实验性近视小鼠模型的诱导与评价

摘要

在该协议中, 我们描述了实验性近视诱导小鼠使用新设计的眼镜和所需的技术, 以实现稳定和可重复的结果, 在眼睛参数测量。

摘要

由于遗传操纵相对容易, 近视眼模型可以成为近视研究的有力工具。诱导动物近视的一个方法是在眼睛前放置几个星期的透明负片 (镜片引起的近视, lim)。然而, 现有的诱导和评价协议因实验室而异。在这里, 我们描述了一种非常实用和可重复的方法, 以诱导 lim 在小鼠使用新设计的眼镜。该方法将镜头稳定地固定在鼠标前的眼睛, 同时允许镜头被取下用于清洁或局部药物管理。表型鲁棒性强, 效率高, 方差小。这里描述的方法可以在断奶后立即应用于小鼠, 从而延长了实验的可能持续时间。我们还为在折射和轴向长度测量中实现可重复的结果提供了技术建议。我们希望这里描述的分步协议和详细的文章能够帮助研究人员更顺利地进行近视实验, 使数据在实验室之间具有可比性。

引言

近视眼的发病率最近急剧上升, 而其发病和进展的机制在很大程度上仍不知道¹。近视最典型的表型是轴向长度 (al) 的伸长, 这增加了视网膜并发症甚至失明的风险²。为了更好地了解近视的发病机制, 发展有效的治疗方法, 有必要建立稳健的近视动物模型和稳定的表型评价。

简单地说, 诱导动物近视状态的方法有两种: 形式剥夺近视 (fdm) 和透镜性近视 (lim)³。前者在眼睛前放置扩散器或缝合眼睑, 以模糊图像, 这影响眼球的正常发育, 导致近视表型。后者将负镜头放置在眼睛前面, 以移动视网膜后面的焦点。视网膜检测焦点的移动, 拉长眼球, 重新调整视网膜和焦点。对于 fdm 来说, 在眼皮闭合或扩散器固定在眼睛前之后, 几乎不需要进一步的维护。对于 lim, 需要取下镜头进行清洁, 以保持其透明度。因此, fdm 在技术上相对容易被诱导。然而, fdm 和 lim 的机制是不同的, 哪种方法在人类中模仿近视仍在争论 3.lim 的优势之一是与 fdm 相比表型更强, 至少在小鼠⁴的情况下是如此。

用于诱导近视的动物包括^{小鸡 5}、猴子6、树7、豚鼠^8只和老鼠⁴.考虑到基因操纵的可能性、丰富的可用抗体和低繁殖成本, 小鼠可能是近视动物模型的首选。然而, 与其他较大的动物相比, 在老鼠眼睛前固定镜片或扩散器是相对困难的, 特别是对于断奶后的幼鼠。对于需要局部药物管理或多个临时眼睛测量的实验, 框架也是必须可拆卸的。另一个挑战是老鼠眼球的形态变化很小, 需要复杂的技术和设备来评估。到目前为止, 不同研究小组使用的不同诱导和测量协议使得很难在实验室之间比较和重复结果。需要一个包含详细信息的标准协议。

以前的作品描述了多种方法来固定镜头或扩散器在鼠标眼睛前面, 如胶合⁹,缝合¹⁰和头戴眼镜架 11^,12。我们将现有的头戴式眼镜 11^、12、13与我们新设计的框架相结合, 开发了一种改进的方案, 以诱导小鼠体内强壮高效的实验近视。该方案可应用于产后第21天 (第21页) 断奶后不久的幼鼠。我们还优化了稳定和精确评估表型的过程, 包括折射和 al。我们希望这种标准化的方案能够帮助近视小鼠成为更容易获得的近视研究模型。

研究方案

庆应义奥大学医学院动物研究伦理委员会批准了所有程序, 这些程序都遵守了《关于在眼科和视力研究中使用动物的 arvo 声明》、《庆应义奥动物实验机构准则》大学和动物研究: 报告活体实验 (arrive) 关于在研究中使用动物的指南。

1. 为老鼠组装眼镜

1. 准备组装眼镜所需的部件 (图 1a)。对于每个鼠标, 准备所有以下: 一个头戴尼龙棒, 一个较高的钛框架, 两个镜头与适当的权力, 根据实验的目的, 一个 m1.4 大小的螺丝, 长度为10毫米, 一个螺母为 m1.4 大小螺丝, 一个普通m1.4 尺寸螺杆垫圈, 厚度 0.3 mm, 以及两个人工指甲头 (材料表)。
   注: 存在两种不同高度的帧。对于一个鼠标, 一个较高的帧和一个较低的帧用作集合。较高的框架应放在较低的框架之上, 以使视觉场对称。框架和镜片是作者研究小组专门设计和制造的。这些信息可通过与本文的相应作者联系获得。其他零件也可以在零售工具商店找到。
2. 将左右眼的镜框分开组装。
   1. 将指尖排列到外面的方向, 以达到最佳的保护效果。将指尖和框架之间的角度调整为130°左右, 以避免遮挡鼠标视觉场 (图 1b)。使用氰基丙烯酸酯胶粘剂将人工指甲提示贴在框架上。
      注: 指甲头可以帮助保护镜头不被鼠标划伤。指甲头的方向必须相反, 因为较高的框架和较低的框架分别用于右眼和左眼。
   2. 等待至少 12小时, 让胶粘剂完全干燥, 然后使用指甲钳调整指甲头的形状约1厘米 x1 厘米通过切割和修剪。
   3. 使用氰基丙烯酸酯胶粘剂将镜片贴在镜框上。用手将镜头放在镜框上, 并水平按住镜框。从镜片边缘注入氰基丙烯酸酯胶粘剂, 使胶粘剂通过表面张力传播。
      注: 粘合剂会腐蚀镜头并影响其透明度, 因此请确保粘合剂只接触镜片的外围部分。采用0屈光度 (d) 平面透镜作为对照, 减镜诱导近视。在其他地方已经描述了不同功率的减镜 (–10 d 到-50d) 的影响^.为了最大限度地提高近视诱因, 建议使用–30 d 镜头诱导近视。通过将镜头转换为 1.5 ml 微管的盖作为扩散器, 也可以通过同一器件诱导 fdm。
3. 将螺丝与从棒的扁平一侧的垫圈拧紧到尼龙棒上。在实验前分别准备眼镜和冰棍, 并准备进一步使用 (图 1c)。
   注: 协议可以在此处暂停。

2. 折射和 al 基线的测量。

1. 在眼球两侧使用含有 5 mgml tropicamide 的一滴肌剂和 5 mgml 盐酸苯乙胺来扩张瞳孔。在全身麻醉前等待至少5分钟。
   注: 在全身麻醉下扩张瞳孔会导致可逆性白内障, 影响测量后。在全身麻醉前, 一定要扩张瞳孔, 等待至少5分钟。肌剂的一滴 (约0.05 毫升) 足以扩张小鼠眼的瞳孔, 而更多的肌剂不会对以下步骤造成伤害。
2. 把老鼠置于全身麻醉之下。轻轻地抓住鼠标的后部皮肤, 防止鼠标撞到眼睛, 直到它完全麻醉。判断全身麻醉的深度是足够的, 如果老鼠不移动, 当它被放在桌子上自由。
   注: 咪唑安定 (40μg/100μl)、medetomidine (7.5μg/100μl) 和酒石酸丁醇 (50μg/100μl) 的组合, 用于体积为 0.01 ml·腹腔内注射的小鼠全身麻醉。一般情况下, 小鼠入睡所需时间不到5分钟。长时间的全身麻醉会导致体温低和心跳缓慢。为了避免全身麻醉对测量的潜在影响, 建议在注射麻醉剂后10分钟内完成所有测量。麻醉鸡尾酒中提供的布托酚提供了大约4小时的镇痛。全身麻醉的适当配方可能因机构而异。
3. 使用红外光反应器^4、9、14测量鼠标眼的折射。调整鼠标眼睛之一的方向, 将第一个 purkinje 图像保持在瞳孔的中心, 并测量沿光轴的折射。测量后, 用相同的程序测量相反的眼睛 (图 2a)。
   注: 折射的测量值受到鼠标眼沿光轴的位置的强烈影响。确保第一个 purkinje 图像在距离瞳孔中心±3度的范围内对齐。光谱域光学相干层析成像 (sd-oct) 系统的工作台可用于折射测量中瞳孔方向^{的微调 4}。
4. 使用 sd-oct 系统^4、15、16测量小鼠眼的 al。将 al 定义为从角膜顶点到光纤附近最亮边界的距离 (图 2b)。
   注: 与折射的测量类似, al 受到鼠标眼方向的强烈影响。角膜顶点可以通过角膜表面的点状反射来证实。视网膜侧的边界在视神经点将是非常模糊的。稍微调整方向, 让边界足够清晰, 可以测量, 但距离视神经不要太远。

