合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

要約

このプロトコルではポッド、phenyoxadiazolyl メチル スルホンに基づく生体分子、特に抗体のチオールに貨物のサイト選択的添付試薬の合成について述べる。また、合成とポッド ベアリング二官能性キレート剤とその活用モデル抗体の特性を説明します。

要約

マレイミド ベアリング二官能性プローブは、生体分子、特に抗体のチオール化合物の選択的変更のため何十年も採用されています。まだ染色によるチオエーテルのリンケージは、レトロなマイケル反応を受けることができるので、マレイミド基の抱合体は体内の限られた安定性を表示します。、これはもちろん、放射性ペイロードまたは循環のチオール軸受生体分子との交換のリリースにつながることができます。これらのプロセスの両方だけでなく、健康な臓器で高い放射能濃度を作り出すことができる活動の画像コントラストを減少させると低い治療率の結果、ターゲット組織内濃度を減少します。2018 年に我々 はモジュラー、安定して、簡単にアクセスできる phenyloxadiazolyl メチル スルフォン剤の作成を報告した-'ポッド' と呼ばれる — チオール ベースの bioconjugations のためのプラットフォームとして。サイト選択的 bioconjugations のポッド ベースが均質な明確で高い陽性と非常に安定した radioimmunoconjugates に再現性をもって、堅牢に作成することが明らか。さらに、臨床実験大腸癌のマウスモデルではこれらはサイト選択的に、マレイミド基により合成された放射性標識抗体と比較して展示はるかに優れた生体内でパフォーマンスに radioimmunoconjugates をラベルを示しています。動詞。このプロトコルではポッド、ユビキタスのキレート剤 DOTA (ポッド DOTA) の二官能性鞘軸受バリアントと HER2 標的抗体トラスツズマブにポッド DOTA の活用の創造の 4 つのステップの合成について述べる。

概要

放射性医薬品化学者長い選択性と両方の核のイメージングのための疾患のバイオ マーカー抗体の特異性を悪用して放射線療法¹を対象としました。抗体のカイネティックスにはるかに最も一般的なアプローチはアミノ酸に radiolabeled 補欠分子族または radiometal のキレート剤の無差別な添付ファイルを前提と-最もよくリシン-免疫グロブリン (の構造の中図 1 a)²。この戦略は、確かに有効ですが、そのランダムなサイト固有の性質は、問題を作成できます。具体的には、伝統的な化反応アプローチを作り出す不十分な定義し、異種 immunoconjugates 何千もの生物学的および薬理学的特性³の独自のセットを持つ別の位置の混合物から成る。さらに、貨物を抗体の抗原結合ドメインに追加する場合、ランダム化反応の抗体の免疫反応性が低下します。

年これらの問題^4,5を対処するためにさまざまな部位特異的、選択的化反応戦略が開発されてきました。これらの方法の最も一般的なマレイミド軸受プローブ (図 1 b) システインのスルフヒの結紮に依存します。IgG1 抗体には自然 4 鎖間ジスルフィド、染色によるチオエーテル結合を形成するマレイミドとマイケル付加反応を受けることができる無料のチオールを生成する選択的に還元することができますリンクが含まれます。チオールおよびマレイミド類の使用は確かに伝統的な方法は、以上の改善とさまざまなマレイミド軸受シントンと二官能性キレート剤が使用可能。ただし、この方法論にも深刻な制限があることに注意してくださいすることが重要です。マレイミド基 immunoconjugates 限られた安定性生体を展示は、チオエーテル リンケージがレトロなマイケル反応 (図 2)^6,7,8,9,を受けることができるので¹⁰です。 これは、もちろん、放射性のペイロードまたは循環 (例えば、グルタチオン、アルブミン) のチオール軸受生体との交換のリリースにつながることができます。これらのプロセスの両方は、正常臓器の放射能濃度を増加、ターゲット組織、画像コントラストを減少させると低い治療率の結果で放射能濃度を減少できます。Tosylates、ブロモおよびヨード-アセチル ビニールについて検討^11,12,13,など、これらの問題を回避するためにいくつかの代替チオール反応試薬が開発されています。^14,15,16,17します。 ただし、これらの方法すべては広範な応用を妨げている制限があります。

