一种评价金黄色葡萄球菌感染先天免疫反应的小鼠模型

摘要

介绍了一种实时检测小鼠皮肤损伤和金黄色葡萄球菌感染的先天免疫反应的方法。通过将 lysm-egfp 小鼠 (具有荧光中性粒细胞) 与 lysm-egfp 杂交免疫缺陷小鼠株进行比较, 提高了对感染的认识, 并提出了对抗感染的方法。

摘要

金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌) 感染, 包括耐甲氧西林的污渍, 是一个巨大的负担, 医疗系统。随着金黄色葡萄球菌感染发病率每年攀升, 需要对其致病性进行更多的研究。传染病动物模型促进了我们对宿主病原体反应的认识, 并导致了有效疗法的发展。中性粒细胞在控制金黄色葡萄球菌感染的先天免疫反应中发挥着主要作用, 它形成了一个脓肿来围住感染, 并促进细菌的清除;浸润金黄色葡萄球菌皮肤感染的中性粒细胞的数量往往与疾病的结局有关。lysm-egfp 小鼠, 拥有增强的绿色荧光蛋白 (egfp) 插入溶菌酶 m (lysm) 启动子区域 (主要用中性粒细胞表示), 当与体内全动物荧光成像 (fli) 结合使用时, 提供了一种非侵入性和纵向向受伤皮肤的中性粒细胞移出的定量方法。当与生物发光金黄色葡萄球菌菌株和连续的体内全动物生物发光成像 (bi) 结合使用时, 可以在麻醉小鼠的感染, 从感染开始到解决或死亡。老鼠对金黄色葡萄球菌产生的一些毒力因素有更强的抵抗力, 这些因素有助于人类的有效定植和感染。免疫缺陷小鼠提供了一个更敏感的动物模型, 以检查持续的金黄色葡萄球菌感染和治疗能力, 以提高先天免疫反应。在此, 我们描述了 lysm-egfp 小鼠与野生类型 lysm-egfp 小鼠一起对 myd88 缺乏的小鼠 (lysm-EGFP×MyD88^/小鼠) 的反应, 以调查金黄色葡萄球菌皮肤伤口感染。多光谱同时检测通过在体内使用 fli、体内 bli 使用的细菌负担以及随着时间的推移纵向和非侵入性伤口愈合, 能够研究中性粒细胞的招募动态。

引言

金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌) 占美国^皮肤和软组织感染 (ssti) 的大多数。在过去20年中, 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa) 感染的发病率稳步上升 2, 这促使研究持久性的机制和发现新的治疗策略。mrsa 感染的护理标准是全身抗生素治疗, 但随着时间的推移, mrsa 对抗生素的耐药性^越来越强 3, 这些药物会减少宿主的有益微生物群, 对健康造成负面影响, 尤其是在儿童⁴。临床前研究已经研究了治疗 mrsa 感染的替代策略⁵, 但将这些方法转化为临床已被证明具有挑战性, 因为出现的毒力因素, 阻止宿主免疫反应⁶。为了解剖驱动金黄色葡萄球菌 sst 的宿主病原体动力学, 我们结合无创和纵向读出的中性粒细胞的数量招募到伤口床与动力学措施的细菌丰度和伤口面积。

中性粒细胞是人类最丰富的循环白细胞, 也是细菌感染的第一反应者^.中性粒细胞是宿主对金黄色葡萄球菌感染作出有效反应的必要组成部分, 因为它们具有杀菌机制, 包括产生活性氧、蛋白酶、抗菌肽和功能反应包括吞噬和中性粒细胞外陷阱产生^8,9。人类患者的中性粒细胞功能的遗传缺陷, 如慢性肉芽肿病和 chediak-higashi 综合征, 显示出更容易感染金黄色葡萄球菌。此外, 遗传 (如先天性中性粒细胞减少症) 和后天 (如化疗患者中出现的中性粒细胞减少症) 缺陷的患者, 中性粒细胞数量的缺陷也极易感染^金黄色葡萄球菌 10。鉴于中性粒细胞在清除金黄色葡萄球菌感染方面的重要性, 提高其免疫能力或调整其在金黄色葡萄球菌病变中的数量可能被证明是解决感染的有效策略。

在过去的十年里, 转基因小鼠与荧光中性粒细胞的记者已经开发, 以研究他们的贩运^11,12.将中性粒细胞记者小鼠与整个动物成像技术相结合, 可以对组织和器官中的中性粒细胞进行时空分析。当与金黄色葡萄球菌的生物发光菌株结合使用时, 可以跟踪中性粒细胞的积累, 以应对金黄色葡萄球菌在细菌毒力因素的背景下的丰度和持久性, 而这些因素直接或间接地受影响组织中的中性粒细胞虫虫数^13,14,15,16。

与人类相比, 小鼠对金黄色葡萄球菌毒力和免疫逃避机制的易感性较低。因此, 野生小鼠可能不是一个理想的动物模型, 以调查一个特定的治疗治疗治疗慢性金黄色葡萄球菌感染的疗效。缺乏 myd88 的小鼠 (即 myd88^/-小鼠), 一种免疫功能低下的小鼠株, 缺乏功能白细胞介素-1 受体 (il-1r) 和 toll 样受体 (tlr) 信号, 显示出更容易感染金黄色葡萄球菌野生小鼠¹⁷和中性粒细胞贩运的损伤到皮肤中的金黄色葡萄球菌感染部位 18.myd88/^小鼠中具有荧光中性粒细胞报告的小鼠株的研制为研究治疗金黄色葡萄球菌感染的疗效与目前中性粒细胞相比提供了一个替代模型记者鼠标。

在该方案中, 我们描述了免疫功能低下的 LysM-^小鼠的金黄色葡萄球菌感染, 并与 lysm-egfp 小鼠比较了感染的时间过程和解决方法。lysm^{-EGFP×MyD88/小}鼠出现不解决的慢性感染, 75% 的人在8天后死于感染。在最初的中性粒细胞招募中, 一个显著的缺陷发生在感染的炎症阶段的72小时以上, 在感染的后期招募的中性粒细胞减少了50%。lysm-EGFP×MyD88^小鼠的易感性增加, 使这一特殊菌株成为一个严格的临床前模型, 以评估针对金黄色葡萄球菌感染的新治疗技术的有效性, 而目前的模型利用野生类型的小鼠, 特别是旨在提高先天免疫反应的技术, 以防止感染。

研究方案

所有的小鼠研究都经过了加州大学戴维斯分校动物护理和使用机构委员会的审查和批准, 并根据《动物福利法》和《健康研究推广法》的准则进行。在与动物一起工作时, 一定要使用无菌手套。

1. 鼠标源和外壳

1. 如前^所述, 在 c57bl/6j 遗传背景下衍生 lysm-egfp 小鼠。在 c57bl/6j背景下, 通过将 lysm-egfp 小鼠与 myd88/小鼠杂交, 衍生 LysM---小鼠.
2. 把老鼠种在一个维维变种里。为了这些研究, 动物在手术前被安置在加州大学戴维斯分校, 手术后被安置在单一的地方。使用10-16周之间的小鼠。

2. 细菌制备和定量

1. 从-80°c 的储存中去除感兴趣的生物发光金黄色葡萄球菌菌株, 使其在冰上解冻。在5% 的牛血琼脂板上流淌。在 37°c (16小时) 的加湿孵化器中孵育带板。
   注: 在本协议中, 使用了 alc2906 sh1000 应变。该菌株包含穿梭质粒 psk236 与青霉素结合蛋白2启动子融合到豪华 cde记者盒从Photohabdus 发光 18融合。
2. 将每毫升纯净水混合0.03 克 tsb 粉末, 并将 tsb 高压灭菌, 制备色粒豆汤 (tsb)。冷却后, 使用无菌技术添加任何必要的抗生素。在该协议中, 在 tsb^中加入 10μg/ml 氯霉素 18, 以选择 psk236 穿梭质粒的表达, 其中含有生物发光的豪华 cde 盒。
3. 选择3-4 个独立的菌落从金黄色葡萄球菌板到 tsb 与10μgml 氯霉素开始一夜培养。在 37°c (16小时) 的孵育振动台上孵育细菌。
4. 开始一种新的细菌培养从隔夜培养, 稀释样品1:50 到 tsb 与10μgml 氯霉素。在200转/分和37°c 的孵育振动台培养。
5. 分裂金黄色葡萄球菌两小时后, 用分光光度计监测600纳米 (od₆₀₀) 的光学密度。观察 od₆₀₀与时间, 以找到中对数阶段的增长。对于 alc2906 sh1000 菌株, od₆₀₀为0.5 为中对数, 对应浓度为 1 x 10 8 cmu/ml ( 图 1)。
6. 当 od₆₀₀为0.5 时, 用冰凉 dpbs 清洗细菌1:1。在 3, 000 x g和4°c 下离心细菌10分钟。仔细地对上清液进行装饰, 并彻底添加额外的冷冻 dpbs 和涡旋。在 3, 000 x g和4°c 下再次离心10分钟。
7. 小心地装饰上清液。将细菌颗粒重新用于所需的浓度。在这些研究中, 收集 alc2906 sh1000 的3毫升, 并在 pbs 的 1.5 ml 中重新悬浮, 与细菌浓度约为 2 x 10 8 cpuml 有关.将细菌放在冰上, 直到使用。
8. 为了验证细菌浓度, 请在 pbs 中稀释100μl 的细菌样本1:10000 和1:100000。在琼脂板上的板20μl 脂肪。在37°c 时在加湿孵化器中孵育 16小时. 通过总检查计数 cfu, 并在第二天计算细菌浓度。

3.金黄色葡萄球菌切除皮肤的伤和接种

1. 通过腹腔内注射,对每只小鼠进行100μl 的 0.03 mgl 盐酸丁丙诺非 (~ 0.2 mg/2 kg)。
2. 注射后 20分钟, 将2-4 个小鼠放入具有 2-3 lpm 氧气的室内, 并含有2-4 的异氟醚。一旦小鼠被完全麻醉, 将小鼠一次转移到与 2-3 lpm 氧气相连的鼻锥, 并将2-4 异氟醚。通过牢牢地捏拇指和食指之间的每个后爪来验证老鼠是否完全麻醉。如果动物对压力没有反应, 就继续下一步。
3. 用电动剪子在鼠标背面的1英寸乘2英寸的部分, 用干净的擦拭或纱布清除皮草剪报的区域。避免使用脱毛化妆水, 因为它可能会导致过度炎症。
4. 首先用10% 的聚碘浸泡的纱布清洁小鼠的背部, 然后用70% 的乙醇浸泡纱布。以螺旋模式清洁区域, 从手术区域的中心向外移动。手术前等待约 1分钟, 使手术区域干燥。
5. 将剃光的鼠标背部松散地夹在两个手指之间, 并在准备好的手术区域中心牢固地按下6毫米的无菌冲床活检。不要拉紧皮肤。
   1. 扭动打孔活检, 在皮肤上形成一个圆形轮廓, 在轮廓的至少一个部分完全划破皮肤。注意不要切入底层筋膜或组织。
   2. 使用无菌剪刀和钳子切割通过表皮和真皮按照由冲床活检印迹的圆形图案。

4. s.金牛座接种

1. 用所需的生物发光细菌接种剂填充 28 g 胰岛素注射器。在本研究中, 给药浓度为 1 x 10 8 chuml (50μl)。不要管理超过100μl 的体积。
2. 在小鼠背部伤口中心的筋膜和组织之间注入50μl 的接种剂。确保接种剂在伤口中心形成气泡, 最大限度地减少泄漏或分散。
   1. 将真皮拉到一侧, 将注射器与组织几乎平行, 然后缓慢地将注射器推入组织中, 直到感觉到阻力的突然下降, 这表明筋膜被刺穿。小心地将注射器引导到伤口的中心, 慢慢地发放接种剂。慢慢地从动物身上取出注射器。
3. 如上文所述, 将相同数量的无菌 pbs 注射到未感染动物的伤口中。
4. 把动物送回笼子里。将笼子放在热灯下或加热垫上, 并对动物进行监控, 直到从麻醉中恢复。

