Anreiz und Auswertung von einem Mausmodell der experimentellen Myopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den gesamten Prozess der experimentellen Myopie Anreiz bei Mäusen mit neu gestalteten Brillen und die Technik für stabile und reproduzierbare Ergebnisse bei okulären Parameter Messungen benötigt.

Zusammenfassung

Mausmodell der Myopie kann ein mächtiges Werkzeug für die Erforschung der Myopie aufgrund der vergleichsweise einfachen genetischen Manipulation sein. Ein Weg, Myopie bei Tieren zu induzieren soll klare minus Linsen vor Augen für Wochen (Objektiv-induzierte Myopie, LIM) setzen. Allerdings variieren die erhaltenen Protokolle für Anreiz und Bewertung von Labor zu Labor. Wir hier eine äußerst praktische und reproduzierbare Methode zur LIM bei Mäusen mit neu gestalteten Brillen zu induzieren. Die Methode-Fixes Objektiv stabil vor der Maus Auge während die Linse zu Reinigungszwecken oder topische abgenommen werden kann drug Administration. Der Phänotyp ist robust und effizient, und die Varianz ist klein. Die hier beschriebene Methode kann direkt nach dem Absetzen die erstreckt sich der möglichen Dauer für Experimente auf Mäusen angewendet werden. Wir gaben auch technisch berät für reproduzierbare Resultate in Refraktion und axiale Längenmessungen. Wir hoffen die hier beschriebene Schritt für Schritt Protokoll und der detaillierte Artikel kann Forscher Myopie Experimente mit Myopie mehr reibungslos durchführen und die Daten über Labors vergleichbar zu machen.

Einleitung

Die Prävalenz der Myopie ist vor kurzem drastisch angestiegen, während der Mechanismus seiner Entstehung und Progression sind noch weitgehend unbekannter¹. Der charakteristischste Phänotyp der Myopie ist die Verlängerung der axialen Länge (AL), das Risiko für Netzhautablösung Komplikationen oder sogar Blindheit²erhöht. Um besser zu verstehen die Pathogenese der Myopie und wirksame Therapien zu entwickeln, sind robuste kurzsichtigen Tiermodelle und stabile Phänotyp Bewertung notwendig.

Kurz gesagt, gibt es zwei Methoden zur Induktion kurzsichtiger Staaten bei Tieren: Form-Deprivation Myopie (FDM) und Objektiv-induzierte Myopie (LIM)³. Ersteres setzt Diffusoren vor dem Auge oder Nähte das Augenlid um das Bild undeutlich zu machen, das die normale Entwicklung des Augapfels, was zu einer Kurzsichtigkeit Phänotyp beeinflusst. Die letzteren Plätze minus Linsen vor dem Auge, der Brennpunkt hinter der Netzhaut zu bewegen. Die Netzhaut erkennt die Verschiebung des Fokus und verlängert den Augapfel um die Netzhaut und Brennpunkt auszurichten. Für FDM ist nach das Augenlid geschlossen oder der Diffusor vor dem Auge korrigiert wurde fast keine weitere Pflege erforderlich. Für LIM muss das Objektiv abgenommen werden, für die Reinigung um es transparent zu halten. FDM ist somit relativ einfach technisch induziert werden. Allerdings unterscheiden sich die Mechanismen der FDM und LIM, und welche Methode ahmt die Kurzsichtigkeit in der menschlichen besser ist noch in der Diskussion³. Eine der Stärken von LIM ist die stärkere Phänotyp im Vergleich mit FDM, zumindest bei Mäusen⁴.

Tiere, die zur Induktion Myopie verwendet wurden sind Küken⁵, Affen⁶, Spitzhörnchen⁷, Meerschweinchen⁸und Mäuse⁴. In Anbetracht der Möglichkeit, Genmanipulation, reichlich verfügbaren Antikörper und niedrige Kosten für die Zucht hätte Mäuse die erste Wahl als Tiermodell der Myopie. Ist jedoch im Vergleich mit anderen größeren Tieren, Befestigung, Linsen oder Diffusoren vor der Maus Auge relativ schwierig, vor allem für junge Mäuse wie Recht nach dem absetzen. Für die Experimente, die aktuelle Drug Administration oder Mehrfachmessung interim Auge benötigen, ist es auch notwendig für den Rahmen abnehmbar. Eine weitere Herausforderung ist die kleine morphologische Veränderung der Maus Augapfel, die ausgefeilte Technik und Geräte zu bewerten. Bis heute machen verschiedene induzieren und Messung in verschiedenen Forschungsteams verwendeten Protokolle es schwer zu vergleichen und die Ergebnisse in Labors zu wiederholen. Ein Standardprotokoll mit Details ist erforderlich.

Frühere Werken beschrieb mehrere Methoden zur Behebung Linsen oder Diffusoren vor der Maus Auge, z. B.⁹,¹⁰ und Goggle Head mounted Frame^11,12Heften kleben. Wir kombinieren Exist Head mounted Goggle Technik^11,12,13 mit unserem neu gestalteten Rahmen, um eine verbesserte Protokoll zur Induktion robust und effizient experimentelle Myopie bei Mäusen zu entwickeln. Das Protokoll kann den jungen Mäusen bald nach dem Absetzen auf postnatale Tag 21 (p21) angewendet werden. Wir haben auch die Prozesse für stabile und präzise Auswertung der Phänotypen einschließlich der Brechung und AL optimiert. Wir hoffen, diese standardisierte Protokoll dazu beitragen kann, kurzsichtigen Mäuse für Kurzsichtigkeit Forschung leichter zugänglich machen.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission auf Animal Research von der Keio University School of Medicine genehmigt die ARVO-Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research, die institutionellen Richtlinien auf Tier-Experimente im Keio eingehalten Universität und der Animal Research: Berichterstattung von In Vivo Experimente (Ankunft) Richtlinien für die Verwendung von Tieren in der Forschung.

1. Montage der Brillen für Mäuse

1. Bereiten Sie die erforderlichen Teile für die Montage der Brillen (Abbildung 1a). Für jede Maus bereiten alle wie folgt: ein Head mounted Nylon Stick, einer höheren und einer niedrigeren Titan Rahmen, zwei Objektive mit entsprechenden Befugnissen nach dem Zweck des Experiments, eine M1.4 Größe Schraube mit einer Länge von 10 mm, für M1.4 Größe Schraube eine Mutter, eine Ebene Unterlegscheibe für M1.4 Größe Schraube mit der Dicke von 0,3 mm und zwei künstlichen Fingernagel Spitzen (Table of Materials).
   Hinweis: Zwei Arten von Bildern mit unterschiedlichen Höhen vorhanden. Für eine Maus sind einem höheren Frame und einem Untergestell als Satz verwendet. Höheren Frames sollte über die niederen gelegt werden, um die Vision Felder symmetrisch zu machen. Fassungen und Gläser sind speziell entworfen und hergestellt von Autoren Research Group. Diese sind durch Kontaktaufnahme mit den entsprechenden Autoren dieses Artikels verfügbar. Andere Teile finden Sie im Einzelhandel-Tool.
2. Montieren Sie den Rahmen für das Rechte und linke Auge getrennt.
   1. Ordnen Sie die Fingernagel-Spitze stellen die äußere Richtung, um die beste Schutzwirkung zu erzielen. Stellen Sie den Winkel zwischen der Fingernagel-Spitze und dem Rahmen ca. 130° zu vermeiden, Maskierung der Maus Gesichtsfeld (Abbildung 1 b) sein. Halten Sie die künstlichen Fingernagel Spitzen am Rahmen mit Cyanacrylat-Klebstoff.
      Hinweis: Fingernagel Tipps können helfen, um das Objektiv vor Kratzern durch die Maus zu schützen. Die Richtung der Fingernagel Tipps muss entgegengesetzte sein weil die höheren und unteren Frame für das rechte Auge und das linke Auge bzw. verwendet werden.
   2. Warten Sie mindestens 12 h bis den Kleber vollständig, dann mit einem Nagelknipser können Sie die Form des Fingernagels anpassen trocknen lassen Tipps zu ca. 1 cm × 1 cm schneiden und trimmen.
   3. Halten Sie das Objektiv auf den Rahmen mit Cyanacrylat-Klebstoff. Setzen Sie das Objektiv auf den Rahmen von hand und halten Sie den Rahmen horizontal. Injizieren des Cyanacrylat-Klebstoffs vom Rand der Linse und lassen Sie die Klebstoffe Ausbreitung durch Oberflächenspannung.
      Hinweis: Der Klebstoff erodieren das Objektiv und beeinflussen seine Transparenz, so stellen Sie sicher, dass der Kleber berührt nur die peripheren Teil des Objektivs. Verwenden Sie 0 Dioptrien (D) Plano-Linse als Kontrolle und Minusglas, um Myopie zu induzieren. Die Wirkung der verschiedenen Potenzen der minus Linsen (–10 D, –50 D) wurde an anderer Stelle⁴beschrieben. Um den Anreiz der Myopie zu maximieren, empfiehlt sich – 30 D Objektiv zur Induktion Myopie. FDM kann auch mit dem gleichen Gerät induziert werden, indem Sie einfach das Objektiv in die Kappe von 1,5 mL Reaktionscup als Diffusor.
3. Ziehen Sie die Schraube in der Nylon-Stick zusammen mit der Scheibe von der flachen Seite des Stockes. Bereiten Sie die Brille und die Stöcke vor dem Experiment und Lager für den weiteren Einsatz (Abbildung 1 c).
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

