Aplicación y evaluación de un modelo murino de miopía Experimental

Resumen

En este protocolo, describimos el proceso completo de gafas de inducción en ratones usando nuevo diseñada experimental de miopía y la técnica necesaria para el logro de resultados estables y reproducibles en las mediciones de parámetros oculares.

Resumen

Modelo murino de la miopía puede ser una poderosa herramienta para la investigación de la miopía debido a la relativamente fácil manipulación genética. Una forma de inducir miopía en animales es poner claro menos lentes al frente de los ojos durante semanas (inducida por la lente de miopía, LIM). Sin embargo, han conservado protocolos de inducción y evaluación varían de laboratorio a laboratorio. Aquí, describimos un método muy práctico y reproducible para inducir anteojos LIM en ratones con nuevo diseñada. Las correcciones del método el objetivo estable frente a los ojos de ratón mientras que permite la lente a quitarse para la limpieza o tópico drogas administración. El fenotipo es robusto y eficiente, y la varianza es pequeña. El método aquí descrito puede aplicarse a los ratones justo después del destete que extiende la duración posible para los experimentos. También dimos técnica aconseja para lograr resultados reproducibles en refracción y medición de longitud axial. Esperamos el protocolo paso a paso descrito aquí y el artículo detallado puede ayudar a los investigadores a realizar experimentos de miopía con miopía más suavemente y hacer los datos comparables entre laboratorios.

Introducción

La prevalencia de la miopía ha aumentado drásticamente recientemente, mientras que el mecanismo de su aparición y la progresión son todavía en gran parte desconocido¹. El fenotipo más característico de la miopía es el alargamiento de la longitud axial (AL), que aumenta el riesgo de complicaciones retinianas o incluso ceguera². Para mejor comprender la patogénesis de la miopía y desarrollar tratamientos eficaces, robustos modelos animales miopes y evaluación del fenotipo estable son necesarios.

Brevemente, existen dos métodos para inducir estados miopes en animales: forma privación miopía (FDM) y miopía inducida por la lente (LIM)³. El primero coloca difusores delante de los ojos o suturas de los párpados para ocultar la imagen, que influye en el desarrollo normal del globo ocular, resultando en un fenotipo de miopía. Los últimos lugares menos lentes delante del ojo para mover el punto focal detrás de la retina. La retina detecta el cambio del foco y alarga el globo ocular para realinear la retina y el punto focal. FDM, después de que el párpado se cierra o se ha solucionado el difusor delante del ojo, casi ningún tipo de mantenimiento adicional es necesario. Para LIM, el objetivo debe quitarse para la limpieza para mantener transparente. Así, es relativamente fácil inducir técnicamente FDM. Sin embargo, los mecanismos de la FDM y LIM son diferentes, y el mejor método que imita la miopía en humanos sigue siendo objeto de debate³. Uno de los puntos fuertes de LIM es el fenotipo más fuerte en comparación con FDM, por lo menos en el caso de ratones⁴.

Animales que se han utilizado para inducir la miopía incluyen pollos⁵, monos⁶, las musarañas de árbol⁷, conejillos de Indias⁸y ratones⁴. Teniendo en cuenta la posibilidad de manipulación genética, abundantes anticuerpos disponibles y bajo costo para la cría de ratones podrían haber sido la primera opción como el modelo animal de la miopía. Sin embargo, en comparación con otros animales más grandes, fijación de lentes o difusores delante de los ojos de ratón es relativamente difícil especialmente para los jóvenes ratones como derecho después del destete. Para los experimentos que necesitan la administración de medicamentos tópicos o múltiples medidas provisionales ojo, también es necesario para el marco a ser extraíble. Otro reto es el cambio morfológico pequeño del globo del ojo de ratón, que requiere sofisticadas técnicas y dispositivos para evaluar. Hasta la fecha, induciendo diferentes y protocolos utilizados en equipos de investigación diferentes de medición hacen difícil comparar y repetir los resultados a través de laboratorios. Es necesario un protocolo estándar con detalles.

Trabajos anteriores describen varios métodos para fijar lentes o difusores delante del ojo de ratón, como pegar⁹, costura¹⁰ y montado en la cabeza los anteojos marco^11,12. Combinamos gafas montado en la cabeza existen técnicas^11,12,13 con nuestro marco de nuevo diseño para el desarrollo de un protocolo ameliorated para inducir miopía experimental robusta y eficaz en ratones. El protocolo se puede aplicar a ratones jóvenes pronto después del destete en el día postnatal 21 (p21). También hemos optimizado los procesos para la evaluación precisa y estable de fenotipos como la refracción y AL. Esperamos que este protocolo estandarizado puede ayudar a hacer ratones miopes un modelo más accesible para la investigación de la miopía.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética en investigación Animal de la Facultad de medicina de la Universidad de Keio se adhirió a la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de visión, las directrices institucionales sobre animales de experimentación en Keio Universidad y la investigación Animal: informes de en Vivo experimentos (llegar) directrices para el uso de animales en investigación.

1. montaje de los anteojos para ratones

1. Preparación de piezas necesarias para montar las gafas (Figura 1a). Para cada ratón, prepare los siguientes: marco de nylon de montado en la cabeza un palo, uno mayor y un titanio inferior, dos lentes con poderes apropiados según el propósito del experimento, un tornillo de tamaño M1.4 con una longitud de 10 mm, una tuerca para tornillo de tamaño M1.4, una llanura arandela para tornillo de tamaño M1.4 con el espesor de 0,3 mm y dos puntas de uñas artificiales (Tabla de materiales).
   Nota: Dos clases de Marcos existen con diferentes alturas. Para un ratón, un marco superior y uno inferior se utilizan como un conjunto. Marcos mayor deben colocarse por encima de los inferiores para hacer el campo de visión simétrico. Y lentes están especialmente diseñadas y fabricadas por el grupo de investigación de los autores. Estos están disponibles contactando a los autores correspondientes de este artículo. Otras partes pueden encontrarse en tiendas de herramienta.
2. Montar el cuadro para el ojo izquierdo y derecho por separado.
   1. Coloque la punta de la uña hacia la dirección externa para lograr el mejor efecto protector. Ajuste el ángulo entre la punta de la uña y el marco de unos 130 ° para evitar enmascarar el campo de visión del ratón (Figura 1b). Se adhieren a las puntas de uñas artificiales con pegamento de cianoacrilato al armazón.
      Nota: Consejos de uñas pueden ayudar a proteger el objetivo de ser rayado por el ratón. La dirección de las puntas de uña debe ser opuesta porque el marco superior y el inferior se utilizan para el ojo derecho y ojo izquierdo, respectivamente.
   2. Espere al menos 12 h que permita que el adhesivo seque completamente, luego use un cortauñas para ajustar la forma de la uña para que sobre 1 cm x 1 cm, cortando y recortando.
   3. Se adhieren a la lente al marco con pegamento de cianocrilato. Poner la lente en el armazón a mano y sosténgalo horizontalmente. Inyecte el adhesivo de cianoacrilato del borde de la lente y dejar que la extensión adhesiva por tensión superficial.
      Nota: El adhesivo se erosionan la lente e influir en su transparencia, así que asegúrese de que el adhesivo toque sólo la parte periférica de la lente. Utilice lentes de plano 0 dioptrías (D) como control y menos objetivo inducir miopía. El efecto de diferentes potencias de menos lentes (–10 D a –50 D) ha sido descrito en otra parte⁴. Para maximizar la inducción de miopía, lente D-30 se recomienda para la inducción de miopía. FDM también puede ser inducido con el mismo dispositivo simplemente cambiando la lente en la cápsula de microtubos de 1,5 mL como el difusor.
3. Apriete el tornillo en la palanca de nylon junto a la lavadora desde la cara plana del palo. Preparar las gafas y los palos antes del experimento respectivamente y almacenar para su uso posterior (figura 1 c).
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.

2. medición de la refracción y AL base.

1. Aplique una gota de agente midriático que contiene 5 mg/mL tropicamida y clorhidrato de fenilefrina 5 mg/mL en cada lado del globo ocular para dilatar a la pupila. Espere al menos 5 min antes de anestesia general.
   Nota: Se dilatan la pupila debajo del general anestesia puede causar catarata reversible que influye en la medición después. Dilatar a la pupila antes de anestesia general, espere al menos 5 minutos siempre. Una gota (aproximadamente 0,05 mL) de agente midriático es suficiente para dilatar a la pupila del ojo de ratón, mientras más agente hará ninguÌ n daño a los siguientes pasos.
2. Ponga el ratón bajo anestesia general. Sujete la piel posterior del ratón suavemente para evitar que el ratón golpear su ojo hasta que es anestesiado completamente. Juzgar la profundidad de la anestesia general sea suficiente si el ratón no se mueve alrededor de cuando se pone en la mesa libre.
   Nota: Una combinación de midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) y el tartrato de butorfanol (50 μg/100 μL) se utiliza aquí para la anestesia general para los ratones con un volumen de inyección intraperitoneal de 0.01 mL/g. Por lo general, menos de 5 minutos se necesitan para que ratones para dormirse. Tiempo de la anestesia general causa la baja temperatura corporal y ritmo cardíaco lento. Para evitar la posible influencia de la anestesia general a la medida, acabado todas las mediciones dentro de 10 minutos después de la inyección del anestésico se recomienda. El butorfanol en el cóctel de anestésico proporcionan aproximadamente 4 horas de analgesia. Una receta adecuada para la anestesia general puede diferentes instituciones.
3. Medir la refracción del ojo de ratón con un photorefractor infrarrojo^4,9,14. Ajustar la dirección de uno de los ojos de ratón para mantener la primera imagen de Purkinje en el centro de la pupila y medir la refracción del eje óptico. Después de la medición, medir el ojo opuesto con los mismos procedimientos (Figura 2a).
   Nota: El valor medido para la refracción está fuertemente influenciado por la posición de los ojos de ratón a lo largo del eje óptico. Asegúrese de que la primera imagen de Purkinje está alineada dentro de ±3 grados desde el centro de la pupila. La mesa de trabajo del sistema de (SD-OCT) la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral puede utilizarse para el ajuste fino de la dirección de la pupila en la refracción las medidas⁴.
4. Medir del ojo de ratón utilizando un sistema de SD-OCT^4,15,16. AL se define como la distancia entre el vértice corneal y el límite más brillante cerca del nervio óptico (figura 2b).
   Nota: Similar con la medición de la refracción, AL está fuertemente influenciado por la dirección del ojo de ratón. El vértice corneal puede confirmarse por la reflexión como punto sobre la superficie de la córnea. El límite de la parte de retina será muy nebuloso en el punto del nervio óptico. Ajuste la dirección un poco para que el límite sea lo suficientemente clara para medir pero no demasiado lejos del nervio óptico.

3. fijación del marco en el cráneo de ratón.

1. Aplique una gota de 0.1% purificada Sodio Hialuronato colirio para evitar sequedad en cada ojo.
   Nota: Gota del ojo en la superficie del ojo influirán en los valores de refracción y medición de longitud axial. No utilice el colirio después de la anestesia hasta que se realicen todas las mediciones.
2. Colocar la barbilla del ratón anestesiado en una cuesta de barro o cualquier cosa puede ser utilizado como una almohada para hacer el plano inicial del cráneo sea horizontal.
3. Esterilizar el cabello y cuero cabelludo entre los oídos y los ojos con el bastoncillo con etanol al 70%.
4. Cortar la piel entre los oídos y los ojos para exponer el cráneo de cerca de 0,8 cm² utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas. Uso grabado dental líquido y algodón torunda para retirar el periostio. Esterilizar las tijeras quirúrgicas y pinzas con etanol al 70% antes de la cirugía de cada ratón.
   Nota: Recorte el pelo y guantes estériles pueden ser necesarios.  Revise las disposiciones del Comité de cuidado de los animales correspondientes antes de este procedimiento. En la mayoría de los casos, el líquido de grabado dental puede encontrarse como uno de los accesorios en el sistema adhesivo dental autocurable. Si el líquido de grabado dental no está disponible, usar etanol al 70%.
5. Montar un conjunto de fotogramas sin lente para ayudar a fijar la palanca en la posición correcta. Colocar los cuadros en la cabeza de ratón. Ajuste cuidadosamente la posición de los marcos para asegurarse de que ambos ojos están en el marco vacío.
6. Utilizar un sistema adhesivo dental autocurable para sujetar el palo en la cabeza del ratón. Tenga cuidado de no dejar que el líquido del flujo sistema adhiera en el ojo de ratón.
   Nota: El método de uso del sistema adhesivo dental autocurado es diferente entre los productos. Consulte las instrucciones cuidadosamente.
   PRECAUCIÓN: Algunos de los reactivos en el sistema adhesivo dental pueden ser tóxicos.
7. Espere unos 5 minutos y sacar el marco y la tuerca con cuidado sin cambiar la posición de la palanca (figura 3a).
8. Inyección el clorhidrato de atipamezole de 0,75 mg/kg por vía intraperitoneal para el ratón a la recuperación de la anestesia más rápidamente. Coloque el ratón en una jaula individual hasta que se recuperó completamente. No descuide el ratón hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. El protocolo puede hacer una pausa aquí.

4. iniciación de la inducción de miopía y luego el mantenimiento

1. Espere al menos 24 h después de la cirugía para dejar que el ratón se recuperan de la anestesia por completo. Agarrar el palillo y poner en los marcos de lentes. El estímulo comienza en este momento (figura 3b).
   Nota: Para minimizar las molestias durante la recuperación de la anestesia y dar tiempo suficiente para que el sistema adhesivo dental coagular, se recomienda encarecidamente poner en el bastidor después los ratones completamente recuperaron de la anestesia. El cemento de resina del sistema adhesivo cubrirá completamente el corte del cuero cabelludo. Por lo tanto, se necesita ningún tratamiento post quirúrgico específico para la prevención de la infección y aliviar dolor post-quirúrgico. Después de la primera vez de poner en el marco de ratones serán más consciente de la existencia de la lente y rayar mucho. El comportamiento bruto será volver a la normalidad después de unas horas. Los ratones con lentes pueden conservarse con la misma densidad que los ratones normales.
2. Retire el marco y limpiar las lentes y los consejos de la uña con algodón al menos dos veces a la semana para mantener la transparencia de la lente.
   Nota: No es necesario poner el ratón bajo anestesia para quitar y poner en el marco. Apoyar a los ratones para sentarse, en lugar de tenerlos mientras trabaja con ellos podría reducir la angustia.
   1. Si una medida provisional es necesaria, ponga el ratón bajo anestesia y medir el ratón como se describió anteriormente. El estímulo puede ser continuado después del recuperación de la anestesia del ratón.
3. Limpiar la jaula al menos dos veces a la semana.
   Nota: Esta ayuda a mantener la claridad de la lente. Poner una red entre el ratón y el fondo de la jaula para filtrar los restos de comida también puede ser útil.
4. Controlar el peso corporal y el comportamiento bruto. Comparar con la misma edad sin tocar ratones durante el proceso todo experimental.
   Nota: Salvo algunos comportamientos rascarse, cambios significativos, incluyendo el peso del cuerpo no se encuentran entre ratones de experimento con los ratones no tratados.

Resultados

En primer lugar, compruebe si todas las piezas están preparadas (Figura 1a). En la Figura 1bse muestra un ejemplo de un pedazo de anteojos montados. Excepto el cuerpo principal de los marcos y la tuerca, todas las demás partes son desechables para cada ratón. Un conjunto de lentes completadas se muestra en la figura 1C. Cambiar el ángulo entre los dos bastidores para el ratón con diferentes edad...

Discusión

Para asegurarse de que las gafas de fijación estable de la cabeza de ratón, varios pasos en este protocolo deben prestarse gran atención. El periostio debe eliminarse completamente antes de usar el sistema adhesivo dental. La sangre en el cráneo también deben limpiarse con cuidado. Mientras que una pequeña puesta a punto es aceptable después de la aplicación del adhesivo, no mueva el palo con frecuencia ante el sistema de adhesivo seco para arriba. Siga las instrucciones del sistema adhesivo cuidadosamente, espec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan