השראת והערכה של מודל מאתר של קוצר ראייה ניסיוני

Summary

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את תהליך מלא של משקפיים השראת בעכברים באמצעות החדש תוכנן ניסיוני. קוצר ראייה, הטכניקה הדרושה להשגת תוצאות לשחזור ויציבה במדידות פרמטרים עינית.

Abstract

דגם מאתר של קוצר ראיה יכול להיות כלי רב עוצמה עבור מחקר קוצר ראייה בגלל מניפולציה גנטית יחסית קל. דרך אחת כדי לגרום קוצר ראיה אצל בעלי חיים היא לשים ברור מינוס עדשות מול העיניים במשך שבועות (עדשה-induced קוצר ראייה, LIM). עם זאת, הפרוטוקולים הקיימים השראת ולהערכה משתנים מעבדה מעבדה. כאן, אנחנו תיאר שיטה מעשית מאוד לשחזור לזירוז LIM בעכברים באמצעות החדש תוכנן משקפיים. התיקונים שיטה העדשה stably מול העין העכבר בעת מאפשרת העדשה שיוציאו אותך לניקוי או אקטואלי סמים המינהל. גן # מושגים בסיסיים חזקים ויעילים, הסטיה היא קטנה. השיטה המתוארת כאן ניתן ליישם עכברים מיד לאחר הגמילה אשר מרחיב את המשך אפשרי לניסויים. אנחנו גם נתנו טכני מייעץ להשגת תוצאות לשחזור שבירה ומדידות אורך צירית. אנו מקווים פרוטוקול צעד אחר צעד המתוארים כאן, במאמר מפורט יכול לעזור החוקרים לבצע ניסויים קוצר ראייה עם קוצר ראייה בצורה חלקה יותר ולהפוך את הנתונים דומים ברחבי מעבדות.

Introduction

השכיחות של קוצר ראייה גדל באופן דרמטי לאחרונה, ואילו המנגנון של התפתחות והתקדמות שלה עדיין במידה רבה unknow¹. פנוטיפ האופיינית ביותר של קוצר ראייה הוא התארכות של אורך צירית (אי אל), אשר מגביר את הסיכון לסיבוכים ברשתית או אפילו עיוורון². כדאי להבין בפתוגנזה של קוצר ראייה ולפתח טיפולים יעילים, חזקים מודלים בעלי חיים קצר והערכה פנוטיפ יציב יש צורך.

בקצרה, שתי שיטות קיימות עבור גרימת קצר הברית בבעלי חיים: טופס-מניעת קוצר ראייה (FDM), קוצר ראייה עדשות-induced (LIM)³. לשעבר מקומות רשתות ומפזרים מול העין או sutures העפעף כדי לטשטש את התמונה, מה שמשפיע על התפתחות תקינה של גלגל העין, וכתוצאה מכך הפנוטיפ קוצר ראייה. המקומות האחרונים מינוס עדשות מול העין כדי להעביר את נקודת המוקד מאחורי הרשתית. הרשתית מזהה את המשמרת של המוקד, מאריך את גלגל העין כדי ליישר מחדש את הרשתית ואת מוקד. עבור FDM, לאחר העפעף סגור או מפזר תוקנה מול העין, אין כמעט תחזוקה נוספת נדרשת. עבור לים, העדשה צריך להיות המריא לניקוי כדי לשמור אותו לשקוף. לפיכך, FDM קל יחסית לבצע להיגרם טכנית. עם זאת, מנגנוני FDM ו- LIM שונים, באיזו שיטת מחקה את קוצר ראייה-אנוש כדאי עדיין תחת הדיון³. אחד היתרונות של LIM הוא פנוטיפ חזק יותר בהשוואה FDM, לפחות במקרה של עכברים⁴.