3. 将框架固定在鼠标颅骨上。

1. 应用0.1% 纯化的透明质酸钠滴眼液, 以防止每只眼睛干燥。
   注: 眼睛表面的眼珠会影响折射值和轴向长度测量值。在所有测量完成之前, 不要在麻醉后使用滴眼液。
2. 将麻醉鼠标的下巴放在由粘土或任何东西制成的斜坡上, 使头颅的前面水平为水平。
3. 使用70% 乙醇棉签消毒耳朵和眼睛之间的头发和头皮。
4. 用手术剪刀和推子切割耳朵和眼睛之间的皮肤, 以露出大约0.8 厘米²的头骨。使用牙科蚀刻液和棉签去除骨膜。在每只老鼠手术前, 用70% 的乙醇对手术剪刀和推子进行消毒。
   注: 可能需要剪下头发并戴上无菌手套。 在本程序前检查相关动物护理委员会的规定。在大多数情况下, 牙科蚀刻液可以发现作为自固化牙科粘合剂系统的附件之一。如果牙科蚀刻液不可用, 请改用70% 的乙醇。
5. 组装一组没有镜头的框架, 以帮助将棒固定在正确的位置。把镜框放在鼠标头上。仔细调整框架的位置, 以确保两只眼睛都在空框的中间。
6. 使用自固化牙科粘合剂系统将棒贴在鼠标头上。注意不要让粘附系统的液体流入鼠标眼睛。
   注: 使用自固化牙科粘合剂系统的方法在不同的产品。请仔细阅读说明。
   注意: 牙科粘合剂系统中的某些试剂可能有毒。
7. 等待大约 5分钟, 并在不改变棒位置的情况下小心地脱下框架和螺母 (图 3a)。
8. 腹腔内注射 0.75 mg/kg 盐酸阿蒂帕梅唑, 帮助小鼠更快地从麻醉中恢复。将鼠标放入单个保持架, 直到完全恢复。不要让鼠标无人看管, 直到它恢复了足够的意识, 以保持胸骨的清醒。协议可以在这里暂停。

4. 近视眼诱导的启动和事后的维护

1. 手术后等待至少 24小时, 让小鼠完全从麻醉中恢复。抓住棍子, 用镜片把它放在镜框上。诱导从此时开始 (图 3b)。
   注: 为了最大限度地减少麻醉恢复过程中的不适, 并给足够的时间使牙科粘合剂系统凝固, 强烈建议在小鼠完全从麻醉中恢复后, 将其放在框架上。胶粘剂系统的树脂水泥将完全覆盖头皮的伤口。因此, 不需要具体的手术后治疗, 以防止感染和改善术后疼痛。就在第一次穿上镜框后, 老鼠就会过度意识到镜头的存在, 并对其进行大量的划伤。总的行为将在几个小时后恢复正常。带镜片的老鼠可以与正常的老鼠保持相同的密度。
2. 至少每周两次, 用棉签擦拭框架和指甲头清洗, 以保持镜片的透明度。
   注: 没有必要把鼠标麻醉下删除和穿上框架。为老鼠坐着提供支持, 而不是在与它们合作的同时让它们被绞死, 可以减少痛苦。
   1. 如果需要进行临时测量, 请将鼠标置于麻醉之下, 并按照前面所述对鼠标进行测量。诱导可以在小鼠从麻醉中恢复后继续进行。
3. 每周至少清洁两次笼子。
   注: 这有助于保持镜头的清晰度。在鼠标和保持架底部之间放一个网过滤食物残渣也可能是有帮助的。
4. 监测体重和总的行为。在整个实验过程中, 将它们与同龄未接触的小鼠进行比较。
   注: 除了一些划痕行为外, 未治疗的小鼠实验小鼠之间没有明显的变化, 包括体重。

结果

首先, 检查是否准备好了所有必要的部件 (图 1a)。一块组装的眼镜的例子如图 1b所示。除了框架和螺母的主体外, 所有其他部件都是一次性的, 为每只鼠标。一组完整的眼镜如图 1c所示。更改两个帧之间的角度, 以适应不同年龄的鼠标。

折射测量的一个例子如

讨论

为了确保眼镜稳定地固定在鼠标头上, 需要非常注意该协议中的几个步骤。在使用牙科粘合剂系统之前, 必须完全取出骨膜。头骨上的血也需要小心清理。虽然在粘合剂应用后立即进行一点微调是可以接受的, 但在胶粘剂系统干燥之前, 不要频繁移动棒。仔细遵循粘合剂系统的指示, 特别是最终混合物中每个成分的比例。当抓住鼠标在维护眼镜或手术后的后续测量时, 不要将棍子与鼠标的身体一起掌?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan