유도 및 실험적인 근 Murine 모델의 평가

요약

이 프로토콜에서 우리 실험 근 유도 사용 하 여 마우스에 새롭게 설계 된 안경, 눈 매개 변수 측정에 안정적이 고 재현 가능한 결과 달성 하기 위한 필요한 기술의 전체 과정을 설명 합니다.

초록

근 시의 murine 모델 비교적 쉬운 유전자 조작으로 인해 근 연구를 위한 강력한 도구를 수 있습니다. 동물에서 근 시를 유발 하는 한 가지 방법은 주 (유도 하는 렌즈 근 시 임) 눈 앞에서 렌즈 뺀 분명 넣어 하는 것입니다. 그러나, 유도 및 평가 대 한 현존 프로토콜 연구실 실험실에서 다릅니다. 여기, 우리가 새로 설계 하는 마우스를 사용 하 여에 임 안경 유도를 매우 실용적이 고 재현 가능한 방법을 설명 합니다. 방법 수정 하면서 마우스 눈 앞 안정적으로 렌즈 수 있습니다 국 소 또는 청소를 위해 이륙 하는 렌즈 관리 마약. 표현 형 강력 하 고 효율적 이며 분산 작습니다. 여기 설명 하는 방법은 마우스는 실험에 대 한 가능한 기간 연장 이유 후 바로 적용할 수 있습니다. 우리는 또한 준 기술 굴절 및 축 길이 측정에서 재현 가능한 결과 달성 하기 위한 조언. 우리 여기에서 설명 하는 단계별 프로토콜 희망과 상세한 기사 myopia 근 시 실험을 더 원활 하 게 수행 하 고 데이터 비교 연구소에서 연구원을 도울 수 있다.

서문

근 시의 보급 최근에 극적으로 증가 했다, 그것의 발병 및 진행의 메커니즘은 여전히 크게 unknow¹. 근 시의 가장 특징적인 표현 형의 축 길이 (알), 망막 합병증 이나 심지어 실명²에 대 한 위험 증가 신장 이다. 근 시의 병 인을 이해 하 고 효과적인 치료법을 개발에 강력한 근 시 동물 모델 및 안정적인 표현 형 평가 필요 하다.

짧게, 두 가지 방법을 유도 하는 동물에서 근 시 상태에 대 한 존재: 모양 박탈 근 시 (FDM)와 렌즈 유도 근 (임)³. 전 눈 앞 디퓨저를 장소 또는 근 표현 형에 따른 안구의 정상적인 발전을 좌우 하는 이미지를 보이지 않게 하기 위해 눈 꺼 풀 sutures. 렌즈는 망막 뒤에 초점을 이동 하는 눈 앞에 마이너스 후자의 장소. 망막 초점의 변화를 감지 하 고 망막 및 초점을 다시 맞추고 하 안구 elongates. FDM, 눈 꺼 풀 닫히거나 디퓨저, 눈 앞에서 수정 되었습니다 후 거의 추가 정비 필요 합니다. 임, 렌즈 투명 유지 하기 위해 청소를 위해 이륙 해야 합니다. 따라서, FDM 기술적으로 유도를 상대적으로 쉽습니다. 그러나, FDM과 임의 메커니즘은 서로 다른, 그리고 어떤 방법을 모방한 인간의 근 시 더 나은 아직 논쟁³. 임의 장점 중 하나는 마우스⁴의 경우 적어도 FDM, 비해 강한 표현 형.

근 시 유도에 사용 된 동물 등 여자⁵, 원숭이⁶, 트리 shrews⁷, 기니 돼지⁸, 마우스⁴. 유전자 조작, 풍부한 제공 항 체, 그리고 번 식에 대 한 낮은 비용의 가능성을 고려 하면 쥐 되었을 수 있습니다 첫 번째 선택 myopia의 동물 모델. 그러나, 다른 더 큰 동물에 비해, 렌즈 또는 마우스 눈 앞 디퓨저 수정은 상대적으로 젊은 마우스 오른쪽 등 특히 어려운 이유 후. 국 소 의약품 안전 청 또는 여러 중간 아이 측정을 필요로 하는 실험, 이동식 수 프레임에 필요한 이기도 합니다. 또 다른 도전은 정교한 기술 및 평가 하는 장치는 마우스 안구의 작은 형태학 변화 이다. 날짜 하려면, 다른 유도 및 다른 연구 팀에서 사용 되는 프로토콜을 측정 그것은 어렵게 만들 비교 하 고 결과 반복 하 여 실험실에서. 세부 표준 프로토콜은 필요 합니다.

이전 작품 렌즈 또는 확산 기⁹,¹⁰ 및 머리 거치가 글 프레임^11,12바느질을 붙이는 등 마우스 눈 앞에서 해결 하기 위해 여러 방법을 설명 합니다. 쥐에 강력 하 고 효율적인 실험 근 시 유도 위한 ameliorated 프로토콜을 개발 하기 위해 우리의 새롭게 설계 된 프레임에 함께 존재가 글 헤드 장착 기술^11,12,13 하 고. 프로토콜은 출생 후 하루 21 (p21) 이유 직후 젊은 쥐에 적용할 수 있습니다. 우리는 또한 고기 굴절 등 알의 안정적이 고 정확한 평가 위해 프로세스를 최적화 합니다. 우리는이 표준화 된 프로토콜 근 쥐 근 시 연구에 대 한 더 쉽게 접근할 수 있는 모델을 만들 수 있습니다 바랍니다.

프로토콜

모든 절차는 게이오 대학의 학부의 동물 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 ARVO 문을 안과 및 비전 연구, 동물 실험에서 게이오에 기관 지침에 동물의 사용에 대 한 준수 대학, 그리고 동물 연구: 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 보고의 Vivo 실험 (도착) 지침.

1. 쥐에 대 한 안경 조립

1. 안경 (그림 1a) 조립에 필요한 부품을 준비 합니다. 각 마우스에 대 한 모든 다음 준비: 머리 거치 한 나일론 스틱, 하나 더 높은 및 1 낮은 티타늄 프레임, 실험, 10 m m의 길이와 M1.4 크기 나사 하나, M1.4 크기 나사 한 너트, 하나의 일반의 목적에 따라 적절 한 능력을 가진 두 개의 렌즈 0.3 m m의 두께와 M1.4 크기 나사 세탁기 그리고 2 개의 인공 손톱 팁 (테이블의 자료).
   참고: 프레임의 두 가지 서로 다른 높이와 존재. 1 마우스에 대 한 높은 프레임 및 낮은 프레임 집합으로 사용 됩니다. 높은 프레임 비전 필드 대칭 수 있도록 낮은 사람 위에 넣어 되어야 합니다. 프레임과 렌즈는 특별히 설계 및 저자의 연구 그룹에 의해 제조. 이러한이 문서의 해당 저자에 연락 하 여 사용할 수 있습니다. 다른 부분 소매 도구 상점에서 찾을 수 있습니다.
2. 별도로 오른쪽과 왼쪽 눈에 대 한 프레임을 조립 한다.
   1. 최고의 보호 효과 달성 하기 위해 외부 방향으로 얼굴을 손톱 끝을 정렬 합니다. 손톱 팁과 마우스 비전 필드 (그림 1b) 마스킹 피하려고 약 130 ° 되도록 프레임 사이의 각도 조정 합니다. 인공 손톱 팁 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 프레임을 준수 합니다.
      참고: 손톱 팁 마우스에 의해 긁힘을 렌즈를 보호 하기 위해 도울 수 있다. 손톱 끝의 방향 반대 해야 높은 프레임과 하단 프레임은 오른쪽 눈과 왼쪽된 눈 각각 사용 하기 때문에.
   2. 적어도 12 h 건조, 다음 사용 하 여 손톱 깎기는 손톱의 모양을 조정 하는 접착제를 위한 대기 팁 절단과 트리밍에 의해 1 cm × 1 cm에 대 한 것.
   3. Cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 프레임에 렌즈를 준수 합니다. 프레임에 렌즈를 넣어 손으로 누르고 프레임 가로. 렌즈의 가장자리에서 cyanoacrylate 접착제를 주입 하 고 표면 장력에 의해 접착제 확산.
      참고: 접착제 것 이다 침식 렌즈의 투명도 영향을 미칠, 그래서 접착제는 렌즈의 주변 부분에만 지 다는 것을 확인. 사용 0 디 옵 터 (D) 렌즈 렌즈 제어 및 근 시를 유발 하는 렌즈 빼기. 렌즈 (–50 D에 –10 D) 마이너스의 다른 힘의 효과 있다⁴설명 되어. 근 시 유도 최대화 하기 위해 –30 D 렌즈 근 시 유도 대 한는 것이 좋습니다. FDM 1.5 mL microtube 디퓨저로의 뚜껑에 렌즈를 변경 하면 동일한 장치와 유도 될 수 있다.
3. 막대기의 편평한 측에서 세탁기와 함께 나일론 막대기에 나사를 조입니다. 안경 및 실험 전에 막대기를 각각 준비 하 고 더 사용 (그림 1c)에 대 한 재고.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

2. 굴절 및 알 기준선의 측량.