חיות שנוצלו להשראת קוצר ראייה כוללים בנות⁵, קופים⁶, חדפי־עצים⁷, שרקנים⁸ועכברים⁴. בהתחשב האפשרות של מניפולציה גנטית, שופע נוגדנים זמינות ועלות נמוכה לגידול, עכברים יכול להיות הבחירה הראשונה כמודל בעלי חיים של קוצר ראייה. לעומת אחרים חיות גדולות, תיקון עדשות או רשתות ומפזרים מול העין העכבר זאת, יחסית קשה במיוחד עבור עכברים צעירים כגון זכות לאחר הגמילה. על הניסויים צריכים אקטואלי והתרופות האמריקני או מדידות העין ביניים מרובות, זה גם הכרחי עבור מסגרת להיות נשלף. אתגר נוסף הוא שינוי מורפולוגי קטן של עכבר גלגל העין, אשר צריך טכניקה מתוחכמת והתקנים להעריך. עד כה, שייצור שונות ומדידת פרוטוקולים המשמשים בקבוצות מחקר שונים מקשה להשוות באופן חוזר את התוצאות מעבר מעבדות. פרוטוקול סטנדרטי עם פרטי נדרש.

עבודות קודמות תיאר בשיטות מרובות כדי לתקן עדשות או רשתות ומפזרים מול העין העכבר, כגון הדבקה⁹, תפרים¹⁰ ו-^11,מסגרת goggle נישאת על הראש¹². אנחנו בשילוב קיימים goggle נישאת על הראש טכניקה^11,12,13 מסגרת שעוצבו לאחרונה שלנו לפתח פרוטוקול ameliorated להשראת עמיד ויעיל ניסיוני. קוצר ראייה בעכברים. הפרוטוקול ניתן ליישם עכברים צעירים מיד לאחר הגמילה ביום כמחנכת 21 (p21). אנחנו גם אופטימיזציה התהליכים להערכת יציב ומדויק של פנוטיפים כולל שבירה, AL. אנו מקווים פרוטוקול מתוקננת זה יכול לעזור ליצור עכברים קצר מודל נגיש בקלות רבה יותר למחקר קוצר ראייה.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה על החיה מחקר של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קאיו דבקה המשפט ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר החזון, המוסדיים הנחיות על ניסויים בבעלי חיים-קאיו ואוניברסיטת המחקר בעל חיים: דיווח ב- Vivo ניסויים (יגיעו) הנחיות השימוש בבעלי חיים במחקר.

