Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Resumen

Se describe un enfoque para la detección en tiempo real de la respuesta inmune innata a heridas cutáneas y la infección de Staphylococcus aureus de los ratones. Por que comparan LysM-EGFP ratones (que poseen fluorescentes neutrófilos) con un LysM-EGFP mestizas cepa de ratón inmunodeficiente, avanzar en nuestra comprensión de la infección y el desarrollo de enfoques para combatir la infección.

Resumen

Staphylococcus aureus Infecciones (S. aureus), incluyendo las manchas resistentes a la meticilina, son una enorme carga en el sistema de salud. Con tasas de incidencia de infección de S. aureus que sube anualmente, hay una demanda para la investigación adicional en su patogenicidad. Modelos animales de enfermedades infecciosas avanzan nuestro entendimiento de la respuesta del huésped-patógeno y conducen al desarrollo de la terapéutica eficaz. Neutrófilos juegan un papel primario en la respuesta inmune innata que controla las infecciones de S. aureus mediante la formación de un absceso de la pared la infección y facilitar la remoción bacteriana; el número de neutrófilos que infiltran a menudo una infección de la piel de S. aureus se correlaciona con el resultado de la enfermedad. Ratones LysM-EGFP, que poseen la mayor proteína verde fluorescente (EGFP) en la región del promotor lisozima M (LysM) (expresada sobre todo por los neutrófilos), cuando se utiliza junto con imágenes de fluorescencia de todo animal en vivo (FLI) proporcionan un medio de cuantificar la emigración de neutrófila no invasor y longitudinalmente en la piel herida. Cuando se combina con un bioluminiscente S. aureus cepa y secuencial en vivo todo animal bioluminiscente la proyección de imagen (BLI), es posible monitorizar longitudinalmente la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en vivo en el sitio de infección en ratones anestesiados de aparición de la infección a la resolución o la muerte. Los ratones son más resistentes a un número de factores de virulencia de S. aureus que facilitan la efectiva colonización y la infección en seres humanos. Ratones inmunodeficientes son un modelo animal más sensible para examinar persistente S. aureus las infecciones y la capacidad de la terapéutica para estimular la respuesta inmune innata. Aquí, se caracterizan las respuestas en ratones LysM-EGFP que han sido criados a los ratones deficientes en MyD88 (EGFP LysM × MyD88^{- / -} ratones) junto con ratones de tipo salvaje LysM-EGFP investigar S. aureus piel infección de la herida. Detección simultánea multiespectral había habilitado estudio de dinámica de reclutamiento de neutrófilos mediante el uso de FLI en vivo, carga bacteriana mediante el uso de BLI en vivo y cicatrización longitudinalmente y no invasor con el tiempo.

Introducción

Staphylococcus aureus (S. aureus) representa la mayoría de la piel y las infecciones de tejidos blandos (SETSI) en los Estados Unidos¹. La incidencia de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecciones ha aumentado constantemente en los últimos dos décadas², motivar el estudio de los mecanismos de persistencia y el descubrimiento de nuevas estrategias de tratamiento. El estándar del cuidado para las infecciones de MRSA es la terapia antibiótico sistémica, pero MRSA se ha convertido en cada vez más resistente a los antibióticos en tiempo³ y estas drogas pueden disminuir la microbioma beneficiosos del anfitrión, causando efectos negativos en la salud, especialmente en los niños⁴. Estudios preclínicos han examinado estrategias alternativas para el tratamiento de las infecciones de MRSA⁵, pero traducir estos enfoques a la clínica ha demostrado ser un reto debido a la aparición de factores de virulencia que frustrar anfitrión inmunorespuestas⁶. Para diseccionar la dinámica huésped-patógeno que impulsan S. aureus SETSI, combinamos no invasiva y longitudinales lecturas del número de neutrófilos reclutaron al lecho de la herida con medidas cinéticas de la abundancia bacteriana y área de la herida.

Neutrófilos son los leucocitos circulantes más abundantes en los seres humanos y los primeros respondientes a una infección bacteriana⁷. Neutrófilos son un componente necesario para una respuesta eficaz del anfitrión contra infecciones por S. aureus debido a sus mecanismos bactericidas, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno, proteasas, péptidos antimicrobianos y respuestas funcionales como fagocitosis neutrófilo trampa extracelular producción^8,9. Pacientes humanos con defectos genéticos en la función del neutrófilo, como el síndrome de Chediak-Higashi, enfermedad granulomatosa crónica muestran una mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus . Además, los pacientes con genética (como la neutropenia congénita) y adquiridas (como la neutropenia en pacientes de la quimioterapia) defectos en los números de neutrófilos también son altamente susceptibles a la infección de S. aureus ¹⁰. Dada la importancia de los neutrófilos en la limpieza de las infecciones de S. aureus , potenciar su capacidad inmune o templar sus números dentro de una lesión de S. aureus puede resultar una estrategia eficaz en la resolución de la infección.

En la última década, se han desarrollado ratones transgénicos con reporteros neutrófilo fluorescencia para estudiar su tráfico de^11,12. Combinación de ratones reportero neutrófilo con técnicas de imagen todo animales permite análisis espacio-temporales de los neutrófilos en los tejidos y órganos. Cuando se combina con bioluminiscentes cepas de S. aureus, es posible rastrear la acumulación de neutrófilos en respuesta a la abundancia de S. aureus y persistencia en el contexto de la virulencia bacteriana factores que directa e indirectamente perturbar el número de neutrófilo en el tejido afectado^13,14,15,16.

Los ratones son menos susceptibles a S. aureus virulencia e inmune mecanismos de evasión que los seres humanos. Como tal, ratones de tipo salvaje no pueden ser un modelo animal ideal para investigar la eficacia de un dado terapéutica para el tratamiento crónico de S. aureus la infección. Ratones deficientes en MyD88 (es decir, MyD88^{- / -} ratones), una cepa de ratón immunocompromised que carece de receptores funcionales de interleukin-1 (IL-1R) y Toll-like receptor (TLR) de señalización, mostrar mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus en comparación con ratones de tipo salvaje¹⁷ y un deterioro en el tráfico de neutrófilos al sitio de la infección de S. aureus en la piel¹⁸. Desarrollo de una cepa de ratón que posee un reportero fluorescente neutrófilo en ratones^{- / -} MyD88 ha proporcionado un modelo alternativo para la investigación de la eficacia de terapias para tratar la infección de S. aureus en comparación con el actual recuento de neutrófilos ratones de reportero.

En este protocolo, caracterizan a la infección de S. aureus en los inmunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88^{- / -} ratones y comparar la evolución temporal y la resolución de la infección con los ratones LysM-EGFP. MyD88^{- / -} ratones de EGFP LysM × desarrollan una infección crónica que no se resuelve, y 75% sucumben a la infección después de 8 días. Un defecto importante en el reclutamiento inicial de neutrófilo ocurre más de 72 h de la fase inflamatoria de la infección, y reclutan neutrófilos de menos de 50% durante la última etapa de la infección. El aumento de la susceptibilidad del × LysM-EGFP MyD88^{- / -} ratones hace que este particular colar un riguroso modelo preclínico para evaluar la eficacia de nuevas técnicas terapéuticas dirigidas a la infección por S. aureus en comparación con el actual modelos utilizar ratones de tipo salvaje, especialmente las técnicas con el objetivo de potenciar la respuesta inmune innata contra la infección.

Protocolo

Se revisaron todos los estudios del ratón fueron realizados según los lineamientos de la ley de Bienestar Animal y la ley de extensión de investigación de salud y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso en UC Davis. Asegúrese de usar guantes estériles cuando se trabaja con animales.

1. ratón fuente y vivienda

1. EGFP LysM ratones en un fondo genético de C57BL/6J se derivan como se describió anteriormente¹². Derivan LysM-EGFP × MyD88^{- / -} ratones por los ratones de EGFP LysM cruce con MyD88^{- / -} los ratones sobre un fondo de C57BL/6J.
2. Ratones de la casa en un vivero. Para estos estudios, los animales fueron alojados en la Universidad de California, Davis en grupos antes de la cirugía y solo ubicado después de la cirugía. Utilizar ratones entre las edades de 10-16 semanas.

2. cuantificación y preparación bacteriana

1. Quitar el bioluminiscente S. aureus cepa de interés de-80 ° C almacenamiento para descongelar el hielo. Rayado en una placa de agar sangre bovina 5%. Incube la placa veteada en un incubador humedecido a 37 ° C durante la noche (16 h).
   Nota: En el presente Protocolo, se utilizó la cepa SH1000 ALC2906. Esta cepa contiene el servicio de transporte al plásmido pSK236 con el promotor de la proteína de unión a penicilina 2 fusionado en el casete de reportero luxABCDE de Photohabdus luminescens¹⁸.
2. Preparar el caldo de soja tríptica (TSB) mezclando 0,03 g de polvo TSB por mL de agua pura y autoclave TSB para esterilizar. Cuando haya enfriado, añadir algún antibiótico necesario utilizando una técnica estéril. En este protocolo, añadir 10 μg/mL de cloranfenicol¹⁸ al TSB para seleccionar para la expresión del plásmido pSK236 de transporte, que contiene el cartucho de luxABCDE de bioluminiscencia.
3. Selección de colonias separadas 3-4 de la placa de S. aureus en TSB con 10 cloranfenicol μg/mL para iniciar una cultura de la noche a la mañana. Incubar las bacterias en un agitador de incubación a 37 ° C durante la noche (16 h).
4. Iniciar un nuevo cultivo bacteriano de la cultura durante la noche diluyendo una muestra 1:50 en TSB con 10 cloranfenicol μg/mL. Cultura en una incubación agitador a 200 rpm y 37 ° C.
5. Dos horas después de partir el S. aureus, monitorear la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) en un espectrofotómetro. Observar el OD₆₀₀ vs tiempo para encontrar medio logarítmicos de la fase de crecimiento. Para la cepa de ALC2906 SH1000, un OD₆₀₀ de 0.5 es medio logarítmicos y corresponde a una concentración de 1 x 10⁸ UFC/mL (figura 1).
6. Cuando OD₆₀₀ es de 0,5, lave las bacterias 1:1 con DPBS helada. Centrifugue las bacterias durante 10 minutos a 3.000 x g a 4 ° C. Cuidadosamente decantar el sobrenadante y agregar adicional DPBS fría y agitar bien. Centrífuga una vez más durante 10 minutos a 3.000 x g a 4 ° C.
7. Decantar con cuidado el sobrenadante. Resuspender el precipitado bacteriano a una concentración deseada. Para estos estudios, recoger 3 mL de ALC2906 SH1000 y resuspender en 1,5 mL de PBS, correlacionando a una concentración de bacterias de unos 2 x 10⁸ UFC/mL. No bacterias en hielo hasta su uso.
8. Para verificar la concentración de bacterias, diluir 100 μl de la muestra bacteriana 1: 10,000 y 1: 100.000 en PBS. Alícuotas de la placa 20 μl en una placa de agar. Incubar a 37 ° C en una incubadora humidificada por 16 h. recuento de UFC por examen macroscópico y calcular una concentración bacteriana al día siguiente.

3. la piel herir e inoculación con S. aureus

1. Administrar 100 μl de clorhidrato de buprenorfina de 0.03 mg/mL (~0.2 mg/kg) para cada ratón mediante inyección intraperitoneal.
2. Veinte minutos después de la inyección, lugar 2-4 ratones en una cámara con oxígeno 2-3 LPM con 2-4% de isoflurano. Una vez que los ratones están completamente anestesiados, transferir los ratones uno a la vez a un cono de nariz conectada a oxígeno de 2-3 LPM con 2-4% de isoflurano. Verificar ratones están completamente anestesiados firmemente pellizcando cada pata trasera entre un pulgar y el índice. Proceder al siguiente paso si el animal no responde a la pizca.
3. Afeitarse una 1 pulgada de sección de 2 pulgadas en la parte posterior del ratón con Tijeras eléctricas y despeje la zona de recortes de piel usando un trapo limpio o una gasa. Evitar el uso de crema depilatoria ya que puede causar inflamación excesiva.
4. Limpiar la parte posterior del ratón primero con una gasa empapada povidona-yodo al 10% y luego con un 70% de etanol había empapado gasa. Limpie la superficie en un patrón espiral, moviéndose hacia afuera desde el centro del área quirúrgica. Espere aproximadamente 1 minuto para el área quirúrgico se seque antes de la cirugía.
5. Sostenga el afeitado la parte trasera del ratón libremente entre dos dedos y presione firmemente una biopsia del sacador estéril 6 mm en el centro de la zona quirúrgica preparada. No tire la piel tensa.
   1. La biopsia del sacador para crear un contorno circular en la piel que corta completamente a través de la piel en al menos una sección del contorno de la torcedura. Tenga cuidado de no cortar la fascia o tejido subyacente.
   2. Utilizar tijeras estériles y pinza para cortar a través de la epidermis y dermis siguiendo el patrón circular impreso por la biopsia del sacador.

4. S. aureus la inoculación

1. Llene una jeringa de insulina 28 G con el inoculante bacteriano bioluminiscente deseado. En este estudio, administrar una concentración de 1 x 10⁸ UFC/mL (50 μL). No administrar más de 100 μl de volumen.
2. Inyectar 50 μl de inoculante entre la fascia y el tejido en el centro de la herida en la parte trasera del ratón. Asegúrese de que el inoculante forma una burbuja en el centro de la herida con un mínimo de fuga o dispersión.
   1. Tire de la dermis al lado, sostenga la jeringa casi paralelo al tejido y empuje lentamente la jeringa en el tejido hasta que sienta una disminución súbita en la resistencia, que indica la perforación de la fascia. Con cuidado llevar la jeringa en el centro de la herida y dispensar el inoculante lentamente. Retire la jeringa poco a poco el animal.
3. Inyectar el mismo volumen de PBS estéril en las heridas de los animales no infectados, como se describe anteriormente.
4. Devolver el animal a su jaula. Coloque la jaula bajo una lámpara de calor o sobre una almohada y controlar al animal hasta la recuperación de la anestesia.

5. en Vivo BLI y FLI

1. Inicializar el conjunto animal reproductor de imágenes a través del software del instrumento. Anestesiar ratones en una cámara de recibir oxígeno de 2-3 LPM con 2-4% de isoflurano. Entregar anestesia a los nosecones dentro del reproductor de imágenes.
2. Coloque el ratón herido e infectado en el reproductor de imágenes. Coloque el ratón que la herida es tan plana como sea posible. Utilice la siguiente configuración de secuencia para los ratones de la imagen.
   1. Seleccione la luminiscencia y la fotografía como modo de proyección de imagen. El tiempo de exposición es de 1 minuto en binning pequeño y F/stop 1 (luminiscencia) y F/stop 8 (fotografía). El filtro de emisión está abierto. Haga clic en el botón adquirir para grabar la imagen.
   2. Seleccione la fluorescencia y la fotografía como modo de proyección de imagen. El tiempo de exposición es 1 s con pequeño binning y F/stop 1 (fluorescencia) y F/stop 8 (fotografía) con una longitud de onda de excitación de 465/30 nm y una emisión longitud de onda 520/20 nm con una intensidad alta de la lámpara. Haga clic en el botón adquirir para grabar la imagen.
3. Devolver el animal a su jaula y monitor hasta recuperación de la anestesia.
4. Imagen ratones diariamente como se describe arriba.

6. Análisis de la imagen

1. Imágenes abiertas a cuantificarse.
2. Coloque una región circular grande de interés (ROI) sobre el área de la herida todo incluyendo piel para cada ratón en la imagen circundante. El neutrófilo en vivo que FLI EGFP señales y señales en vivo de BLI S. aureus se extienden más allá del borde de la herida después de varios días y se incluyeron en estos estudios (figura 2A y 2B). Haga clic en Medida de retorno de la inversión y valores de registros de flujo promedio para cada ratón. Trazar el flujo promedio de cada señal (p+s) versus tiempo.
3. Si se desean que los números absolutos de neutrófilos o S. aureus en la herida, realizar los siguientes experimentos.
   1. Para correlacionar el neutrófilos números a las señales en vivo de FLI EGFP, ratones C57BL/6J como se describió anteriormente la herida y transferencia de una gama de médula ósea de neutrófilos (5 x 10⁵ a 1 x 10⁷) de EGFP LysM o LysM-EGFPxMyD88^{- / -} donantes directamente sobre las heridas diferentes. Imagen tal como se describe arriba y correlación la EGFP FLI en vivo señales a la cantidad conocida de neutrófilos.
   2. Para S. aureus UFC se correlacionan con las señales en vivo de BLI, herida e infectar ratones como se describió anteriormente. Día 1 post-infección registro en vivo BLI las señales de los ratones y de inmediato eutanasia y enfriar las canales. Suprimir la herida, homogeneizar el tejido y placa bacterianas diluciones en agar para la incubación de noche. Al día siguiente, contar las colonias para determinar UFC por herida.
4. Para medir la herida curativo ajuste un ROI circular sobre el borde de la herida y medir el área de la herida (cm²) y el cambio fraccional de la línea de base versus tiempo (figura 2).

7. estadísticas

Nota: Todos los datos se presentan como media ±SEM. p < 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos

1. Determinar las diferencias entre dos grupos en un solo día mediante el método de Holm-Sidak, con alfa = 0.05 y analizar cada punto del tiempo individualmente, sin asumir una SD compatible
2. Comparar las diferencias entre varios grupos el mismo día por ANOVA unidireccional con el postest de comparaciones múltiples de Tukey. Supervivencia entre los grupos experimentales se analizó por el método de Mantel-Cox.

Resultados

MyD88^{- / -} ratones de EGFP LysM × son más susceptibles a la infección por S. aureus que ratones LysM-EGFP

La cepa de S. aureus utilizados en este estudio, ALC2906¹⁸, fue construido con un plásmido que contiene el concepto de lux que produce señales bioluminiscentes de bacteria metabolizante activamente y en vivo. Cuando se inocula en ratones, bioluminiscenc...

Discusión

Modelos de infección de S. aureus que utilizan bioluminiscente S. aureus la infección en un ratón fluorescente reportera neutrófilo junto con técnicas avanzadas de proyección de imagen óptica in vivo todo animal ha avanzado nuestro conocimiento de lo innato respuesta inmune a la infección. Estudios anteriores utilizando el ratón LysM-EGFP han demostrado que hasta 1 x 10⁷ neutrófilos recluta a una herida infectada de S. aureus en las primeras 24 h de infección

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Falcon	352059
6 mm Disposable Biopsy Punch	Integra Miltex	33-36
Bioluminescent S. aureus	Lloyd Miller, Johns Hopkins	ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable	Western Medical Supply	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice	Jackson Labratory	000664
Chloramphenicol (crystalline powder)	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Insulin Syringes	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP Mice	Thomas Graff Albert Einstein College of New York	NA
Microvolume Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-2000
MyD88 KO Mice	Jackson Labratory	009088
Non-woven sponges	AMD- Ritmed Inc	A2101-CH	5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution	Aplicare	697731
Prism 7.0	GraphPad Software	License
Tryptic Soy Broth	Becton, Dickson and Company	211825