マウスのモデルを評価する生得の免疫反応黄色ブドウ球菌感染症

要約

皮膚が負傷したに生得の免疫反応のリアルタイム検出とマウスの黄色ブドウ球菌感染症のためのアプローチを説明します。比較する LysM EGFP でマウス (蛍光好中球を所有) する LysM EGFP と交雑免疫不全マウス緊張、感染と戦うための方法の開発や感染症の理解を進めます。

要約

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) 感染症、メチシリン耐性の汚れを含む、医療システムに大きな負担です。毎年登山黄色ブドウ球菌感染症の罹患率、その病原性の付加的な研究のための要求があります。感染症の動物モデル宿主-病原体反応の理解を進めるし、効果的な治療法の開発に 。好中球は感染を壁し、細菌クリアランスの促進に膿瘍を形成することによって黄色ブドウ球菌感染症を制御する生得の免疫反応の主な役割を果たす黄色ブドウ球菌の皮膚感染症頻繁に潜入する好中球数は病気の結果と関連付けています。強化された緑色蛍光タンパク質 (EGFP) が (主に好中球によって表される) リゾチーム M (LysM) プロモーター領域に挿入を所有する LysM EGFP マウスと組み合わせて使用するとき全体の動物の in vivo 蛍光イメージング (FLI) を提供する、負傷者の肌に非侵襲的縦好中球移住を定量化を意味します。生物発光の黄色ブドウ球菌と組み合わせればひずみと逐次体内全体の動物生物発光イメージング (結合)、縦好中球動員ダイナミクスと体内細菌負荷のサイトの両方を監視することが可能です。解像度や死に感染症の発症から麻酔下マウスでの感染。マウスは、黄色ブドウ球菌によって生成される効果的な植民地化と人への感染を容易にする病原因子の数に優れています。免疫不全マウスは、永続的な黄色ブドウ球菌を調べるより敏感な動物モデルを提供する感染と自然免疫応答を向上させる治療の能力。ここで、黄色ブドウ球菌の皮膚感染を調査する野生型 LysM EGFP マウスと一緒に MyD88 欠損マウス (LysM EGFP × MyD88^-/-マウス) に飼育されている LysM EGFP マウスにおける反応を特徴付けます。マルチ スペクトル同時検出体内 FLI、体内のバリを使用して細菌の負荷を使用して好中球動員ダイナミクスの研究を有効に、創傷治癒の長手方向と非侵襲的時間をかけて。

概要

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)は、皮膚および軟部組織感染症 (SSTIs) アメリカ合衆国¹の大半を占めています。発生率のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA) 感染症は、過去二十年以上²、永続化のメカニズムと新しい治療戦略の発見の研究をやる気にさせる着実に増加しました。MRSA 感染症の標準治療は全身抗生物質療法が、MRSA は時間³でますます抗生物質に耐性となっている、これらの薬は、特に否定的な健康への影響を引き起こしているホストの有益なマイクロバイを減らすことができます。子供⁴。前臨床研究は、MRSA 感染症⁵を治療するための代替戦略を検討しているが、ホスト免疫反応⁶を阻止する病原因子の出現のために挑戦を証明している診療所にこれらのアプローチを翻訳します。ドライブ黄色ブドウ球菌SSTIs ホスト病原体のダイナミクスを分析、我々 は非侵襲的結合と好中球数の縦のリードアウト細菌の豊かさの運動対策で傷のベッドに募集し地域を傷します。

好中球は、細菌感染症⁷の最初の応答と人間の最も豊富な循環白血球です。好中球は、機能的反応抗菌ペプチド、プロテアーゼ活性酸素種の生産を含む彼らの殺菌メカニズムによる黄色ブドウ球菌の感染症に対して有効なホスト応答のために必要なコンポーネント貧食能および好中球細胞外トラップ生産^8,9を含みます。慢性肉芽腫症とベイジュ症候群などの好中球機能の遺伝的欠陥の人間の患者は、黄色ブドウ球菌感染に対する感受性の増加を表示します。さらに、患者 (先天性好中球減少症) など遺伝的と (化学療法の患者に見られる好中球減少症) など取得した好中球数の欠陥も非常に受けます黄色ブドウ球菌感染症¹⁰。黄色ブドウ球菌感染症をクリアするに好中球の重要性を考えると、免疫能力を高めることや、黄色ブドウ球菌の病変内で自分の番号をチューニングは、感染症を解決する効果的な戦略を証明するかもしれない。

過去 10 年間、人身売買の^11,12を勉強するトランスジェニック マウスに蛍光好中球記者が開発されてきました。好中球レポーター マウスの全体の動物のイメージング技術を組み合わせて組織や臓器における好中球の時空間解析を許可します。黄色ブドウ球菌の生物発光菌株と組み合わせると、黄色ブドウ球菌の豊かさへの応答における好中球の集積を追跡することが可能だし、細菌の病原性のコンテキストで永続化および間接的要因影響を受ける組織^13,14,,1516で好中球数を混乱させます。

マウスが人間よりも黄色ブドウ球菌の病原性と免疫回避機構を受けないです。野生型マウスが理想的な動物モデルの有効性を調査するためにできない場合がありますなど、慢性的な黄色ブドウ球菌の治療に治療を与えて感染。MyD88 欠損マウス (すなわち、MyD88^-/-マウス)、機能的なインターロイキン 1 受容体 (IL-1 r) および Toll 様受容 (TLR) シグナリング、ショー大きい感受性と比較すると黄色ブドウ球菌の感染もない免疫不全マウス緊張野生型マウスの¹⁷と¹⁸皮膚黄色ブドウ球菌感染症のサイト売買は好中球の機能障害。MyD88^-/-マウスの好中球蛍光レポーターを所有しているマウス緊張の開発は、現在好中球に比べて黄色ブドウ球菌感染症を治療する治療法の有効性を調査するための代替モデルを提供してレポーター マウス。

このプロトコルでは、免疫不全 LysM EGFP × MyD88^-/-マウスで、黄色ブドウ球菌感染症の特徴し、経過と感染する LysM EGFP マウスの解像度を比較します。LysM EGFP × MyD88^-/-マウスの開発が解決しない、慢性的な感染、感染 8 日後に 75% が負けます。初期好中球動員に重要な欠陥が発生する感染症の炎症期の 72 時間以上と 50 パーセントより少数の好中球は感染の後半段階で募集します。^-/-マウスは、この特定 MyD88 ひずみ現在に比べて黄色ブドウ球菌感染症をターゲットと新しい治療技術の有効性を評価するための厳格な前臨床モデル LysM EGFP × の感受性の増加モデルします。野生型マウス、特に感染に対する自然免疫応答を高めることを目指し技術を活用します。

プロトコル

すべてのマウスの研究を行った機関動物ケアとカリフォルニア大学デービス校で利用委員会によって承認され、動物福祉法と健康の研究延長行為のガイドラインに従って行われました。必ず動物を操作するときは、滅菌手袋を使用してください。

1. マウスのソースと住宅

1. 派生する LysM eGFP マウス c57bl/6 j の遺伝的背景に¹²を前述のよう。LysM EGFP × MyD88^-/-マウスで横断する LysM EGFP マウス c57bl/6 j 背景に MyD88^-/-マウスを派生します。
2. 家のマウス飼育箱で。これらの研究は、カリフォルニア大学デイビスと単一の建物次の外科の前にグループの動物で収容されました。10-16 週間の年齢間のマウスを使用します。

2. 細菌の準備と定量化

1. 削除、発光から-80 ° C の記憶域の氷の融解の興味の黄色ブドウ球菌のひずみ。5% ウシ血液寒天培地プレート上で止めた。縞板 37 ° C 一晩 (16 h) で加湿のインキュベーターで孵化させなさい。
   注: このプロトコル ALC2906 SH1000 ひずみが使用されました。この株には、 luxABCDE記者カセットPhotohabdus luminescens¹⁸から融合したペニシリン結合蛋白質 2 のプロモーターとのシャトル プラスミド pSK236 が含まれています。
2. TSB 粉末、純粋な水とオートクレーブ滅菌に TSB の mL あたり 0.03 g を混合することによってトリプシン大豆スープ (TSB) を準備します。冷却、生殖不能の技術を使用して、必要に応じて抗生物質を追加します。このプロトコルでは生物発光 luxABCDE カセットが含まれています pSK236 シャトル プラスミドの表現の選択に TSB にクロラムフェニ コール¹⁸の 10 μ G/ml を追加します。
3. 一晩かけて培養を開始する 10 μ G/ml のクロラムフェニ コールと TSB に黄色ブドウ球菌プレートから 3-4 独立したコロニーを拾います。37 ° C 一晩 (16 h) でインキュベーター シェーカーで細菌を孵化させなさい。
4. TSB に 10 μ g/mL クロラムフェニ コールで、サンプル 1:50 を薄めて一晩文化から新しい細菌の培養を開始します。200 rpm および 37 ° C でインキュベーター シェーカーの文化
5. 黄色ブドウ球菌を分割した後 2 時間監視光学密度 600 nm (外径₆₀₀) 分光光度計に。外径₆₀₀半ば対数相成長を見つけるために時間対を観察します。ALC2906 SH1000 株 0.5 の外径₆₀₀は中旬対数であり、1 × 10⁸ CFU/mL (図 1) の濃度に対応します。
6. 外径₆₀₀が 0.5 と、冷たい DPBS と 1:1 細菌を洗浄します。遠心分離機 3,000 x gと 4 ° C で 10 分間の細菌慎重に上清をデカントし、追加チルド DPBS と渦を徹底的に追加します。もう一度 3,000 x gと 4 ° C で 10 分間遠心
7. 上清をデカント慎重に。必要な濃度で細菌のペレットを再懸濁します。これらの研究の ALC2906 SH1000 3 mL を収集し、1.5 mL の PBS、約 2 × 10⁸ CFU/mL の細菌濃度に相関関係で再懸濁します。使用するまで氷の上の細菌を保ちます。
8. 細菌濃度を確認の細菌サンプル 1: 10,000、1: 100,000 の PBS 100 μ L を希釈します。寒天プレート 20 μ 因数。総検査で 37 ° c 16 h. カウント CFUs の加湿インキュベーターで孵化し、細菌濃度の次の日を計算します。

3. 切除皮膚傷害と黄色ブドウ球菌の接種

1. 0.03 mg/mL ブプレノルフィン塩酸塩 (~0.2 mg/kg) の 100 μ L を各腹腔内投与によるマウスに管理します。
2. 20 分後注入、2-4% イソフルランと 2-3 LPM 酸素と商工会議所の場所 2-4 マウス。マウスは完全に麻酔が、かつては、2-3 LPM 2-4% イソフルランと酸素に鼻の円錐形を一度に 1 つずつ接続してマウスを転送します。マウスは完全に各後部足の親指と人差し指の間をしっかりとつまんで麻酔確認してください。動物がピンチに応答しない場合は、次の手順に進みます。
3. マウスの背面に 2 インチのセクションで 1 インチを電気バリカンで剃るし、きれいなワイプやガーゼを使用して毛皮切り抜き領域をクリアします。過剰な炎症を引き起こす可能性があります脱毛ローションを使用しないでください。
4. きれいなマウスの戻る最初 10% ポビドン ヨードを浸したガーゼとし、70% エタノールを浸したガーゼ。外科領域の中心から外側へ移動、螺旋状の部分をきれいに。手術前に乾燥する外科の領域の約 1 分を待ちます。
5. 2 本の指の間に緩くマウス裏剃毛押しながらしっかりと準備の外科領域の中心に滅菌 6 mm のパンチ生検。ピンと張った皮膚が引っ張らないででした。
   1. アウトラインの少なくとも 1 つのセクションで皮膚を完全にカットのある皮膚に円形のアウトラインを作成するパンチ生検をねじる。基になる筋膜や組織を切らないように注意してください。
   2. 表皮と真皮パンチ生検によって捺印円形パターンをカットする滅菌はさみとピンセットを使用します。

4. s.球菌接種

1. 目的の生物発光の乳酸菌で 28 G インスリン注射器を満たしなさい。本研究では 1 × 10⁸ CFU/mL の濃度を管理 (50 μ L)。以上 100 μ L のボリュームを管理しないでください。
2. 筋膜とで、マウスの背中に傷の中心組織と乳酸菌の 50 μ L を注入します。乳酸菌が漏れを最小限または分散で傷の中心に気泡を形成することを確認します。
   1. 側に真皮をプル、注射器を組織にほぼ平行に持ち、筋膜の穿孔を示す抵抗の急激な減少が感じられるまで、組織に注射器をゆっくりとプッシュします。慎重に傷の中心に注射器をリードし、ゆっくりと乳酸菌を分配します。動物からゆっくりと注射器を削除します。
3. 上記のように感染していない動物の傷に滅菌 PBS の同じボリュームを挿入します。
4. 動物を檻に戻ります。熱ランプの下でまたは加熱パッドの上にケージを置き、麻酔から回復まで動物を監視します。

5、Vivo バリと FLI

1. 計測器のソフトウェアを介して全体の動物の撮像素子を初期化します。2-3 LPM 2-4% イソフルランと酸素を受けて商工会議所でマウスを麻酔します。撮像素子の内部 nosecones に麻酔を提供します。
2. 撮像素子に負傷者や感染したマウスを配置します。傷ができるだけ平らになるようにマウスを配置します。以下のシーケンス設定を使用して、マウスをイメージします。
   1. 画像のモードとして発光し、写真を選択します。露出時間は 1 分小さなビニングし F/ストップ 1 (発光) と F/停止 8 (写真)。排出フィルターはオープンです。画像を記録するには、取得をクリックします。
   2. 画像のモードとして蛍光と写真を選択します。露出時間は 1 s で小さなビニングと F/停止 1 (蛍光) と F/停止 8 (写真) 465/30 の励起波長 nm と高いランプの強度と発光波長 520/20 nm。画像を記録するには、取得をクリックします。
3. 動物を麻酔から回復までのケージとモニターに戻します。
4. イメージとしてのマウス毎日説明上記。

6. 画像解析

1. 開いている画像を定量化します。
2. 利益 (率 ROI) の大きな円形の領域を画像でそれぞれのマウスの皮膚を含めて全体の創傷部にかぶせます。好中球生体内信号の FLI EGFP と体内のバリ黄色ブドウ球菌信号の数日後傷の端を越えて拡張 (図 2 aおよび2 b) これらの研究に含まれていた。測定の投資収益率と各マウス乱流熱フラックスのレコードの値をクリックします。各信号 (p/s)対時間の乱流熱フラックスをプロットします。
3. 好中球や傷に黄色ブドウ球菌の絶対数が必要な場合は、次の実験を行います。
   1. 体内の FLI EGFP 信号に好中球数を関連付ける、前述のように、c57bl/6 j マウスを傷し、LysM EGFP または LysM EGFPxMyD88^-/-ドナーから骨髄由来の好中球 (1 x 10⁷⁵ 5 x 10) の範囲を転送直接上にさまざまな傷。イメージとして記載されている上記と相関体内 FLI EGFP は好中球の既知量に通知します。
   2. 体内のバリ信号黄色ブドウ球菌CFU を関連付ける、傷し、上記のマウスに感染します。1 日目感染後レコード生体内でバリの信号にマウスから、すぐに安楽死させる、死体を冷やしなさい。傷を切除、組織を均質化し、一晩インキュベートの寒天培地に細菌希釈液をプレートします。次の日、傷口あたり CFU の決定にコロニーをカウントします。
4. 傷のエッジと傷 (cm²) の測定領域を創傷治癒フィット円形 ROI を測定し、対時間 (図 2) のベースラインから分数変化をプロットします。

7. 統計

注:すべてのデータが表示されますを意味 ±SEM p < 0.05 は、統計的に有意と考えられていた。

1. ホルム Sidak メソッドを使用して 1 日に 2 つのグループ間の違いを決定する、α = 0.05、および一貫性のある SD を仮定しない時間の各ポイントを個別に分析
2. テューキーの多重比較, 事後に一方向の分散分析によって同じ日に複数のグループ間の違いを比較します。マントルピース コックスによる実験群間の生存率を調べた。

結果

LysM EGFP × MyD88^-/-マウスは LysM EGFP マウスよりも黄色ブドウ球菌感染症の影響を受けやすい

黄色ブドウ球菌における ALC2906¹⁸,使用のひずみは、ライブと積極的に代謝の細菌から発光信号を作り出すルクスコンストラクトを含むプラスミドで構成しました。マウスに接種した?...

ディスカッション

利用する発光黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌感染症モデル全体の動物インビボ光イメージング技術の高度な技術と組み合わせて蛍光好中球レポーター マウスの感染が生得の知識を高度な感染に対する免疫応答。LysM EGFP マウスを使った過去の研究はことを感染症の最初の 24 時間の上の黄色ブドウ球菌感染した傷口に 1 x 10⁷好中球リクルートに¹⁴、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352059
6 mm Disposable Biopsy Punch	Integra Miltex	33-36
Bioluminescent S. aureus	Lloyd Miller, Johns Hopkins	ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable	Western Medical Supply	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Labratory	000664
Chloramphenicol (crystalline powder)	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Insulin Syringes	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP Mice	Thomas Graff Albert Einstein College of New York	NA
Microvolume Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-2000
MyD88 KO Mice	Jackson Labratory	009088
Non-woven sponges	AMD- Ritmed Inc	A2101-CH	5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution	Aplicare	697731
Prism 7.0	GraphPad Software	License
Tryptic Soy Broth	Becton, Dickson and Company	211825