1. הרכבת את המשקפיים עבור עכברים

1. הכנת החלקים הדרושים להרכבת של המשקפיים (איור 1 א'). עבור כל עכבר, להכין כל שמקיפים: מקל אחד ניילון נישאת על הראש, אחד גבוה יותר, טיטניום נמוך אחד מסגרת, שתי עדשות עם כוחות תקין על פי מטרת הניסוי, אחד בורג בגודל M1.4 עם אורך 10 מ מ, ביצה אחת לזיון גודל M1.4, ואחד רגיל מכונת כביסה לזיון בגודל M1.4 עם העובי של 0.3 מ מ, ציפורן מלאכותית שתי עצות (טבלה של חומרים).
   הערה: קיימים שני סוגי מסגרות בגבהים שונים. עבור עכבר אחד, אחד גבוה יותר מסגרת ומסגרת נמוך אחד משמשים כערכה. צריך לשים מסגרות גבוה מעל התחתונות כדי להפוך את שדות ראייה סימטרית. מסגרות ועדשות במיוחד מתוכננים ומיוצרים על ידי קבוצת מחקר של המחברים. אלה זמינים על-ידי פנייה המחברים המתאימים של מאמר זה. חלקים אחרים ניתן למצוא בחנויות כלי הקמעונאי.
2. להרכיב מסגרת העין ימינה ושמאלה בנפרד.
   1. לארגן את קצה הציפורן להתמודד עם הכיוון מחוץ להשגת האפקט המגן הטוב ביותר. להתאים את הזווית בין קצה הציפורן למסגרת להיות בערך 130° כדי להימנע מטשטשים את שדה הראייה העכבר (איור 1b). דבקים העצות ציפורן מלאכותית על המסגרת באמצעות דבק דבק מגע.
      הערה: ציפורן עצות שיסייעו לך להגן על העדשה שמשטח על ידי העכבר. הכיוון של העצות הציפורן חייב להיות הפוך כי המסגרת גבוהה יותר לבין המסגרת התחתונה משמשים עבור עין ימין ועין שמאל, בהתאמה.
   2. מחכים לפחות 12 שעות לאפשר את דבק יבש לחלוטין, מכן השתמשו מקוצץ ציפורניים כדי להתאים את צורת הציפורן טיפים להיות על 1 ס"מ × 1 ס"מ על ידי חיתוך, קיצוץ.
   3. דבקים העדשה על המסגרת באמצעות דבק דבק מגע. לשים את העדשה אל המסגרת בעבודת יד והחזק את המסגרת אופקית. להזריק את דבק cyanoacrylate מהקצה של העדשה ותנו התפשטות דבק על ידי מתח.
      הערה: החומר לשחוק את העדשה להשפיע על השקיפות שלה, כדי לוודא שהדבק רק נוגע החלק ההיקפי של העדשה. להשתמש עדשה פלאנו כוחן 0 (D) כפקד ומינוס העדשה כדי לגרום קוצר ראייה. ההשפעה של כוחות שונים של מינוס עדשות (–10 D כדי –50 D) כבר תיאר במקום אחר⁴. כדי להגדיל את התמריץ קוצר ראייה, עדשות –30 D מומלצת גרימת קוצר ראייה. FDM יכולה גם להיגרם עם מכשיר זהה פשוט על ידי שינוי העדשה לתוך הכיפה של 1.5 mL microtube כמו מפזר.
3. להדק את הבורג לתוך המקל ניילון עם למכונת הכביסה מן הצד השטוח של המקל. להכין את עין משקפיים ומקלות לפני הניסוי בהתאמה, במניה להמשך השימוש (איור 1 c).
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

2. מדידות של שבירה, AL בסיסית.

1. החל טיפה אחת של הסוכן mydriatic המכילה 5 מ"ג/מ"ל tropicamide ו 5 מ"ג/מ"ל הידרוכלוריד phenylephrine בכל צד של העין להתרחב התלמיד. המתן לפחות 5 דקות לפני הרדמה כללית.
   הערה: להתרחב התלמיד תחת כללי הרדמה יגרום קטרקט הפיך אשר משפיע על המדד לאחר מכן. תמיד מתרחבים התלמיד לפני הרדמה כללית והמתן לפחות 5 דקות. טיפה אחת (כ- 0.05 מ"ל) של סוכן mydriatic מספיקה להרחבת האישון של העין העכבר, בעוד הסוכן עוד יעשה שום נזק אל השלבים הבאים.
2. לשים את העכבר בהרדמה כללית. לאחוז העור האחורי של העכבר בעדינות כדי למנוע את העכבר הקפצת את העין עד אותו לגמרי מרדימים. לשפוט את העומק של הרדמה כללית יספיק אם העכבר לא זז כאשר זה שם על השולחן באופן חופשי.
   הערה: שילוב של midazolam (40 μg/100 μL), medetomidine (7.5 μg/100 μL) ו- butorphanol tartrate (μL μg/100 50) משמש כאן בשביל הרדמה כללית עבור עכברים עם נפח של הזרקת בקרום הבטן 0.01 מ ל/g. באופן כללי, פחות מ 5 דקות יש צורך עכברים להירדם. זמן רב של הרדמה כללית גורמת נמוכה טמפרטורת הגוף, קצב לב איטי. כדי למנוע את השפעת הרדמה כללית למדידה, גימור כל המדידות בתוך 10 דקות לאחר ההזרקה של הרדמה פוטנציאליים מומלץ. Butorphanol הניתנים קוקטייל הרדמה לספק כ- 4 שעות של שיכוך כאבים. המתכון הנכון הרדמה כללית מאי שונים על ידי מוסדות.
3. למדוד את השבירה של העין העכבר באמצעות^9,4,photorefractor אינפרא-אדום¹⁴. התאם את הכיוון של אחת העיניים העכבר כדי לשמור את התמונה Purkinje הראשונה במרכז האישון ולמדוד את השבירה לאורך הציר האופטי. לאחר המדידה, למדוד את העין הנגדית עם אותם הליכים (איור 2 א).
   הערה: הערך שנמדד עבור השבירה מושפעת מאד המיקום של העין העכבר לאורך הציר האופטי. ודא שהתמונה הראשונה Purkinje מיושר בתוך ±3 מעלות מהמרכז של התלמיד. עבודה, שעליו מונחים בתחום ספקטרלי אופטית קוהרנטית טומוגרפיה (SD-אוקטובר) המערכת עשוי לשמש עבור כוונון עדין של הכיוון של התלמיד שבירה מדידות⁴.
4. למדוד מלאכותית של העין העכבר באמצעות^15,164,מערכת SD-אוקטובר. להגדיר מלאכותית כמו המרחק בין הקודקוד הקרנית לגבול המבריקים ליד העצב (איור 2b).
   הערה: דומה עם המדידה של השבירה, מלאכותית מושפעת מאד הכיוון של העין העכבר. ניתן לאשר הקודקוד הקרנית, כמו נקודת השתקפות על פני הקרנית. הגבול של הצד הרשתית יהיה מאוד מעורפל בנקודת עצב אופטי. להתאים הכיוון קצת לתת את הגבול יהיה מספיק ברור למדידת אבל לא רחוק מדי מן העצב האופטי.

3. קיבוע של המסגרת על גבי הגולגולת העכבר.

1. החל טיפה אחת של 0.1% נתרן מטוהרים היאלורונית העין טיפה כדי למנוע יובש על כל עין.
   הערה: העין טיפה על פני עין ישפיע הדבר על הערכים של שבירה ומדידות אורך צירית. אל תשתמש הטיפה בעין לאחר ההרדמה עד כל המדידות נעשות.
2. לשים את הסנטר של העכבר anesthetized על גבי מדרון מחימר או כל דבר יכול לשמש כרית כדי להפוך את המטוס ישיר הגולגולת להיות אופקית.
3. לחטא את השיער, הקרקפת בין האוזניים והעיניים באמצעות מטלית כותנה עם 70% אתנול.
4. לחתוך את העור בין האוזניים והעיניים לחשוף את הגולגולת עבור 0.8 ס מ² באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה. השתמש ספוגית כותנה של נוזלים איכול שיניים להסרת קרום העצם. לחטא מספריים כירורגיים של פינצטה עם 70% אתנול לפני הניתוח של כל עכבר.
   הערה: מסיכה לשיער, לובש כפפות סטריליות עשוי להידרש.  בדוק להוראות הוועדה הרלוונטית טיפול בבעלי חיים לפני הליך זה. ברוב המקרים, ניתן למצוא את הנוזל איכול שיניים כאחת הקבצים המצורפים במערכת עצמית לרפא שיניים דבק. אם הנוזל איכול שיניים אינה זמינה, השתמש 70% אתנול.
5. להרכיב קבוצת מסגרות ללא עדשה כדי לסייע לתקן את המקל על המיקום הנכון. לשים את המסגרות על הראש העכבר. בזהירות להתאים את המיקום של המסגרות כדי לוודא שבשתי העיניים הן באמצע המסגרת הריקה.
6. השתמש עצמית לרפא שיניים דבק מערכת כדי לחבר את המקל על הראש העכבר. להיזהר לא לתת את הנוזל של הזרם מערכת adhere לתוך העין העכבר.
   הערה: השיטה לשימוש עצמי לרפא שיניים דבק המערכת היא שונה בין מוצרים. להפנות ההוראות בקפידה.
   התראה: חלק ריאגנטים במערכת דבק שיניים עלול להיות רעיל.
7. לחכות בערך 5 דקות, להוריד את המסגרת ואת האגוז בזהירות מבלי לשנות את המיקום של הסטיק (איור 3 א).
8. להזריק 0.75 mg/kg הידרוכלוריד atipamezole intraperitoneally כדי לסייע העכבר ההתאוששות מן ההרדמה במהירות רבה יותר. לשים את העכבר לכלוב בודדים עד החלים לחלוטין. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

4. ייזום של אינדוקציה של קוצר ראייה ותחזוקה אחר כך

1. המתן לפחות 24 שעות לאחר הניתוח לשחרר את העכבר להתאושש לחלוטין מן ההרדמה. לאחוז את המקל והניח על המסגרות עם עדשות. לנוכח התמריץ מתחיל בנקודת זמן זו (איור 3b).
   הערה: כדי למזער את אי הנוחות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה ולתת מספיק זמן עבור מערכת דבק שיניים והקרשה, מומלץ לשים על המסגרת לאחר העכברים החלים לחלוטין מן ההרדמה. הבטון שרף של מערכת דבק יכסה במלואם את החתך של הקרקפת. לכן, אין טיפול לאחר ניתוח מיוחד דרוש למניעת זיהום, כאב לאחר ניתוח ameliorating. מיד אחרי הפעם הראשונה לשים על המסגרת, עכברים נגמר מודעת לקיומו של העדשה, לשרוט את זה הרבה. התנהגות דוחה יחזור לשגרה אחרי כמה שעות. ניתן לשמור העכברים עם עדשות עם צפיפות אותו לעכברים נורמלים.
2. להסיר את המסגרת ולנקות עדשות, עצות הציפורן עם ספוגיות כותנה לפחות פעמיים בשבוע כדי לשמור על השקיפות של העדשה.
   הערה: אין צורך לשים את העכבר בהרדמה עבור הסרת לשים על המסגרת. מספקים תמיכה עבור העכברים לשבת על, במקום אותם כאן בזמן עבודה עם אותם להפחית מצוקה.
   1. אם המדידה ביניים הכרחי, לשים את העכבר תחת הרדמה, למדוד את העכבר כאמור תיאר. לנוכח התמריץ ניתן המשיך אחרי העכבר מתאושש מההרדמה.
3. לנקות את הכלוב לפחות פעמיים בשבוע.
   הערה: זה יעזור לשמור על עדשות בהירות. לשים רשת בין העכבר בתחתית הכלוב כדי filtrate את שאריות האוכל שלהם עשוי גם להיות שימושי.
4. נטר את משקל הגוף וההתנהגות ברוטו. להשוות אותם עם אותו גיל עכברים שלא נגעו במהלך התהליך הניסויי לגמרי.
   הערה: מלבד כמה התנהגויות של גירוד, ללא שינוי משמעותי כולל את משקל הגוף נמצא בין עכברים בניסוי עם עכברים שלא טופלו.

תוצאות

At, בדוק תחילה אם כל החלקים הדרושים מוכנים (איור 1 א'). דוגמה של פיסת משקפיים שהורכב מוצג איור 1b. מלבד הגוף העיקרי של המסגרות, האגוז, כל החלקים האחרים הם חד פעמיים על העכבר כל ערכה של משקפיים שהושלם מוצג באיור 1 c. לשנות את הזווית ...

Discussion

כדי לוודא את המשקפיים כדי לתקן stably על הראש העכבר, מספר פעולות של פרוטוקול זה צריך לשלם תשומת לב רבה. קרום העצם להסירו לחלוטין לפני באמצעות מערכת דבק דנטלי. הדם על הגולגולת גם צריך לנקות בזהירות. בעת כוונון עדין קצת קבילה מייד לאחר היישום של הדבק, אל תזיז את המקל לעתים קרובות לפני שהמערכת דבק ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan