터를 사용 50 µ L, 2의 지연의 볼륨 s, 그리고 50 µ L/s의 속도. M-인젝터를 사용 50 µ L, 2의 지연의 볼륨 s, 그리고 15 미 세트의 통합 시간 설정 온도 25 ° c 50 µ L/s 속도
   5. Microplate 리더를 실행 합니다.
   6. Luciferase 활동 (IPValue)의 값과 데이터 수집 프로그램을 사용 하 여 Renilla luciferase 활동 (IMValue)의 값을 기록 ( 재료의 표참조).
   7. 데이터 수집 후 주입 라인을 세척 (단계 2.6.2.1 참조).
7. 데이터 분석을 수행 합니다.
   1. 정규화 된 값 (IPValue/IMValue)를 사용 하 여 데이터 분석을 위해.
   2. 수준의 기초 수준 및 homodimerized ERα LBD의 계산에 대 한 1 차량 (0 nM ligand) (i) [pG5 뤽 + pBIND ERαEF + 협약] 조합의 정규화 된 값을 설정 합니다. 레벨 "상대 활동"으로 표시 됩니다.

결과

그림 3 조합 (i) 및 (ii) 플라스 미드 페 셀 조합에 가능한 응답의 구조를 표시합니다. 실험 결과 그림 4에 나와 있습니다. 조합 (i) (pG5 뤽 + pBIND mERαEF + 협정)의 활동 보여준다 자극 10 nM E2(그림 4),ERα LBD ligand 의존 transactivation 기능 도메인, AF-2을 포함 하기 때문에. 길 항 제 (예를 들어, E2)는...

토론

여기, 우리는 예를 들어 ERα LBD의 homodimerization 활동을 탐지 하기 위한 시험 조건에 초점을 맞추고 M2H 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 일반적으로, M2H 분석 결과 ligand 의존 ERα LBD 이합체 화 활동의 평가 대 한 인기가 되지 않습니다. 이것은 보유 transcriptional 활성화 함수; ERα LBD 활동 방해, 경우도 M2H 분석 결과의 결과. 그러나, 우리가 여기 보여줍니다 M2H 분석 결과 LBD (예를 들어, 4OHT...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pG5-Luc	Promega	E249A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND	Promega	E245A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT	Promega	E246A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010
Centrifuge Rotor	SORVALL	75006445
Swing Buckets	SORVALL	75006441
Cell Resuspension Solution (CRA)	Promega	A7112
Cell Lysis Solution (CLA)	Promega	A7122
Neutralization Solution (NSA)	Promega	A7131
Column Wash Solution (CWB)	Promega	A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin	Promega	A7701
Wizard Midicolumns	Promega	A7651
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054
Penicillin-Streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS)	Gemini-Bio	100-106	Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-119	Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red	Gibco	31053028	for transfection
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027
Passive Lysis 5X Buffer	Promega	E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1980
SpectraMax L microplate reader	Molecular Devices
SoftMax Pro Software	Molecular Devices