5. 在 vivo bli 和 fli 中

1. 通过仪器软件初始化整个动物成像仪。在接收2-3 个 lpm 氧的室内内对小鼠进行麻醉, 并将2-4 异氟醚。给成像仪内的鼻孔麻醉。
2. 将受伤和受感染的鼠标放入成像仪中。将鼠标放置, 使伤口尽可能平坦。使用以下序列设置来图像鼠标。
   1. 选择"发光"和"照片"作为成像模式。曝光时间为 1分钟, 小分档和 f/停止 1 (发光) 和 f/停止 8 (照片)。发射筛选器为"打开"。单击 "获取"按钮以记录图像。
   2. 选择荧光和照片作为成像模式。曝光时间为 1, 在小分球和 f/停止 1 (荧光) 和 f/停止 8 (照片) 以激发波长 45.30 nm 和发射波长520纳米以高灯强度。单击 "获取"按钮以记录图像。
3. 将动物送回笼子, 并进行监测, 直到麻醉恢复。
4. 图像鼠标每天如上所述。

6. 图像分析

1. 打开要量化的图像。
2. 在图像中的每个鼠标 (包括周围的皮肤) 上放置一个感兴趣的大圆形区域 (roi)。体内的中性粒细胞 fli egfp 信号和体内 bli金黄色葡萄球菌信号在几天后延伸到伤口边缘以外, 并被纳入这些研究 (图 2 a和2A)。单击 "测量 roi"并记录每个鼠标的平均流量值。绘制每个信号 (p/) 相对于时间的平均通量。
3. 如果伤口中需要中性粒细胞或金黄色葡萄球菌的绝对数量, 请进行以下实验。
   1. 为了将中性粒细胞数与体内 fli egfp 信号联系起来, 如上文所述, 伤口 c57bl/6j 小鼠, 并从 lysm-egfp 或 lysm-egpxmyd88//转移一系列骨髓衍生中性粒细胞 (5 x¹⁰ 5 至 1 x^{10 7})直接在不同的伤口上如上文所述的图像, 并将体内 fli egfp 信号与已知的中性粒细胞数量相关联。
   2. 如上文所述, 将金黄色葡萄球菌cfu 与体内 bri 信号、伤口和感染小鼠联系起来。在第一天感染后记录体内的 bri 信号来自小鼠, 并立即对尸体进行安乐死和冷却。将伤口、组织均匀化, 并在琼脂上进行板状细菌稀释, 以便隔夜孵育。第二天, 计数菌落来确定每个伤口的 cfu。
4. 测量伤口愈合适合在伤口边缘的循环 roi, 并测量伤口的面积 (厘米²), 并绘制与基线相对于时间的分数变化 (图 2c)。

7. 统计

请注意:所有数据均以平均±sem. p . p. 0 < 0.05 表示具有统计学意义

1. 使用 alpha = 0.05 确定一天内两组之间的差异, 并分别分析每个时间点, 而不假设 sd 一致。
2. 通过单向方差分析与 tukey 多次比较后测试比较同一天多个组之间的差异。采用曼特尔-考克斯方法对实验组间的生存率进行了分析。

结果

LysM-^/小鼠比 lysm-egfp 小鼠更容易感染金黄色葡萄球菌

本研究中使用的金黄色葡萄球菌菌株 alc2906 18 是用质粒构建的, 质粒包含了从活菌和活性代谢细菌产生生物发光信号的lux结构。当接种到小鼠体内时, 体内生物发光成像 (bl) 技术可用于纵向测量受感染伤口内的细菌负担。LysM--...

讨论

利用荧光中性粒细胞记者鼠生物发光金黄色葡萄球菌感染的金黄色葡萄球菌感染模型, 结合整个动物体内光学成像的先进技术, 提高了我们对先天的认识对感染的免疫反应。此前使用 lysm-egfp 小鼠的研究表明, 在感染的前 24小时内, 多达 1 x 10 7只中性粒细胞被招募到金黄色葡萄球菌感染的伤口,而伤口招募的中性粒细胞将其半衰期从1.5天延长到5天对一个

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352059
6 mm Disposable Biopsy Punch	Integra Miltex	33-36
Bioluminescent S. aureus	Lloyd Miller, Johns Hopkins	ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable	Western Medical Supply	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Labratory	000664
Chloramphenicol (crystalline powder)	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Insulin Syringes	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP Mice	Thomas Graff Albert Einstein College of New York	NA
Microvolume Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-2000
MyD88 KO Mice	Jackson Labratory	009088
Non-woven sponges	AMD- Ritmed Inc	A2101-CH	5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution	Aplicare	697731
Prism 7.0	GraphPad Software	License
Tryptic Soy Broth	Becton, Dickson and Company	211825