(2) Messungen der Brechung und AL-Baseline.

1. Geben Sie einen Tropfen mydriatic Agent mit 5 mg/mL Tropicamid und 5 mg/mL Phenylephrin-Hydrochlorid auf jeder Seite des Augapfels, die Pupille zu erweitern. Warten Sie mindestens 5 min vor der Vollnarkose.
   Hinweis: Erweitern die Schüler unter Allgemeine Anästhesie wird dazu führen, dass reversible Katarakt, danach die Messung beeinflusst. Immer erweitern Sie die Schüler vor der Vollnarkose und warten Sie mindestens 5 min lang. Ein Tropfen (ca. 0,05 mL) des mydriatic Agenten genügt für die Pupille des Auges Maus, Dilatation, während weitere Agent nichts, die folgenden Schritte anhaben.
2. Setzen Sie die Maus unter Vollnarkose. Fassen Sie die hintere Haut der Maus sanft, halten die Maustaste aus seinem Auge stoßen, bis es vollständig betäubt ist. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose genug zu sein, wenn die Maus nicht bewegt um wenn sie frei auf den Tisch gelegt wird.
   Hinweis: Eine Kombination von Midazolam (40 μg/100 μL), Medetomidine (7,5 μg/100 μl) und Butorphanol Tartrat (50 μg/100 μl) wird hier für die Vollnarkose für Mäuse mit einem Volumen von 0,01 mL/g intraperitoneale Injektion verwendet. In der Regel werden weniger als 5 min für Mäuse zum Einschlafen benötigt. Langer Zeit einer Vollnarkose verursacht niedrige Körpertemperatur und langsamer Herzschlag. Um den möglichen Einfluss einer Vollnarkose zur Messung, Beendigung der Messungen innerhalb von 10 min nach der Injektion von Betäubungsmittel zu vermeiden werden empfohlen. Die Butorphanol zur Verfügung gestellt in der Narkose Cocktail bieten ca. 4 Stunden der Analgesie. Richtige Rezept für die Vollnarkose kann verschiedene Organe.
3. Messen Sie die Brechung der Maus Auge mit einer Infrarot-Photorefractor^4,9,14. Passen Sie die Richtung eines Maus-Augen zu halten das erste Purkinje-Bild in der Mitte der Pupille und messen die Lichtbrechung entlang der optischen Achse. Messen Sie nach der Messung das gegenüberliegende Auge mit den gleichen Verfahren (Abbildung 2a).
   Hinweis: Der Messwert für die Brechung wird stark beeinflusst durch die Position der Maus Auge entlang der optischen Achse. Stellen Sie sicher, dass das erste Bild von Purkinje innerhalb ±3 Grad von der Mitte des Schülers ausgerichtet ist. Die Workbench des spektralen Domain optische Kohärenz Tomographie (SD-OCT) System kann für die Feinabstimmung der Richtung der Schüler in der Brechung Messungen⁴verwendet werden.
4. Messen Sie die AL die Maus Auge mit einem SD-OCT System^4,15,16. Definieren Sie die AL als die Entfernung der Hornhaut Scheitelpunkt der hellsten Grenze in der Nähe der Sehnerv (Abb. 2 b).
   Hinweis: Ähnlich wie bei der Messung der Lichtbrechung, die AL ist geprägt durch die Richtung des Auges Maus. Die Hornhaut Scheitelpunkt kann durch die punktförmigen Reflexion an der Oberfläche der Hornhaut bestätigt werden. Die Grenze der Netzhaut Seite werden zum Zeitpunkt der optischen Nerv sehr diesig. Richten Sie ein wenig, um die Grenze deutlich genug für die Messung aber nicht allzu weit von der Sehnerv werden zu lassen.

3. Befestigung des Rahmens auf der Maus-Schädel.

1. Beantragen Sie einen Tropfen 0,1 % gereinigte Natrium Hyaloronsäure Augentropfen gegen Trockenheit auf jedes Auge.
   Hinweis: Augentropfen auf der Augenoberfläche werden die Werte der Brechung und axiale Längenmessungen beeinflussen. Verwenden Sie die Augentropfen nicht nach der Narkose, bis alle Messungen durchgeführt werden.
2. Legen Sie das Kinn der narkotisierten Maus auf einem Hang aus Lehm gemacht oder etwas eingesetzt werden, wie eine Kissen, die im Voraus Ebene des Schädels werden horizontal ausgerichtet sein.
3. Sterilisieren Sie die Haare und Kopfhaut zwischen Ohren und Augen mit Wattestäbchen mit 70 % Ethanol.
4. Schneiden Sie die Haut zwischen Ohren und Augen, den Schädel für ca. 0,8 cm² mit Chirurgische Scheren und Pinzetten verfügbar zu machen. Verwenden Sie dental Radierung Flüssigkeit und Baumwolle Tupfer, um der Knochenhaut zu entfernen. Sterilisieren Sie die chirurgische Scheren und Pinzetten mit 70 % Ethanol vor der Operation jede Maus.
   Hinweis: Die Haare abschneiden und sterilen Handschuhen können erforderlich sein.  Überprüfen Sie die Bestimmungen der einschlägigen Tierbetreuung Ausschuss vor diesem Eingriff. In den meisten Fällen finden Sie die zahnärztliche Radierung Flüssigkeit als einen der Anhänge im selbst heilen dental Klebstoffsystem. Wenn die zahnärztliche Radierung Flüssigkeit nicht verfügbar ist, verwenden Sie stattdessen 70 % Ethanol.
5. Montieren Sie einen Satz von Frames ohne Objektiv, um den Stick auf die richtige Position zu beheben. Setzen Sie die Rahmen auf den Maus-Kopf. Einstellen Sie die Position der Rahmen, um sicherzustellen, dass beide Augen in der Mitte den leeren Rahmen sind sorgfältig.
6. Verwenden Sie selbst heilen dental Klebesystem um den Stick auf den Maus-Kopf zu befestigen. Achten Sie darauf, nicht zu lassen, die Flüssigkeit von der befolgen System fließen in das Maus-Auge.
   Hinweis: Die Methode für die Verwendung von selbst heilen dental Klebstoffsystems unterscheidet zwischen Produkten. Finden Sie die Anleitung sorgfältig.
   Achtung: Einige der Reagenzien im dental Klebstoffsystem kann giftig sein.
7. Ca. 5 min warten Sie und nehmen Sie den Rahmen und die Mutter sorgfältig ohne Veränderung der Position des Stockes (Abb. 3a).
8. 0,75 mg/kg Atipamezol Hydrochlorid intraperitoneal um die Maus zu Erholung von der Narkose schneller zu injizieren. Setzen Sie die Maus in einen einzelnen Käfig bis vollständig erholt. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Einleitung der Myopie-Induktion und die Pflege danach

1. Warten Sie mindestens 24 Stunden nach der Operation, die Maus aus der Narkose erholen zu lassen. Fassen Sie den Stick und setzen Sie auf die Bilder mit Linsen. Die Beeinflussung beginnt zu diesem Zeitpunkt (Abb. 3 b).
   Hinweis: Um die Beschwerden zu minimieren, während der Wiederherstellungs aus der Narkose und genug Zeit für die zahnärztliche Klebesystem zur Koagulation, ist es dringend empfohlen, auf den Rahmen gesetzt, nachdem die Mäuse vollständig aus der Narkose erholt. Die Kunststoff-Zement Klebstoffsystem wird den Schnitt der Kopfhaut vollständig decken. Daher braucht man keine spezielle postoperative Behandlung zur Prävention von Infektionen und Schmerzen nach der Operation seines. Direkt nach dem ersten Mal, auf den Rahmen zu setzen werden Mäuse über Bewusstsein für die Existenz des Objektivs sein und viel kratzen. Das grobe Verhalten wird sein zurück zu normal nach ein paar Stunden. Die Mäuse mit Linsen können mit der gleichen Dichte für die normalen Mäuse gehalten werden.
2. Entfernen Sie den Rahmen und reinigen Sie die Linsen und Fingernagel Tips mit Wattestäbchen mindestens zweimal in der Woche um die Transparenz der Linse zu erhalten.
   Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Maus unter Narkose entfernen und setzen auf den Rahmen zu setzen. Bieten Sie eine Unterstützung für die Mäuse auf, zu sitzen, anstatt sie hängen, während der Arbeit mit ihnen not reduzieren könnte.
   1. Wenn eine vorläufige Messung erforderlich ist, setzen Sie die Maus in Narkose und Messen Sie die Maus wie oben beschrieben zu. Der Anreiz kann nach der Maus erholt sich von der Narkose fortgesetzt werden.
3. Reinigen Sie den Käfig mindestens zweimal in der Woche.
   Hinweis: Diese Hilfe, um Objektiv Klarheit zu erhalten. Setzen ein Netz zwischen Maus und Käfig unten, um die Essensreste Filtrat kann auch hilfreich sein.
4. Körpergewicht und grobes Verhalten zu überwachen. Vergleichen sie mit dem gleichen Alter unberührte Mäuse während der gesamten experimentellen Prozess.
   Hinweis: Bis auf einige Kratzen Verhaltensweisen ist keine wesentliche Änderung, einschließlich das Körpergewicht zwischen Experiment Mäuse mit unbehandelten Mäuse gefunden.

Ergebnisse

At zuerst überprüfen, ob alle notwendigen Teile (Abbildung 1a) zubereitet werden. Abbildung 1 bzeigt ein Beispiel für ein Stück montierte Brillen. Außer den Hauptteil der Rahmen und die Mutter sind alle anderen Teile für jede Maus Einweg. Abbildung 1 czeigt eine Reihe von fertigen Brillen. Ändern Sie den Winkel zwischen den beiden Frames, die Maus mit unterschiedlichen Alters zu passen.

Diskussion

Um sicherzustellen, die Brille auf den Maus-Kopf stabil befestigt werden, müssen mehrere Schritte in diesem Protokoll große Aufmerksamkeit geschenkt werden. Das Periost muss vollständig entfernt werden, vor der Verwendung der zahnärztlichen Klebesystem. Das Blut auf den Schädel auch mit Sorgfalt gereinigt werden müssen. Während ein wenig Feintuning direkt nach dem Auftragen des Klebstoffs akzeptabel ist, bewegen Sie sich nicht den Stick häufig vor das Klebesystem vertrocknen. Folgen Sie den Anweisungen des Klebst...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan