Bir fare modeli için değerlendirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı Staphylococcus aureus enfeksiyon

Özet

Bir yaklaşım Kutanöz yaralama için doğuştan gelen bağışıklık yanıtının gerçek zamanlı algılama ve Staphylococcus aureus enfeksiyon farelerin için tanımlanır. Karşılaştırma LysM-EGFP tarafından (floresan nötrofil sahip) fareler LysM EGFP ile immünyetmezligi fare zorlanma olacak, biz anlayışımız enfeksiyon ve enfeksiyon mücadele için yaklaşımlar gelişimi önceden.

Özet

Staphylococcus aureus (S. aureus) enfeksiyonları, metisiline dirençli lekeler, dahil olmak üzere sağlık sistemi üzerinde büyük bir yük vardır. Her yıl tırmanma S. aureus enfeksiyonu insidans hızları ile onun patojen ek araştırma için bir talep vardır. Ana bilgisayar-patojen yanıt bizim anlayışı ilerletmek ve etkili tedavi gelişmesine yol bulaşıcı hastalık hayvan modelleri. Nötrofil S. aureus enfeksiyonları abse enfeksiyonla duvar ve bakteriyel Gümrükleme kolaylaştırmak için oluşturarak denetler doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bir birincil rol oynamaktadır; bir S. aureus deri enfeksiyonu genelde sızmak nötrofil sayısı hastalık sonucu ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. (Öncelikle nötrofil tarafından ifade edilir) lizozim M (LysM) organizatörü bölge takılı gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) sahip, LysM-EGFP fareler ile birlikte kullanıldığında içinde vivo bütün hayvan Floresans görüntüleme (FLI) sağlayan bir nötrofil göç Noninvazif ve boyuna miktarının yaralı deri içine anlamına gelir. Kollarındaki S. aureus ile birleştirildiğinde zorlanma ve sıralı içinde vivo bütün hayvan kollarındaki görüntüleme (BLI), boyuna nötrofil işe alım dinamikleri ve içinde vivo bakteri yükü yerinde izlemek mümkün olduğunu enfeksiyon çözünürlük veya ölüm enfeksiyon başlangıcı üzerinden imzalat farelerde. Fareler etkili kolonizasyon ve enfeksiyon insanlarda kolaylaştırmak virülans faktörleri S. aureus tarafından üretilen bir dizi daha dayanıklıdır. İmmünyetmezligi fareler sağlar kalıcı S. aureus incelemek için daha duyarlı hayvan modeli enfeksiyonlar ve tedavi yeteneği doğuştan gelen bağışıklık yanıtı artırmak için. Burada, S. aureus Cilt yara enfeksiyonu araştırmak için vahşi-LysM-EGFP farelerde tip birlikte yanıt-e doğru MyD88-eksik fareler (LysM-EGFP × MyD88^{- / -} fareler) için yetiştirilen LysM-EGFP farelerde karakterize. Spektral eş zamanlı algılama çalışma nötrofil işe alım dinamiği içinde vivo FLI, içinde vivo BLI, kullanarak bakteri yükü kullanarak etkin ve boyuna ve Noninvazif zamanla iyileşmesi.

Giriş

Staphylococcus aureus Deri ve yumuşak doku enfeksiyonları (SSTIs), Amerika Birleşik Devletleri¹çoğunluğu (S. aureus) hesapları. Görülme sıklığı metisiline dirençli S. aureus (MRSA) enfeksiyonlar giderek insan sebat mekanizmaları ve yeni tedavi stratejileri keşfi motive son yirmi yılda², artmıştır. Standart tedavi MRSA enfeksiyonları için sistemik antibiyotik tedavisi, ama MRSA süresi³ giderek antibiyotiklere dirençli hale gelmiştir ve bu ilaçlar özellikle olumsuz sağlık etkileri, neden ana bilgisayarın faydalı microbiome düşürebilir Çocuk⁴. Preklinik çalışmalar MRSA enfeksiyonları⁵tedavi etmek için alternatif stratejiler inceledik ama bu yaklaşımlar kliniğe çeviren konak immün yanıt-e doğru⁶önlemek virülans faktörleri ortaya çıkması nedeniyle zorlu kanıtlamıştır. Ana bilgisayar-patojen dynamics bu sürücüyü S. aureus SSTIs incelemek için biz noninvaziv birleştirmek ve nötrofil sayısının boyuna dökümanları yara yatağına bakteriyel bereket Kinetik ölçüleri ile işe ve alanına yara.

Nötrofil en bol dolaşımdaki akyuvar insanlar ve ilk yardım ekipleri bir bakteriyel enfeksiyon⁷vardır. Nötrofil S. aureus enfeksiyonlar Reaktif oksijen türleri, proteaz, antimikrobiyal peptidler ve fonksiyonel yanıt üretimi dahil olmak üzere bakterisidal mekanizmaları nedeniyle karşı etkili ana müdahale için gerekli bir bileşeni vardır fagositoz ve nötrofil hücre dışı tuzak üretim^8,9dahil olmak üzere. İnsan gibi kronik granulomatous hastalığı ve Chediak-Higashi sendromu, nötrofil işlevindeki genetik kusurların hastalarda S. aureus enfeksiyon bir artış duyarlılık gösterin. Buna ek olarak, hastaların genetik (örneğin Konjenital Nötropeni) ve Edinsel (Nötropeni kemoterapi hastalarda görülen) gibi kusurları nötrofil rakamlarla da S. aureus enfeksiyon¹⁰' a son derece açıktır. S. aureus enfeksiyonlar takas nötrofil önemi göz önüne alındığında, bağışıklık kapasitelerinin artırılması veya sayıları S. aureus lezyon içinde ayarlama enfeksiyon çözümünde etkili bir strateji ispat edebilir.

Son on yıl içinde Floresans nötrofil muhabirlerle transgenik fareler onların ticareti^11,12incelemek için geliştirilmiştir. Nötrofil muhabir fareler bütün hayvan görüntüleme teknikleri ile birleştirerek kronolojik zamanmekansal analiz nötrofil doku ve organlarında izin verir. S. aureuskollarındaki suşları ile birleştirildiğinde, S. aureus bereket karşılık olarak nötrofil birikimi izlemek mümkündür ve sebat bakteriyel virülans bağlamında doğrudan ve dolaylı olarak faktörler etkilenen doku^13,14,15,16nötrofil numaraları huzursuz.

Fareler S. aureus virülans ve bağışıklık kaçırma mekanizmaları için insanlardan daha az duyarlı değildir. Bu nedenle, farelerde vahşi-tip etkinliğini araştırmak için ideal bir hayvan modeli olmayabilir bir kronik S. aureus tedavisi için tedavi verilen enfeksiyon. MyD88-eksik fareler (yani, MyD88^{- / -} fareler), fonksiyonel interleukin-1 reseptör (IL-1R) ve sinyal, Toll benzeri reseptör (TLR) göre S. aureus enfeksiyon Haritayı büyük duyarlılık yoksun bir immün fare zorlanma farelerde vahşi-tip¹⁷ ve¹⁸cilt S. aureus enfeksiyon bir siteye nötrofil kaçakçılığı bir bozulma. Floresan nötrofil muhabir MyD88^{- / -} farelerde sahip bir fare yük gelişimi için geçerli nötrofil karşılaştırıldığında S. aureus enfeksiyon tedavisinde terapiler etkinliğinin araştırılması için alternatif bir model sağlamıştır muhabir fareler.

Bu iletişim kuralı ' S. aureus enfeksiyon farelerde immün LysM-EGFP × MyD88^{- / -} karakterize ve zaman ders yapmak ve enfeksiyon LysM-EGFP fareler ile karşılaştırın. LysM-EGFP × MyD88^{- / -} fareler does değil karar vermek bir kronik enfeksiyon geliştirmek ve % 75 enfeksiyon 8 gün sonra yenik düşer. İlk nötrofil işe alım önemli bir üründe 72 h enfeksiyon inflamatuvar aşamasının üzerinden oluşur ve % 50 daha az sayıda nötrofil enfeksiyon ikinci aşaması sırasında işe. ^{- / -} Fareler bu belirli yapar MyD88 zorlanma S. aureus enfeksiyon için geçerli göre hedefleme yeni tedavi teknikleri etkinliğini değerlendirmek için titiz preklinik modeli LysM-EGFP × artan duyarlılık modelleri vahşi tipi fareler, özellikle enfeksiyon karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı artırmak amaçlayan teknikleri kullanmaktadır.

Protokol

Tüm fare çalışmalar incelendi ve kurumsal hayvan bakım ve UC Davis kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan refahı Yasası ve Sağlık Araştırma uzantısı Yasası kurallarına göre yapıldı. Steril eldiven hayvanlarla çalışırken kullandığınızdan emin olun.

1. kaynak ve konut fare

1. LysM-eGFP fareler C57BL/6J genetik arka plan üzerinde türetmek¹²daha önce açıklandığı gibi. LysM-EGFP × MyD88^{- / -} fareler MyD88^{- / -} fareler üzerinde bir C57BL/6J arka plan ile geçiş LysM-EGFP fareler tarafından türetme yapıp yapmayacağınızı.
2. Bir vivaryum House fareler. Bu çalışmalar için hayvanlar Kaliforniya Üniversitesi Davis cerrahi ve tek ev aşağıdaki ameliyatla önce grupta yer. 10-16 hafta yaşları arasında fare kullanın.

2. bakteriyel hazırlık ve miktar

1. Kollarındaki kaldırmak S. aureus zorlanma buz erimek için-80 ° C depolama dan ilgi. Çizgi %5 sığır kan agar tabakta. 37 ° c gece (16 h) oksijen bir kuluçka çizgili plaka kuluçkaya.
   Not: Bu protokol için ALC2906 SH1000 zorlanma kullanıldı. Bu zorlanma Servisi plazmid pSK236 ile Photohabdus luminescens¹⁸ luxABCDE muhabir kaset için erimiş penisilin-bağlayıcı protein 2 organizatörü içerir.
2. Tryptic soya suyu (TSB) 0,03 g mL saf su ve basınçlı kap TSB sterilize etmek için başına TSB tozu karıştırarak hazırlayın. Soğuyunca, steril tekniği kullanarak gerekli antibiyotik ekleyin. Bu protokol için 10 µg/mL kloramfenikol¹⁸ tekerlekli sandalye Basketbolu bioluminescence luxABCDE kaset içerir pSK236 Servisi plazmid ifade için seçmek için ekleyin.
3. 3-4 ayrı kolonileri S. aureus plaka TSB 10 µg/mL kloramfenikol ile bir gecede kültür başlatmak için seçin. 37 ° c gece (16 h) incubating bir shaker bakteri kuluçkaya.
4. Yeni bir bakteri kültürü gecede kültüründen bir örnek 1:50 TSB 10 µg/mL kloramfenikol ile sulandrarak başlatın. Kültür incubating bir shaker 200 devir/dakika ve 37 ° c
5. S. aureus, bölme sonra iki saat izlemek optik yoğunluk 600 nm (OD₆₀₀) bir Spektrofotometre üzerinde. Orta-logaritmik faz büyüme bulmak için zaman vs OD₆₀₀ gözlemlemek. ALC2906 SH1000 zorlanma için 0,5 OD₆₀₀ orta-logaritmik olduğunu ve 1 x 10⁸ CFU/mL (şekil 1) bir konsantrasyon için karşılık gelir.
6. OD₆₀₀ 0,5 olarak bakteri buz gibi DPBS ile 1:1 yıkayın. Bakteri 3000 x g ve 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatle süpernatant dikkatle boşaltmak ve ek soğutulmuş DPBS ve girdap iyice ekleyin. Bir kez daha için 3000 x g ve 4 ° c, 10 dk santrifüj
7. Dikkatle süpernatant dikkatle boşaltmak. Bakteriyel Pelet istenen bir konsantrasyon resuspend. Bu çalışmalar, ALC2906 SH1000 3 mL toplar ve PBS, yaklaşık 2 x 10⁸ CFU/mL bakteri konsantrasyonu için bağıntı 1.5 ml resuspend. Buz üstünde bakteri kadar kullanmak tutmak.
8. Bakteri konsantrasyonu doğrulamak için bakteriyel Örnek 1:10,000 ve PBS 1:100,000 100 µL oranında seyreltin. Plaka 20 µL aliquots agar plaka üzerinde. Kuluçkaya brüt bir sınava 16 h. sayısı CFUs için oksijen bir kuluçka 37 ° C'de ve bakteri konsantrasyonu ertesi gün hesaplayın.

3. excisional deri Wounding ve S. aureus ile aşı

1. 0.03 mg/mL buprenorfin hidroklorür (~0.2 mg/kg) 100 µL her fare ile mayi enjeksiyon için yönetmek.
2. Yirmi dakika sonrası enjeksiyon, bir odası ile 2-3 LPM oksijen ile % 2-4 isoflurane farelerde yer 2-4. Fareler tam anestezi sonra tek tek bir burun konisi için 2-3 LPM oksijen ile % 2-4 isoflurane bağlı fare aktarın. Fareler tamamen sıkıca başparmak ve işaret parmağı arasında her arka pençe pinching tarafından anestezi doğrulayın. Hayvan için çimdik yanıt vermezse sonraki adıma geçin.
3. Arkadaki fare 2 inç Bölüm 1 santim elektrik makasları ile tıraş ve kürk kupürleri temiz silin veya gazlı bez kullanarak alanı boşaltın. Aşırı iltihap neden olabilir çünkü depilatory losyon kullanmaktan kaçının.
4. Temiz fare arkası ilk % 10 povidone-iyot batırılmış gazlı bez ve sonra % 70 etanol ile gazlı bez ıslanmış. Cerrahi alan merkezden dışa doğru hareket bir spiral düzende alanı temizleyin. Ameliyat öncesi kurumasını cerrahi alan yaklaşık 1 dakika bekleyin.
5. Traş iki parmak arasında gevşek fare geri tutun ve steril 6 mm punch biyopsi hazırlanan cerrahi alan ortasındaki sıkıca bastırın. Cildi gergin çekmeyin.
   1. Anahattın en az bir bölümünde deri yoluyla tamamen keser cilt üzerinde dairesel bir anahat oluşturmak için punch biyopsi twist. Temel fasya veya doku kesmemeye dikkat et.
   2. Steril makas ve forseps epidermis ve punch biyopsi tarafından baskılı dairesel desen DermIS ile kesmek için kullanın.

4. S. Aureus aşı

1. 28 G insülin şırınga ile istenen kollarındaki bakteriyel inoculant doldurun. Bu çalışmada, 1 x 10⁸ CFU/mL bir konsantrasyon yönetmek (50 µL). Birimin fazla 100 µL yönetmek değil.
2. İnoculant fasya ve doku yara arkadaki fare ortasına arasında 50 µL enjekte. İnoculant en az kaçağı veya dağılım yarayla ortasındaki bir kabarcık oluşturur emin olun.
   1. Dermis kenara çek, şırınga doku neredeyse paralel tutun ve direnç ani bir düşüş, fasya piercing gösterir hissedilir kadar yavaş yavaş şırınga dokusu içine itin. Dikkatle şırınga yaranın ortasına kurşun ve inoculant yavaş yavaş dağıtmak. Şırıngayı yavaşça hayvandan kaldırın.
3. Steril PBS aynı hacmi yukarıda açıklandığı gibi hastalık bulaşmamış tek hayvan yaralar enjekte.
4. Hayvan onun kafes dönmek. A ısı lamba altında veya üstünde bir Isıtma yastığı kafes yerleştirin ve hayvan kurtarma anestezi kadar izlemek.

5. vivo BLI ve FLI

1. Araç yazılım aracılığıyla tüm hayvan Imager başlatın. 2-3 LPM oksijen ile % 2-4 isoflurane alma odası farelerde anestezi. Anestezi nosecones Görüntüleyici içinde teslim.
2. Yaralı ve virüslü fare Imager yerleştirin. Öyle ki yara gibi dümdüz fareyi getirin. Aşağıdaki sıra set-up fareler görüntü için kullanın.
   1. Işıma ve fotoğraf görüntüleme modu olarak seçin. 1dk küçük binning ve F/stop 1 (ışıma) ve durdurmak F/8 (fotoğraf) maruz kalma zamanı. Emisyon filtre açıktır. Görüntü kaydetmek için Al düğmesini tıklatın.
   2. Floresan ve fotoğraf görüntüleme modu olarak seçin. Pozlama süresi 1 s (floresan) küçük binning ve F/stop 1 ve durdurmak F/8 (fotoğraf) 465/30 bir uyarma dalga boyu ile de nm ve emisyon dalga boyu 520/20 nm yüksek lamba yoğunluğu ile. Görüntü kaydetmek için Al düğmesini tıklatın.
3. Hayvan onun kafes ve İzleyicisi anestezi kurtarma kadar geri dönmek.
4. Görüntü fareler yukarıda açıklandığı gibi her gün.

6. görüntü analizi

1. Sayısal için görüntüleri aç.
2. Faiz (ROI) büyük bir dairesel bölgeye cilt görüntüdeki her fare için çevreleyen dahil olmak üzere tüm yara alan üzerine getirin. Nötrofil içinde vivo FLI EGFP sinyalleri ve içinde vivo BLI S. aureus sinyalleri birkaç gün sonra yara kenar genişletmek ve bu çalışmalarda (şekil 2A ve 2B) dahil edildi. Ölçü ROI ve her fare için ortalama akı için kayıt değerlerini tıklatın. Karşı her sinyal (p/s) Zaman ortalama akı arsa.
3. Nötrofiller veya S. aureus yarada kesin rakamlar isterseniz, aşağıdaki deneyler yapmak.
   1. Nötrofil içinde vivo FLI EGFP sinyalleri sayılara ilişkilendirmek için yukarıda açıklandığı gibi C57BL/6J fareler yara ve LysM-EGFP veya LysM-EGFPxMyD88^{- / -} bağış nötrofil (5 x 10⁵ 1 x 10⁷) kemik iliği elde edilen bir dizi transfer doğrudan farklı yaralar üstüne. Görüntü yukarıdaki ve correlate açıklandığı gibi içinde vivo FLI EGFP nötrofil bilinen miktara sinyalleri.
   2. S. aureus CFU içinde vivo BLI sinyalleri ilişkilendirmek için yara ve yukarıda açıklandığı gibi fareler bulaştırmak. 1. gün sonrası enfeksiyon kayıt içinde vivo BLI sinyalleri fareler ve hemen üzerinde ötenazi ve leşleri chill. Yara tüketim, doku homojenize ve agar gecede kuluçka için üzerinde bakteriyel dilutions plakası. Ertesi gün, koloniler CFU yara belirlemek için say.
4. Yara kenar ve yara (cm²) alanının ölçü üzerinde dairesel bir yatırım Getirisi yara iyileşme uyum ölçmek ve zaman (şekil 2C) vs temel kesirli değişikliğinden çizmek için.

7. istatistik

Not: Tüm verileri sunulmaktadır olarak ortalama ±SEM. p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul

1. Holm-Sidak yöntemini kullanarak tek bir günde iki grup arasındaki farkları belirlemek, Alfa ile 0,05 = ve her zaman noktası tek tek, tutarlı bir SD varsayarak olmadan analiz
2. Tukey çoklu karşılaştırmalar posttest ile tek yönlü ANOVA tarafından aynı gün birden çok grubu arasındaki farkları karşılaştırın. Hayatta kalma deneysel gruplar arasında Mantel-Cox yöntemi ile analiz edildi.

Sonuçlar

LysM-EGFP × MyD88^{- / -} fareler LysM EGFP fareler S. aureus enfeksiyona daha duyarlı

Bu çalışmada, ALC2906¹⁸, kullanılan S. aureus suşu canlı ve aktif metabolize bakterilerden kollarındaki sinyalleri üretir lux yapısı içeren bir plazmid ile inşa. Fareler aşısını, içinde vivo bioluminescence (BLI) teknikleri Imaging boyuna virüslü bir yara iç...

Tartışmalar

Kollarındaki S. aureus kullanmak S. aureus enfeksiyon modelleri floresan nötrofil muhabir fare gelişmiş teknikler ile birlikte enfeksiyon tüm hayvan içinde vivo optik görüntüleme bilgimizi doğuştan gelen gelişmiş enfeksiyon bağışıklık yanıtı. Önceki çalışmalar LysM-EGFP fareyi kullanarak yukarı bir S. aureus enfekte yara enfeksiyonu ilk 24 saat içinde için 1 x 10⁷ nötrofil işe¹⁴ve nötrofil yara işe onların yarı ömrü 1,5 gün ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352059
6 mm Disposable Biopsy Punch	Integra Miltex	33-36
Bioluminescent S. aureus	Lloyd Miller, Johns Hopkins	ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable	Western Medical Supply	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Labratory	000664
Chloramphenicol (crystalline powder)	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Insulin Syringes	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP Mice	Thomas Graff Albert Einstein College of New York	NA
Microvolume Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-2000
MyD88 KO Mice	Jackson Labratory	009088
Non-woven sponges	AMD- Ritmed Inc	A2101-CH	5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution	Aplicare	697731
Prism 7.0	GraphPad Software	License
Tryptic Soy Broth	Becton, Dickson and Company	211825