마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

요약

피부 부상에 타고 난 면역 반응의 실시간 탐지 및 쥐의 포도 상 구 균 감염에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 비교 LysM EGFP 여 쥐 (형광 neutrophils 보유) LysM EGFP와 잡종 immunodeficient 마우스 스트레인, 우리가 미리 감염에 대 한 우리의 이해 및 감염을 방지 하는 방법의 개발.

초록

황색 포도상구균 (S. 구 균) 감염, 메 티 실린 내성 얼룩을 포함 하 여 보건 의료 시스템에 대 한 엄청난 부담 있습니다. 매년 등반 S. 구 균 감염의 발병 률, 그것의 pathogenicity 추가 연구에 대 한 수요가 있다. 전염 성 질환의 동물 모델 호스트 병원 체 응답의 우리의 이해를 전진 하 고 효과적인 치료제의 개발으로 이어질. 호 중구는 감염 떨어져 벽 세균성 클리어런스; 촉진 하 농 양을 형성 하 여 S. 구 균 감염을 제어 하는 타고 난 면역 반응에서 기본 역 종종 S. 구 균 피부 감염을 침투 하는 호 중구 수가 질병 결과와 상관 한다. 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) Lysozyme M (LysM) 발기인 지역 (주로 호 중구에 의해 표현)에 삽입, 소유 하는 LysM EGFP 마우스와 함께에서 사용 될 때 vivo에서 전체 동물 형광 이미징 (FLI) 제공를 상처 입은 피부에 호 중구 이주 noninvasively 및 경도 측정을 의미 합니다. 발광 S. 구 균 과 결합 될 때 긴장과 순차적 vivo에서 전체 동물 발광 영상 (BLI), 그것은 경도 호 중구 모집 역학과의 사이트에서 vivo에서 세균성 부담 모니터링 가능 해상도 또는 죽음 감염의 발병에서 마 취 생쥐에 감염. 마우스는 더 효과적인 식민과 인간에서 감염을 촉진 하는 S. 구 균 에 의해 생산 독성 요인의 수를 방지. 영구 미 균 검사를 더 민감한 동물 모델을 제공 하는 immunodeficient 쥐 감염 및 치료의 능력을 타고 난 면역 반응 향상. 여기, 우리는 야생-타입 LysM EGFP 쥐 S. 구 균 피부 상처 감염 조사를 함께 MyD88 불충분 한 쥐 (LysM-EGFP × MyD88^-/- 생쥐) 자란 LysM EGFP 마우스에 응답을 특징. Multispectral 동시 탐지 vivo에서 FLI, vivo에서 씨를 사용 하 여 세균성 부담을 사용 하 여 호 중구 모집 역학의 연구를 활성화 하 고 상처 치유 경도 noninvasively 시간이 지남에.

서문

황색 포도상구균 (S. 구 균) 피부 및 연 조직 감염 (SSTIs) 미국¹의 대부분을 차지 한다. 발생률 감염 지난 2 년간², 지 속성의 메커니즘 및 새로운 치료 전략의 발견의 연구 동기 부여 동안 꾸준히 증가 메 티 실린 내성 S. 구 균 (MRSA)의. MRSA 감염에 대 한 치료의 표준 조직 항생제 치료, 하지만 시간³ MRSA 항생제에 저항력이 점점 되고있다 그리고 이러한 약물에 특히 부정적인 건강 효과 일으키는 호스트의 유익한 미생물을 점감 할 수 있다 아이 들⁴. 전 임상 연구⁵MRSA 감염 치료 하는 대체 전략 검사 하지만 번역 클리닉에 이러한 접근 호스트 면역 반응⁶저지 독성 요인의 출현으로 인해 어려운 입증 했다. 드라이브 미 균 SSTIs 호스트 병원 체 역학을 해 부, 우리 비 침범 성 결합 및 호 중구 수의 경도 판독 상처 침대에 세균성 풍부의 운동 측정을 가진 모집 영역 상처.

호 중구는 인간과 세균 감염⁷초 동 조치에서 가장 풍부한 순환 백혈구. 호 중구는 반응성 산소 종, 프로 테아 제, 항균 성 펩 티 드 및 기능적인 응답의 생산을 포함 하 여 그들의 살 균 메커니즘으로 인해 미 균 감염에 대 한 효과적인 호스트 응답에 대 한 필요한 구성 요소 식 균 작용 및 호 중구 extracellular 함정 생산^8,9를 포함 하 여. Chediak-히가시 증후군 등 만성 granulomatous 질환 호 중구 기능에 유전 결함을 가진 인간 환자는 S. 구 균 감염에 걸릴을 보여줍니다. 또한, 환자 유전자 (예: 선 천 성 호 중구 감소 증)와 인수 (예: 화학 요법 환자에서 호 중구 감소 증) 결함에 호 중구 수는 또한 S. 구 균 감염¹⁰에 매우 취약. 지우기 S. 구 균 감염에서 호 중구의 중요성을 감안할 때, 그들의 면역 능력을 강화 하거나 S. 구 균 병 변 내에서 그들의 숫자를 튜닝은 감염을 해결에 효과적인 전략을 증명할 수 있습니다.

지난 10 년간, 형광 호 중구 기자와 유전자 변형 쥐 그들의 밀매^11,12연구 개발 되었습니다. 호 중구 기자 마우스 전체 동물 이미징 기술을 결합 조직 및 장기에 호 중구의 spatiotemporal 분석을 허용 합니다. S. 구 균의 발광 종자와 결합 하면, S. 구 균 풍요에 대 한 응답에서 호 중구의 축적을 추적 하 고 세균 독성의 맥락에서 지 속성 요소는 직접 및 간접적으로 영향을 받는 조직^13,14,,1516호 중구 수 교란

마우스는 인간 보다 미 균 독성 및 면역 회피 메커니즘을 적습니다. 따라서, 야생-타입 마우스의 효능을 조사 하는 이상적인 동물 모델을 되지 않을 수 있습니다는 만성 S. 구 균 치료 치료 주어진 감염. MyD88 불충분 한 쥐 (즉, MyD88^-/- 생쥐), 부족 기능 interleukin-1 수용 체 (IL-1R) 및 통행세 같이 수용 체 (TLR) 신호, 표시 S. 구 균 감염에 비해 더 큰 민감성 immunocompromised 마우스 스트레인 야생-타입 마우스¹⁷ 그리고 피부¹⁸에 S. 구 균 감염의 사이트에 호 중구 매매에 장애. MyD88^-/- 생쥐에서 형광 호 중구 기자를 보유 하 고 있는 마우스 스트레인의 개발 조사 현재 neutrophil에 비해 S. 구 균 감염을 치료 하는 요법의 효능에 대 한 대체 모델을 제공 하고있다 기자 쥐입니다.

이 프로토콜에서 우리 immunocompromised LysM EGFP × MyD88^-/- 생쥐에서 S. 구 균 감염을 특성화 하 고 시간 과정 및 LysM EGFP 쥐과 감염의 해상도 비교. LysM-EGFP × MyD88^-/- 생쥐 해결 되지 않으면, 만성 감염을 개발 하 고 8 일 후 감염에 굴복 하는 75%. 초기 호 중구 채용에 중요 한 결함 발생의 감염, 염증 성 단계 이상 72 h 그리고 감염의 후반 단계에서 50% 적은 neutrophils 모집. LysM-EGFP × MyD88^-/- 생쥐에 게 특정 스트레인의 새로운 치료 기술 현재에 비해 S. 구 균 감염을 대상으로 효능을 평가 하는 엄격한 전 임상 모델의 증가 자화 율 모델을 야생-타입 쥐, 감염에 대 한 타고 난 면역 반응 향상을 목표로 특히 기법을 활용 합니다.

프로토콜

모든 마우스 연구 검토 되었다 기관 동물 관리 및 사용 위원회 UC 데이비스에 의해 승인 및 동물 복지 행위와 건강 연구 연장 행위의 지침에 따라 수행 했다. 동물 들과 함께 작업 하는 경우 멸 균 장갑을 사용 해야 합니다.

1. 마우스 소스 및 주택

1. LysM-eGFP 마우스 C57BL/6J 유전 배경에 파생¹²위에서 설명한 대로. LysM-EGFP × MyD88^-/- 마우스 C57BL/6J 배경에 MyD88^-/- 생쥐와 건너 LysM EGFP 쥐에 의해 파생 됩니다.
2. 집 마우스는 물고기에서. 이러한 연구에 대 한 동물, 수술 및 단일 지 내게 다음 수술 전에 그룹에 데이비스가 주 대학에 보관 되어 있었다. 10-16 주 사이의 마우스를 사용 합니다.

2. 세균성 준비 및 정량화

1. 제거는 발광 얼음 해 동-80 ° C 저장소에서 관심의 S. 구 균 긴장. 5% 소 혈액 한 천 배지에서 행진. 37 ° C에서 하룻밤 (16h) 습도 인큐베이터에서 질주 된 접시를 품 어.
   참고:이 프로토콜에서 ALC2906 SH1000 변형 사용 되었다. 이 긴장은 Photohabdus luminescens¹⁸ luxABCDE 기자 카세트를 융합 하는 페니실린 의무적인 단백질 2 모터와 셔틀 플라스 미드 pSK236를 포함 합니다.
2. 순수한 물, 그리고 오토 클레이 브 소독 하는 TSB의 mL 당 TSB 가루 0.03 g을 혼합 하 여 tryptic 간장 국물 (TSB)를 준비 합니다. 냉각 되 면, 모든 필요한 항생제 무 균 기술을 사용 하 여 추가 합니다. 이 프로토콜에서 생물 발광 luxABCDE 카세트 포함 된 pSK236 셔틀 플라스 미드의 표현에 대 한 선택 하는 TSB를 페니¹⁸ 10 µ g/mL를 추가 합니다.
3. TSB에 하룻밤 문화 시작 10 µ g/mL 페니와 S. 구 균 격판덮개에서 3-4 별도 식민지를 선택 합니다. 37 ° C에서 하룻밤 (16h) incubating 뿌리에 박테리아를 품 어.
4. 10 µ g/mL 페니와 TSB에 샘플 1시 50분을 diluting 하 여 하룻밤 문화에서 새로운 세균성 문화를 시작 합니다. 200 rpm와 37 ° C에서 incubating 셰이 커에 문화
5. S. 구 균을 분한 후 두 시간 모니터링 600에서 광학 밀도 분 광 광도 계에 nm (OD₆₀₀). OD₆₀₀ 대 중반 로그 단계 성장 찾는 데 시간을 관찰 합니다. ALC2906 SH1000 스트레인에 대 한 0.5 세₆₀₀ 중반 로그 이며 1 x 10⁸ CFU/mL (그림 1)의 농도에 해당 합니다.
6. OD₆₀₀ 0.5 이면 씻어 박테리아 얼음 DPBS와 1:1. 3000 x g 와 4 ° C에서 10 분 동안 박테리아 원심 신중 하 게 가만히 따르다는 상쾌한 고 추가 냉장된 DPBS와 소용돌이 철저 하 게 추가 합니다. G 와 4 ° C x 3000에서 10 분 동안 한 번 더 원심 분리기
7. 신중 하 게는 상쾌한을 가만히 따르다. 원하는 농도에 세균성 펠 릿을 resuspend. 이러한 연구에 대 한 ALC2906 SH1000 3 mL을 수집 하 고 1.5 ml PBS, 약 2 x 10⁸ CFU/mL의 세균 농도에 연관의 resuspend. 사용까지 얼음에 박테리아를 유지.
8. 박테리아 농도 확인 하려면 100 µ L 세균 샘플 1:10,000 및 1:100,000 PBS에 희석. 한 천 배지에서 20 µ L aliquots 플레이트. 총 검사 16 헤 수 CFUs에 대 한 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어 하 고 세균성 농도 다음 날을 계산.

3. excisional 피부 Wounding 및 S. 구 균 으로 접종

1. 복 주입을 통해 각 마우스를 0.03 mg/mL buprenorphine 염 산 염 (~0.2 mg/kg)의 100 µ L를 관리 합니다.
2. 20 분 후 주입, 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소 챔버에 장소 2-4 마우스 일단 마우스는 완전히 마 취, 코 콘을 한 번에 한 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소에 연결 된 마우스를 전송 합니다. 마우스는 완전히 단단히 각 후방 발 엄지와 집게 손가락 사이 곤란 하 게 하 여 마 취를 확인 합니다. 동물 핀치에 응답 하지 않는 경우 다음 단계를 진행 합니다.
3. 마우스의 뒷면에 2 인치 섹션 1 인치 전기 면도기로 면도 하 고 모피 잘라낸 깨끗 한 지우기 또는 거 즈를 사용 하 여 영역을 지웁니다. 초과 염증을 일으킬 수 있기 때문에 탈모 로션을 사용 하지 마십시오.
4. 깨끗 한 마우스의 뒤로 처음 10 %povidone-요오드 젖은 거 즈와 함께 다음 70% 에탄올 젖 었 거 즈. 나선형 패턴, 외과 영역의 중심에서 바깥쪽으로 이동 영역을 청소. 수술 전에 건조 외과 영역에 대 한 약 1 분을 기다립니다.
5. 두 손가락 사이 느슨하게 마우스 뒷면 면도 잡고 누르고 단단히 준비 외과 영역의 중앙에 살 균 6 m m 펀치 생 검. 당겨 하지 마십시오 피부 긴장 늦추지.
   1. 트위스트 원형 개요 개요의 적어도 한 부분에서 피부를 통해 완벽 하 게 인하 피부에 만들려고 펀치 생 검. 수 기본 근 막 또는 조직으로 잘라 하지 않도록 주의 하십시오.
   2. 살 균가 위와 집게를 사용 하 여 표 피와 진 피 펀치 생 검에 의해 각 인 원형 패턴을 통해 잘라.

4. 미 균 접종

1. 원하는 발광 세균 접종으로 28 G 인슐린 주사기를 채우십시오. 이 연구에서는 관리 1 x 10⁸ CFU/mL의 농도 (50 µ L). 볼륨의 이상의 100 µ L를 관리 하지 않습니다.
2. 마우스의 뒷면에 상처의 중심에 조직과 근 막 사이 접종의 50 µ L을 주입. 확인은 접종 최소한의 누설 또는 분산 상처의 중심에 거품을 형성 합니다.
   1. 진 피 쪽으로 당겨, 주사기는 조직에 거의 평행한 누른 저항에 갑자기 감소 느낌, 근 막의 피어 싱 하는 것을 나타내는 때까지 천천히 조직에 주사기를 밀어. 조심 스럽게 상처의 중심으로 주사기를 리드 하 고 천천히는 접종을 분배. 동물에서 주사기를 천천히 제거 합니다.
3. 위에서 설명한 대로 감염된 동물의 상처에 살 균 PBS의 동일한 볼륨을 삽입할.
4. 그것의 감 금에 있는 동물을 반환 합니다. 케이지 열 램프 아래에서 또는 열 패드 위에 놓고 마 취에서 회복까지 동물을 모니터링 합니다.

5.에 비보 씨 FLI

1. 악기 소프트웨어를 통해 전체 동물 영상을 초기화 합니다. 2-4 %isoflurane 2-3 LPM 산소를 받고 챔버에 마우스 anesthetize Nosecones는 영상 내부에 마 취를 제공 합니다.
2. 영상에 상처와 감염 된 마우스를 놓습니다. 상처는 가능한 평면 같은 마우스를 놓습니다. 다음 순서 대로 설치를 사용 하 여 이미지에 마우스를.
   1. 이미지 모드와 발광 고 사진을 선택 합니다. 노출 시간은 작은 binning와 F/중지 1 (발광)와 F/중지 8 (사진)에서 1 분입니다. 배기 필터는 열려있습니다. 이미지를 기록 하기 위해 취득 버튼을 클릭 합니다.
   2. 형광 및 사진 이미지 모드 선택 합니다. 노출 시간은 1 작은 binning 및 F/정지 1 (형광) s와 F/중지 8 (사진) 465/30의 여기 파장으로 nm와 높은 램프 강도 방출 파장 520/20 nm. 이미지를 기록 하기 위해 취득 버튼을 클릭 합니다.
3. 마 취에서 회복까지 그것의 감 금 소 및 모니터에 동물을 반환 합니다.
4. 이미지 마우스 매일 설명 대로 위의입니다.

6. 이미지 분석

1. 오픈 이미지를 측정할 수입니다.
2. 둘러싼 각 마우스 이미지에 대 한 피부를 포함 한 전체 상처 영역에 관심 (ROI)의 큰 원형 영역을 배치 합니다. Neutrophil vivo에서 FLI EGFP 신호 및 생체 조건 씨 미 균 신호 몇 일 후 상처 가장자리를 넘어 확장 하 고 이러한 연구 (그림 2A 와 2B)에 포함 됐다. 측정 ROI 와 각 마우스에 대 한 평균 유량에 대 한 레코드 값을 클릭 합니다. 각 시간 대 신호 (p/s)의 평균 유량을 플롯 합니다.
3. 호 중구 또는 S. 구 균 은 상처에서의 절대 숫자는 원하는 경우 다음과 같은 실험을 수행 합니다.
   1. 호 중구 수 FLI EGFP vivo에서 신호를 상관 관계, C57BL/6J 쥐, 위에서 설명한 대로 상처와 LysM EGFP 또는 LysM-EGFPxMyD88^-/- 기증자 로부터 골 수 파생 된 호 중구 (5 x 10⁵ 1 x 10⁷)의 범위를 전송 바로 위에 다른 상처. 이미지 설명으로 위의 상관 관계가 vivo에서 FLI EGFP 호 중구의 알려진된 수량을 신호 한다.
   2. S. 구 균 CFU vivo에서 라스 신호 상관 관계, 상처 하 고 위에서 설명한 대로 쥐를 감염. 하루에 1 감염 된 후 레코드 vivo에서 라스 신호 쥐에서 그리고 즉시 안락사 하 고 시체를 진정. 상처를 소비 세, 조직, 균질 하 고 접시에 야간 보육에 대 한 한 천 세균성 희석. 다음 날, 식민지 상처 당 CFU를 결정 하기 위해 계산 합니다.
4. 상처 가장자리와 상처 (cm²)의 측정 영역을 통해 상처 치유 맞는 원형 ROI를 측정 하 고 대 시간 (그림 2C) 기준에서 변화를 플롯.

7입니다. 통계

참고: 모든 데이터 표시 됩니다으로 의미 ±SEM. p < 0.05 통계적으로 간주 됐다

1. Holm Sidak 메서드를 사용 하 여 하루에 두 그룹 간의 차이점을 결정, 알파 = 0.05, 그리고 일관 된 sd. 가정 없이 각 시간 포인트를 개별적으로 분석 하는 방법
2. Tukey 다중 비교 posttest 가진 일방통행 ANOVA에 의해 같은 날에 여러 그룹 간의 차이점을 비교 합니다. 실험 그룹 간의 생존 벽난로 콕스 방법으로 분석 했다.

결과

LysM-EGFP × MyD88^-/- 생쥐는 LysM EGFP 마우스 보다 S. 구 균 감염에 더 취약

S. 구 균 이 연구, ALC2906¹⁸, 에 사용 된의 스트레인 라이브 하 고 적극적으로 metabolizing 박테리아에서 발광 신호를 생성 하는 럭 스 구조를 포함 하는 플라스 미드와 함께 건설 되었다. 쥐에 주사 하는 경우 경도...

토론

S. 구 균 감염 모델 발광 S. 구 균 을 활용 하는 전체 동물 vivo에서 광학 이미징의 고급 기술 함께에서 형광 호 중구 기자 마우스에서 감염 고급는 타고 난의 우리의 지식을 감염에 면역 반응입니다. 이전 LysM EGFP 마우스를 사용 하 여 연구는 최대 S. 구 균 감염 된 상처를 감염의 첫 24 시간 동안을 1 x 10⁷ 호 중구 모집¹⁴, 그리고 상처 모집 neutrophils 확장 그?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352059
6 mm Disposable Biopsy Punch	Integra Miltex	33-36
Bioluminescent S. aureus	Lloyd Miller, Johns Hopkins	ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable	Western Medical Supply	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Labratory	000664
Chloramphenicol (crystalline powder)	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Insulin Syringes	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP Mice	Thomas Graff Albert Einstein College of New York	NA
Microvolume Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-2000
MyD88 KO Mice	Jackson Labratory	009088
Non-woven sponges	AMD- Ritmed Inc	A2101-CH	5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution	Aplicare	697731
Prism 7.0	GraphPad Software	License
Tryptic Soy Broth	Becton, Dickson and Company	211825