1. Mydriatic 에이전트 5 mg/mL tropicamide 및 안구의 각 측에 5 mg/mL phenylephrine 염 산 염을 포함 하는 눈동자를 팽창의 한 방울을 적용 합니다. 전신 마 취 전에 적어도 5 분 기다립니다.
   참고: 일반 눈동자 팽창 마 취 이후에 측정을 좌우 하는 가역 백 내장을 일으킬 것입니다. 항상 일반 마 취 전에 눈동자를 팽창 하 고 적어도 5 분 기다립니다. Mydriatic 에이전트의 한 방울 (약 0.05 mL) 더 많은 에이전트는 다음 단계를 해 할 것입니다 하는 동안 마우스 눈의 눈동자를 dilating 충분 하다.
2. 전신 마 취 아래 마우스를 넣어. 부드럽게 완전히 anaesthetized 때까지 그것의 눈을 지원 해주에서 마우스를 유지 하는 마우스의 뒤로 피부 파악. 충분할 때 그것은 테이블에 자유롭게 마우스 주위에 이동 하지 않습니다 경우에 전신 마 취의 깊이 판단 한다.
   참고: 조합의 midazolam (40 μ g/100 μ), medetomidine (7.5 μ g/100 μ) butorphanol 주석산 (50 μ g/100 μ)는 여기 쥐 0.01 mL/g 복 주사의 볼륨에 대 한 일반적인 마 취에 대 한 사용 됩니다. 일반적으로, 5 분 미만 잠들 마우스 필요 합니다. 전신 마 취의 장시간 낮은 체온 및 느린 심장 박동을 발생합니다. 전신 마 취 제 주사 후 10 분 이내 모두 측정을 마무리 하는 측정에의 잠재적인 영향을 피하기 위해 하는 것이 좋습니다. 마 취 칵테일에 butorphanol 진통의 약 4 시간을 제공 합니다. 전신 마 취에 대 한 적절 한 조리법은 기관에 의해 다른 수 있습니다.
3. 적외선 photorefractor^4,,914를 사용 하 여 마우스 눈의 굴절을 측정 합니다. 눈동자의 센터에서 첫 번째 Purkinje 이미지를 유지 하 고 굴절 광학 축 따라 측정을 마우스 눈의 방향을 조정 합니다. 측정 후 같은 절차 (그림 2a)와 반대 눈을 측정 합니다.
   참고: 굴절에 대 한 측정 값은 광학 축을 따라 마우스의 위치에 의해 강하게 좌우 된다. 첫 번째 Purkinje 이미지 눈동자의 중앙에서 ± 3도 내 맞춤 확인 하십시오. 굴절 측정⁴에 있는 눈동자의 방향으로의 미세 조정에 대 한 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 시스템의 작업 대를 사용할 수 있습니다.
4. SD-10 월 시스템^4,,1516를 사용 하 여 마우스 눈의 알을 측정 합니다. 광학 신경 (그림 2b) 근처 밝은 경계에 각 막 정점에서 거리로 알을 정의 합니다.
   참고: 유사한 굴절의 측정으로, 알은 강하게 영향을 마우스 눈의 방향으로. 각 막 정점 각 막의 표면에 점 모양의 반사에 의해 확인할 수 있습니다. 망막의 경계는 매우 광학 신경 순간 헷갈리는 될 것입니다. 방향 측정을 위해 충분히 명확 하지만 광학 신경에서 너무 멀리 경계를 조금 조정 합니다.

3. 마우스 두개골에 프레임 고정.

1. 각 눈에 건조를 방지 하기 위해 0.1% 정화 나트륨 hyaluronate 눈 방울 한 방울을 적용 합니다.
   참고: 눈 방울 눈 표면에서 굴절 및 축 길이 측정의 가치를 좌우할 것 이다. 모든 측정 할 때까지 마 취 후 눈 방울을 사용 하지 마십시오.
2. 찰 흙의 사면에 마 취 마우스의 턱을 넣어 또는 아무것도 두개골의 초기 비행기를 만들기 위해 베개 가로 수로 사용할 수 있습니다.
3. 머리를 소독 하 고 귀와 눈을 70% 에탄올과 면봉을 사용 하 여 두 피.
4. 귀와 눈을 위한 두개골 수술가 위 핀셋을 사용 하 여 0.8 c m² 에 대 한 노출 사이의 피부를 잘라. 치과 에칭 액체 및 면 면봉을 사용 하 여 여과 제거. 수술가 위, 핀셋 각 마우스의 수술 전에 70% 에탄올 소독.
   참고: 클리핑 머리 하 고 멸 균 장갑을 착용 해야 합니다.  이 절차를이 수행 하기 전에 관련 동물 보호 위원회의 규정을 확인 하십시오. 대부분의 경우, 자체 치료 치과 접착제 시스템에 첨부 파일 중 하나로 치과 에칭 액체를 찾을 수 있습니다. 치과 에칭 액체를 사용할 수 없는 경우 대신 70% 에탄올을 사용 합니다.
5. 올바른 위치에 메모리를 수정할 수 있도록 렌즈 없이 프레임 세트를 조립 한다. 마우스 머리에 프레임을 넣어. 조심 스럽게 빈 프레임 중간에 두 눈은 되도록 프레임의 위치를 조정 합니다.
6. 자기 치료 치과 접착제 시스템을 사용 하 여 연결 마우스 머리에 스틱. 수 마우스 눈에 adhere 시스템 흐름의 액체를 하도록 하지 않도록 주의.
   참고: 자체 치료 치과 접착제 시스템을 사용 하기 위한 방법을 제품 사이 다르다. 신중 하 게 지시를 참조 하십시오.
   주의: 일부 치과 접착제 시스템에 시 약의 독성이 있을 수 있습니다.
7. 약 5 분을 기다립니다 고 프레임과 너트에서 신중 하 게 스틱 (그림 3a)의 위치를 변경 하지 않고.
8. Intraperitoneally 수 있도록 마우스 마 취에서 회복을 더 빠르게 0.75 mg/kg atipamezole 염 산 염 주사. 으로 개별 완전히 복구 될 때까지 마우스를 넣어. 두지 마십시오 마우스 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.

4. 근 시 유도 및 나중에 유지 보수 개시

1. 마우스 마 취에서 완전히 복구할 수 있도록 수술 후 적어도 24 시간을 기다립니다. 지팡이 잡고 하 고 렌즈와 프레임에 넣어. 유치는이 시간 포인트 (그림 3b)에서 시작 됩니다.
   참고: 마 취에서 회복 하는 동안 불편을 최소화 하 고 치과 접착제 시스템 응고에 대 한 충분 한 시간을 주고, 그것은 좋습니다 쥐 완전히 마 취에서 회복 후 프레임에 넣어. 수 지 시멘트 접착 시스템의 완전히 두 피 컷을 다룰 것입니다. 따라서, 구체적인 수술 후 치료 필요 감염을 방지 하 고 수술 후 통증 장황 합니다. 프레임에 처음으로 후 바로 마우스 끝날 렌즈의 존재를 의식 하 고 그것을 많이 긁어. 총 동작 몇 시간 후 정상으로 다시 것입니다. 정상적인 쥐에 동일한 밀도와 렌즈와 마우스를 보관할 수 있습니다.
2. 프레임을 제거 하 고 청소 렌즈와 손톱 팁 면봉으로 적어도 일주일에 두 번 렌즈의 투명도 유지 하기 위해.
   참고: 그것는 마 취를 제거 하 고 프레임에 대 한 마우스를 넣어 필요가 없습니다. 고통을 줄일 수 있습니다 그들과 함께 작업 하는 동안 걸어 그들을 않고 앉아 쥐에 대 한 지원을 제공 합니다.
   1. 임시 측정은 필요한 경우, 마 취에서 마우스를 넣어 하 고 앞에서 설명한 마우스를 측정 한다. 유치는 마우스 마 취에서 회복 후 계속 될 수 있다.
3. 일주일에 두 번 이상 감 금 소를 청소.
   참고: 렌즈 선명도 유지 하는 것이 도움이 됩니다. 사이의 마우스 케이지 음식 찌 꺼 기를 여과 하는 그물을 퍼 팅도 도움이 될 수 있습니다.
4. 몸 무게와 총 동작을 모니터링 합니다. 비교와 같은 그들 전체 실험 과정에서 훼손 되지 않은 쥐 나이.
   참고: 일부 긁 동작을 제외 하 고 몸 무게를 포함 한 중요 한 변화가 치료 쥐 실험 생쥐 사이 발견 된다.

결과

에 먼저, 모든 필요한 부품 (그림 1a) 준비 하는 경우 확인 합니다. 조립된 안경의 작품의 예는 그림 1b에서 표시 됩니다. 프레임과 너트의 본체를 제외한 모든 다른 부품은 각 마우스에 대 한 일회용입니다. 완성 된 안경의 집합 그림 1 c에 표시 됩니다. 다른 연령대와 마우스에 맞게 두 프레임 사이의 각도 ?...

토론

있는지 확인 하려면 마우스 머리에 안정적으로 고정 될 안경,이 프로토콜의 여러 단계 큰 관심을 지불 될 필요가 있다. 과 치과 접착제 시스템을 사용 하기 전에 완전히 제거 되어야 합니다. 두개골에 피는 또한 주의 정리 될 필요가 있다. 약간 미세 하 게 조정 하는 것은 직후에 접착제의 응용 프로그램 허용, 접착 시스템을 건조 하기 전에 자주 메모리를 이동 하지 마십시오. 신중 하 게, 접착 시스...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan