硫醇反应试剂的合成与生物共轭作用--用于原位选择性修饰免疫共轭的生成

摘要

在本议定书中, 我们将描述 pods 的合成, 这是一种基于苯氧二唑基甲基磺酸试剂的合成, 用于将货物选择性地附着在生物分子的硫醇中, 特别是抗体中。此外, 我们将描述含有 pod 的双官能螯合剂的合成和表征及其与模型抗体的结合。

摘要

含锂双功能探针已被用于生物分子中硫醇的现场选择性修饰, 特别是抗体。然而, 基于马来酰亚胺的共轭在体内表现出有限的稳定性, 因为琥珀酰硫醚结合可以经历迈克尔的反性反应。当然, 这可能导致放射性有效载荷的释放或与流通中的带有硫醇的生物分子的交换。这两种过程都能在健康器官中产生较高的活性浓度, 并降低目标组织中的活性浓度, 从而降低影像学对比度, 降低治疗率。2018年, 我们报告了一种模块化、稳定且易于获得的苯氧基甲基磺酸试剂 (称为 "pods"), 作为基于硫醇的生物共轭平台。我们已经清楚地证明, 基于 pod 的位点选择性生物共轭可重现性和强大地创建均匀性, 明确定义, 高度免疫反应, 和高度稳定的放射免疫共轭。此外, 在大肠癌小鼠模型的临床前实验表明, 这些位点选择性标记的放射免疫共轭物在体内表现出的性能远远优于通过马来化症合成的放射性标记抗体共轭。在该协议中, 我们将描述 dods 的四步合成, 制备的双功能的 dods 轴承变种的无处不在的螯合物 dota (dods-dota), 以及 dods-dota 与 her2 靶向抗体 trastuzumab 的共轭。

引言

长期以来, 放射性药物化学家一直在利用疾病生物标志物抗体的选择性和特异性用于核成像和靶向放射治疗¹。抗体的放射标记最常见的方法是基于放射性标记的假体群或放射性螯合剂不加区别地附着在免疫球蛋白结构中的氨基酸--通常是赖氨酸 (图 1a)²。虽然这种策略肯定是有效的, 但其随机的、非特定地点的性质会造成问题。具体而言, 传统的生物共轭方法产生定义差和异质性的免疫共轭, 由成千上万种不同的区域异构体的混合物组成, 每个物质具有自己的生物和药理特性^{集 3}。此外, 如果将货物附加到免疫球蛋白的抗原结合域, 随机生物共轭会阻碍抗体的免疫反应。

多年来, 为解决这些问题, 制定了各种特定地点和场地选择性的生物结合战略^4、5.其中最常见的方法是将含马来酰亚胺探针连接到半胱氨酸的磺基 (图 1b)。igg1 抗体自然含有4个链间二硫基桥, 这些连接可以选择性地减少, 产生自由的硫醇, 能够与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应, 形成琥珀酰硫醚键。与传统方法相比, 硫醇和马来酰亚胺的使用无疑是一种改进, 目前有各种各样的含苹果胺的合成器和双功能螯合剂。然而, 必须指出, 这种方法也有严重的局限性。基于马来酰的免疫共轭物在体内表现出有限的稳定性, 因为硫醚链可以经历迈克尔的反应 (图 2)^6,7,8,9,10. 当然, 这可能导致放射性有效载荷的释放或与循环中的带有硫醇的生物分子 (例如谷胱甘肽或血清白蛋白) 的交换。这两种过程都可以增加健康器官中的活性浓度, 并降低目标组织中的活性浓度, 从而降低影像学对比度和治疗率。为了规避这些问题, 开发了几种替代硫醇反应试剂, 包括托基酸盐、溴化和碘乙酰, 以及11、^12、13乙烯基磺酸^.14,15,16,17. 然而, 所有这些办法都有其局限性, 妨碍了其广泛适用。

大约五年前, 斯克里普斯研究所已故卡洛斯·巴巴三世的实验室率先使用苯氧基二唑基甲基磺酸作为试剂, 有选择地与硫醇形成高度稳定的联系 (图1c 和图 3)^18,19. 作者使用了一种含苯氧基甲基磺酸的荧光素变种来修饰几种抗体, 这些抗体设计成含有游离半胱氨酸残基, 最终产生的免疫共轭具有比类似的更高的稳定性。使用基于恶意的探测器创建的构造。看到这项很有前途的工作, 我们感到有些惊讶, 因为这项技术只在放射化学中很少使用, 还没有被用于双功能螯合剂或放射免疫共轭 20^,21的合成.然而, 由于应用不足, 很快就开始变得更加有意义: 几次试图从 sigma-aldrich 采购试剂的努力, 结果收到了复杂的降解产物混合物, 并将所需化合物的 lt;15%。此外, 合成所报告的试剂本身也不是一个现实的选择, 因为公布的合成路线有些繁琐, 需要精密的有机化学设备, 而大多数放射化学和分子成像实验室--包括我们的实验室--根本不拥有。

针对这些障碍, 我们着手创建一种易于获取且高度稳定的苯氧基甲基磺酸试剂, 可通过坚固且合理、简单的合成路线获得。今年早些时候, 我们报告了一种模块化、稳定且易于获得的苯氧基甲基磺酸试剂 (称为 "pods"), 作为基于硫醇的生物共轭平台 (图1c 和图 3)²²。peds 与 barbas 等人报告的试剂之间的主要区别是, 前者使用的是附着在苯氧基磺酸的苯胺环上, 而后者的特点是处于同一位置的苯酚 (图 4)。这一变化促进了更直接、更容易获得的合成路线, 以及--如果我们在商业上可获得的化合物方面的经验具有代表性--更稳定的最终试剂。在这项工作中, 我们还合成了一对含 pods 双功能螯合剂--pods-dfo 和 pods-chx-a '-dtpa--分别用于创建⁸⁹zr 标记和¹⁷⁷lu-taid 免疫共轭。正如我们将要讨论的, 我们已经证明, 基于 pod 的位选择生物共轭可重复和强大地创建均匀, 明确的, 高度免疫反应, 和高度稳定的放射免疫共轭。此外, 大肠癌小鼠模型的临床前实验表明, 与通过马来所合成的放射性标记抗体相比, 这些位点选择性标记的放射免疫共轭在体内表现出优越的性能。共轭。

这项工作的首要目标是促进创建定义明确、均匀、高度稳定和高度免疫反应的免疫共轭, 用于体外和体内应用。合成方法很简单, 几乎可以在任何实验室进行, 并且母 pds 试剂可以用大量不同的螯合剂、荧光剂或货物进行改性。在本协议和随附的视频中, 我们将描述简单的四步合成 peds (图 5);创建一个携带 dods 的 dota 变种, 这是一种广泛使用的螯合剂, 用于协调⁶⁴cu、 ⁶⁸ga 、111 in、 ¹⁷⁷lu 和²²⁵ac (图 6);以及 dods-dota 与模型抗体 her2 靶向 igg1 trastuzumab 的生物结合 (图 7)。

研究方案

1. 4-[5-(甲基硫磷)-1, 3, 4-恶二唑-2-基]-苯胺的合成 (1)

注: 由于化合物的感光度, 请将所有反应保存在被箔覆盖的容器中。

1. 在10毫升圆形底瓶中, 溶解100毫克 (0.517 mmol, 1 当量) 5-(4-氨基苯基)-1, 3, 4-二亚唑-2-硫醇在3毫升甲醇。
2. 在该溶液中, 加入360μl 的二异丙基乙胺 (dipea; 2.07 mmol; 4 当量; 无水) 和一个小磁搅拌杆。用橡胶塞子盖上烧瓶, 在室温下搅拌溶液10分钟。
3. 使用1毫升玻璃注射器, 在橡胶塞子中戳一个孔, 并在这种混合物中快速添加 32μl (0.517 mmol, 1 当量) 的碘甲烷。让混合物在室温下反应45分钟。
   注: 由于碘甲烷的潜在有害影响, 这种反应应在化学烟罩中进行。
4. 将旋转蒸发器的水浴设置为40°c , 并慢慢降低压力, 去除溶剂以提供白色固体。
5. 用分离漏斗用 0.1 m 碳酸钠的5毫升溶液将固体溶解在乙酸乙酯3毫升中至少三次。
   注: 定期对紫外线灯下的水相进行现场测试;一旦灯下什么也看不见, 你就可以停止洗。
6. 在分离漏斗中收集有机相, 用清水清洗, 直到水相的 ph 值达到 6.8-7.0 (使用 ph 纸)。
7. 收集有机相, 加入硫酸镁, 去除任何水的痕迹。
   注: 硫酸镁应添加一个小铲子, 之后溶液应旋转。如果仍然看到干燥剂的细颗粒, 溶液是干燥的。如果没有, 添加少量的硫酸镁, 直到可以看到细颗粒。
8. 使用中玻璃炸纸或滤纸过滤混合物。
9. 使用旋转蒸发器蒸发挥发物, 该过程应产生所需的产品作为白色针头。

2. butyl[18-({4-[5-(甲基硫磷)-1, 3, 4-恶二唑-2-基] 苯叫做氨基)-15, 18-二氧基 4, 7, 10 三氧基-14-azaoctadicyl] 氨基甲酸酯 (2)

注: 由于化合物的感光度, 请将所有反应保存在被箔覆盖的容器中。

1. 在25毫升圆形底瓶中, 溶解387毫克 (0.92 mmol, 1.0 当量) 的 nboc-n '-琥珀-4, 7, 10 三氧分析-1, 13-三苯胺在10毫升的二氯甲烷中。
2. 对于此解决方案, 加入 480μl (2.76 mmol, 3 等效) 的 dimethylamino, 264 毫克 (1.38 mmol; 1.5 当量) n-乙基-n '-[3-(二甲胺) 丙基] 盐酸二酰亚胺 (edci), 200 毫克 (0.97 mmol, 1.1 当量) 1 。用玻璃塞子密封容器, 让反应在室温下搅拌5天。
   注: 请注意二氯甲烷的蒸发。如果需要, 在整个一周内添加更多内容。
3. 用1m 盐酸 (3 x 5 毫升) 溶液在分离漏斗中清洗混合物。
4. 收集有机相, 并继续在分离漏斗中清洗, 首先使用 1 m na₂co 3 (2 x 5 ml)的溶液, 然后用水 (3 x 5 ml)。
5. 收集有机相并添加硫酸镁以去除任何水的痕迹 (参见步骤 1.7)。使用中玻璃炸纸或滤纸过滤混合物。
6. 使用旋转蒸发器, 在降低压力的情况下去除挥发性溶剂, 以提供非白色固体。
7. 将这种固体重新溶解在乙酸乙酯的10毫升中, 并通过逐渐 (例如, 一次2毫升) 添加30毫升的环已烷来沉淀产物。
8. 用滤纸或中玻璃炸薯条过滤溶液, 使产品成为白色粉末。

3. butyl[18-({4-[5-(甲基磺基)-1, 3, 4-恶二唑-2-基] 苯基氨基)-15, 18-dix防-4, 7, 10-trioxa-14-azaoctadecyl] 氨基甲酸酯 (3)

注: 由于化合物的感光度, 请将所有反应保存在被箔覆盖的容器中。

1. 在10毫升的圆底瓶中, 溶解30毫克 (0.05 mmol; 1 当量) 的2在4毫升的二氯甲烷中。
2. 慢慢加入49毫克 (0.2 mmol; 4 当量) 的 70% m-氯苯甲酸到这种混合物, 并用玻璃塞覆盖反应容器。在室温下搅拌溶液过夜, 最终产生黄色混合物。
3. 在分离漏斗中清洗黄色混合物, 首先用 0.1 m 溶液的 naoh (3 x 5 ml), 然后用水 (3 x 5 毫升)。
4. 用硫酸镁干燥有机相, 并用中玻璃炸薯条或滤纸过滤混合物。
5. 使用旋转蒸发器, 在降低压力下去除溶剂, 以获得作为苍白固体的产品。

4. 合成 n¹-(3-{2-[2-[2-[2-[2-[2-[2----(3-氨基丙基) 乙氧基乙氧基]-乙氧基} 丙基)-n 4-{{5-(甲基磺基)-1, 3, 4-恶二唑-2-----琥珀酰 (ods)

1. 在25毫升的圆底瓶中, 溶解30毫克的 3 在2.0 毫升的二氯甲烷。
2. 加入400μl 的三氟乙酸, 用玻璃塞密封烧瓶。
3. 在室温下搅拌反应混合物3小时。
4. 使用旋转蒸发器, 在室温下在降低压力的情况下去除挥发物, 留下油性残留物。
5. 将油性残留物溶解在7毫升的水中, 并使用分离漏斗, 用乙酸乙酯 (3 x 4 毫升) 清洗。保持水层。
6. 对水层进行冻磨, 使其成为白色粉末。
   注: ods 的摩尔吸收系数分别为 9, 900 和 12, 400 厘米-^{1 m-1.}

5. dods-dota 的合成

1. 在 1.5 ml 微离心管中, 将10毫克的 pods 溶解在300μl 的二甲基亚硫酸盐中 (0.018 mmol; 1 当量), 并添加26μl 的 n、n-二异丙基乙胺 (0.15 mmol; 8个当量)。
2. 将15.2 毫克的 DOTA-Bn-NCS (0.02 mmol; 1.2 当量) 溶解在100μl 的二甲基亚硫醚中, 并将该溶液与步骤5.1 中的溶液结合使用。密封微离心管。
3. 允许反应在室温下孵育一夜。
4. 采用反相_{c18 高效}液相色谱法纯化产品, 去除任何未反应的 DOTA-Bn-NCS。
   注: 保留时间显然在很大程度上取决于每个实验室的 hplc 设备 (泵、柱、油管等), 在纯化之前应进行适当的控制。但是, 举一个例子, 如果使用的梯度为 5:95 mecn/2o (均为 0.1% tfa) 至 70:30 mecnn/2 o (均为 0.1% tfa) 超过 30分钟, 则使用半制备方法 19 x 250 mm c₁₈列, 流量为 6 mm/min, dods、p-scn-bn-dota 和 dods-dota 的保留时间将分别为14.4、18.8 和19.6 分钟左右。所有这三种化合物都可以在254纳米的环境中进行监测。

6. dods-dota 与氨库珠单抗的生物结合

注: 对于此步骤, 我们从一个 16.4 mgml 库存解决方案开始。

1. 在低蛋白结合 1.5 ml 微离心管中, 稀释曲舒马布库存溶液的 61μl (1 毫克; 6.67 nmol, 1 当量), 并含有859μl 的磷酸盐缓冲盐 (ph 7.4)。
2. 在这种混合物中, 加入6.7μl 的新鲜制造的 10 mm 溶液中的 tcep在 h2o (66.7 nmol, 10 当量)。
3. 在 dmso 中制备 1 mg/dota 溶液, 并将该 dods-dota 溶液的73μl 添加到反应混合物中 (66.67 nmol, 10个当量)。
4. 密封微离心管, 在室温下孵育溶液2小时。
5. 2小时后, 使用预包装的一次性尺寸排除脱盐柱纯化免疫共轭。
   1. 首先, 按照供应商的描述, 对尺寸排除柱进行平衡, 以去除储存过程中列中存在的任何防腐剂。一个典型的过程是用与柱体积相对应的 pbs 卷清洗柱 5次: 5 x 2.5 ml 的 pbs。
   2. 接下来, 将反应混合物加入到尺寸排除列中, 注意反应混合物的体积。
   3. 反应混合物进入柱后, 加入适量的 pbs, 使添加到柱中的溶液总量达到 2.5 ml。例如, 如果共轭反应导致总体积为 1.3 ml, 则需要在列中添加 1.2 ml 的额外 pbs。
   4. 最后, 以 pbs 2 毫升为洗脱剂对产品进行收集。
6. 用离心过滤装置浓缩最终免疫共轭, 并采用 50 kda 分子量截止。

结果

该协议的前四个步骤----pods 的合成----被设计为具有鲁棒性和可靠性。5-(4-氨基苯基)-1, 3, 4-恶二唑-2-硫醇的分解和替代, 形成所需的硫醚产品, 仅45分钟后就能使硫醚的产率达到 gt;99%。其次, 通过标准的肽偶联过程, 实现了 1和 n-bc-n '-琥珀-4、7、10-三氧分析-1, 13 三苯胺的结扎, 从而以55% 的收率收集了产品 (2)。然后, 用广泛使用的氧化剂--m-氯前氧苯甲?...

讨论

在本报告中, 我们选择不包括任何用于放射性标记或体内实验的协议。我们的理由很简单。关于前者, 基于 pod 的免疫共轭体的放射性标记与使用其他生物共轭策略合成的免疫共轭的放射标记一点不同, 这些程序已在其他地方进行了全面的审查 2.关于后者, 临床前体内实验的具体细节 (即小鼠模型、剂量等) 可能因应用和抗体抗原系统的不同而有很大差异。

我们...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol	Sigma-Aldrich	675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube	Eppendorf	925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube	Fisherbrand	05-408-129
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	EN300000141G
Cyclohexane	Fisher Scientific	C556-4
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC383780010
Diisopropylethylamine	MP Biomedicals, LLC	150915
Dimethylsulfoxide	Fisher Scientific	31-727-5100ML
Ethyl Acetate	Fisher Scientific	E145 4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566-100G
Magnesium Sulfate	Acros Organics	413485000
m-chloroperbenzoic acid	Sigma-Aldrich	273031
Methanol	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine	Sigma-Aldrich	671401	Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	3450
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5493	10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17085101
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
Triethylamine	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid	Fisher Scientific	A116-50