約 5 年前、後半のカルロス ・用いる III スクリップス研究所の研究室は、非常に安定した連携 (図 1 と図 3) のチオール基の選択的形成用試薬として phenyloxadiazolyl メチルについて検討の使用を開拓^18,19. 著者採用無料のシステインを含むために設計されたいくつかの抗体を変更するフルオレセインの phenyloxadiazolyl メチル スルフォン軸受バリアント最終的に類似しているより安定して immunoconjugates を生産マレイミド基のプローブを使用して作成された構造。この有望な仕事を見て、この技術を放射化学でやっとのことでのみ使用されていたがまだ使用されていないすべての二官能性キレート剤または radioimmunoconjugates^20,21の合成に、多少びっくりしました.アプリケーション、ただし、この不足はすぐにより多くの意味を作り始めた: シグマ アルドリッチから試薬の調達でいくつかの試みと分解物の複雑な混合物の領収書で起因した < 目的化合物の 15%。さらに、自分自身で報告されている試薬を合成現実的なオプションでもなかった、公開された合成ルートは面倒です高度な有機化学の機器が必要とするほとんどの放射化学、分子イメージング研究所-我々 を含む、単に持っていません。

これらの障害に対し、簡単にアクセスできますを作成し、安定した堅牢かつ合理的に安易な合成経路を介して取得することができます phenyloxadiazolyl メチル スルフォン試薬に着手しました。今年、我々 はモジュラー、安定して、簡単にアクセスできる phenyloxadiazolyl メチル スルフォン剤の作成を報告した-'ポッド' と呼ばれる — チオール ベース bioconjugations (図 1 と図 3)²²のためのプラットフォームとして。ポッドと試薬の主な違いは、用いる、によって報告されたらは前者、後者は同じ位置 (図 4) フェノール設備 phenyloxadiazolyl メチル スルホン基に接続されているアニリン リングを採用します。この変更より簡単かつアクセス可能な合成ルートを容易と同様、市販化合物と私たちの経験が象徴的な場合-より安定した最終的な試薬。この作品もポッド ベアリング二官能性キレート剤のペアが合成。-ポッド DFO とポッド CHX A ''-DTPA — それぞれ⁸⁹Zr- ¹⁷⁷Lu ラベル radioimmunoconjugates の作成を容易にします。説明するようサイト選択的 bioconjugations のポッド ベースが均質な明確で高い陽性と非常に安定した radioimmunoconjugates に再現性をもって、堅牢に作成することを確認しました。さらに、大腸癌のマウスモデルでの臨床実験はこれらサイト選択的にラベルが付いている radioimmunoconjugates 展示マレイミド基により合成された放射性標識抗体と比較して優れた体内のパフォーマンスを示しています。動詞。

この作品のアーチの目標明確に定義された、均一な非常に安定した、高度陽性 immunoconjugates in vitro および in vivo のアプリケーションの作成を容易にすることです。合成のアプローチはシンプルなほぼすべての研究室では、実行して別のキレート剤、蛍光物質、または貨物の茄多で親ポッド試薬を変更できます。このプロトコルとそれに伴うビデオ、ポッド (図 5) の簡単な 4 つのステップの合成について述べるDOTA、 ⁶⁴Cu の調整、 ⁶⁸Ga、 ¹¹¹、 ¹⁷⁷Lu ²²⁵Ac (図 6) に広く使われているキレート剤のポッド軸受けバリアントの作成さや DOTA のモデル抗体陽性、HER2 標的特異的な IgG1 トラスツズマブ (図 7) に化反応。

プロトコル

1. 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1) の合成

注: 化合物の光感受性のため、ホイルで覆われた容器にすべての反応をしてください。

1. 10 mL の丸底フラスコに、3 mL のメタノールで 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol の 100 mg (0.517 モル、1 相当) を解散します。
2. このソリューションでは、追加の diisopropylethylamine 360 μ L (DIPEA; 2.07 モル; 4 同等; 無水) と小型の電磁攪拌棒。ゴム栓付けフラスコをカバーし、室温で 10 分間ソリューションをかき混ぜます。
3. 1 mL のガラス製注射器を使用すると、ゴム栓に穴を開けないし、すぐにこの混合物にヨードメタンの 32 μ L (0.517 モル、1 相当) を追加します。45 分間室温で反応混合物を許可します。
   メモ: ヨードメタンの潜在的な有害な影響のためこの反応は化学発煙のフード実行する必要があります。
4. ロータリーエバポレーターの風呂の水を 40 ° Cに設定し、ゆっくり減圧する白色固体を余裕に溶媒を除去します。
5. 3 ml の酢酸エチルの固体を溶解し、, 目標到達プロセスを使用して 0.1 M 炭酸ナトリウム 5 mL ソリューションで、少なくとも 3 回を洗います。
   注: 定期的にかかる; 紫外線ランプの下で水相のスポット テストランプの下で何も見られて、一度洗浄を停止できます。
6. 漏斗で有機相を収集し、水様段階の pH が 6.8 7.0 まで水で洗って (ph 試験紙を使用して)。
7. 有機相を収集し、水の痕跡を削除する硫酸マグネシウムを追加します。
   注: 硫酸マグネシウムは、小さいヘラを使って、その後解決策を旋回する必要があります追加する必要があります。乾燥剤の微粒子はまだ見られます、ソリューションは乾燥です。ない場合は、微粒子を見ることができるまで、少量の硫酸マグネシウムを追加します。
8. 培地ガラス釉薬またはろ紙を使用して混合物をフィルター処理します。
9. ロータリーエバポレーター、白い針として望ましいプロダクトを作り出すべきであるプロセスを使用して揮発性物質を蒸発させます。

2. tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl の合成] カルバミン酸 (2)

注: 化合物の光感受性のため、ホイルで覆われた容器にすべての反応をしてください。

1. 25 mL の丸底フラスコに、387 mg (0.92 ミリ モル、1.0 に相当) の NBoc-n ′-サクシニル-4,7,10-trioxa-1, 13-tridecanediamine ジクロロ メタン 10 mL で溶解します。
2. このソリューションに 480 μ L を追加 (2.76 ミリ モル、3 同等) DIPEA の N の 264 mg (1.38 ミリ モル; 1.5 同等物)-エチル - n ′-[3-(ジメチルアミノ) プロピル] カルボジイミド塩酸塩 (EDCI)、および1の 200 mg (0.97 モル、1.1 対応)。ガラス栓の容器を密封し、常温で 5 日間攪拌反応をしましょう。
   注: ジクロロ メタンの蒸発の留意してください。必要な場合は、週を通してより追加します。
3. 1 M 塩酸 (3 x 5 mL) 溶液で, 目標到達プロセスで混合物を洗浄します。
4. 有機相を収集し、続ける, 漏斗、最初 1 M Na₂CO₃ (2 x 5 mL) のソリューションと、水 (3 x 5 mL) で洗浄します。
5. 有機相を収集し、水の痕跡を削除する硫酸マグネシウムを追加 (ステップ 1.7 を参照)。培地ガラス釉薬またはろ紙を使用して混合物をフィルター処理します。
6. ロータリーエバポレーターを使用してには、オフホワイトの固体を余裕に減圧下での揮発性の溶剤を削除します。
7. 酢酸エチル 10 mL でこの固体を再溶解し、シクロヘキサン 30 mL を徐々 に (例えば、一度に 2 mL) 添加による製品の沈殿物します。
8. フィルター紙や白い粉として製品を取得する培地ガラス釉薬のソリューションをフィルター処理します。

3. tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl の合成] カルバミン酸 (3)

注: 化合物の光感受性のため、ホイルで覆われた容器にすべての反応をしてください。

1. 10 mL の丸底フラスコ2ジクロロ メタンの 4 mL の 30 mg (0.05 モル; 1 相当) を解散します。
2. 徐々 49 mg (0.2 モル; 4 相当) 70% m chloroperbenzoic 酸のこの混合物に追加し、ガラス栓の反応容器をカバーします。一晩常温で黄色の混合物を最終的にもたらすソリューションをかき混ぜます。
3. まず NaOH (3 x 5 mL) の 0.1 M の溶液とし、水 (3 x 5 mL), 漏斗に黄色の混合物を洗います。
4. 乾燥硫酸マグネシウムと有機相と培地ガラス釉薬またはろ紙を使用して混合物をフィルターします。
5. ロータリーエバポレーターを使用して、薄い固体として製品を取得する減圧下で溶媒を削除します。

4. N¹-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N⁴-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] フェニル} succinamide (ポッド) の合成

1. 25 mL の丸底フラスコに、ジクロロ メタンの 2.0 mL の3の 30 mg を溶解します。
2. トリフルオロ酢酸の 400 μ L を追加し、ガラス栓付けフラスコを密封します。
3. 3 時間室温で反応混合物をかき混ぜなさい。
4. ロータリーエバポレーターを使用して、油性残留物を残して、室温で減圧下で揮発性物質を削除します。
5. 7 mL の水に油性残留物を溶解し、酢酸エチル (3 x 4 mL) で洗浄, 目標到達プロセスを使用して。水層を維持します。
6. 白い粉とポッドを余裕に水層を凍結乾燥します。
   注: 280 と 298 nm のさやをモル吸光係数は、9,900 と 12,400 cm^-1M^-1、それぞれ。

5. ポッド DOTA の合成

1. 1.5 mL 容マイクロ チューブ 300 μ L ジメチルスルホキシド (0.018 ミリ モル; 1 に相当) のでポッドの 10 mg を溶解し、26 μ l 中、N, N-diisopropylethylamine (0.15 ミリ モル; 8 同等物) を追加します。
2. ジメチルスルホキシドの 100 μ l DOTA Bn NCS (0.02 モル; 1.2 同等) の 15.2 mg を溶解し、ステップ 5.1 からソリューションでこのソリューションを組み合わせます。遠心チューブをシールします。
3. 室温で一晩インキュベートする反応を許可します。
4. 逆相 C₁₈高速液体クロマトグラフィー クロマトグラフィーを使用して任意の未反応 DOTA-Bn-NCS を削除する製品を浄化します。
   注: 保持時間は (ポンプ、列、チューブ、等)、各研究室の高速液体クロマトグラフィー装置明らかに大きく依存しており、適切なコントロールが浄化する前に実行する必要があります。ただし場合 5: 95 MeCN/H₂O のグラデーション、例が存在する (両方 0.1 %tfa) 70: 30 MeCN/H₂O を (0.1% の両方 TFA) セミ分取 19 x 250 mm C₁₈列と 6 mL/min の流速が使用されますように 30 分以上、ポッド、p-SCN-Bn-土田とポッド DOTA はそれぞれ 19.6 分、18.8、14.4 の保持時間があります。すべての 3 つの化合物は、254 でモニターできる nm。

トラスツズマブにポッド DOTA の 6 化反応

注: この手順では、我々 はトラスツズマブの 16.4 mg/mL の原液を開始しました。

1. 低蛋白結合 1.5 mL 遠心チューブにリン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) 859 μ L のトラスツズマブの原液 (1 mg; 6.67 nmol、1 相当) の 61 μ L を希釈します。
2. この混合物に、たて 10 ミリメートルのソリューションの TCEP の H₂O (66.7 nmol、10 同等) 6.7 μ L を追加します。
3. DMSO のポッド DOTA の 1 mg/mL の溶液を準備、このポッド DOTA ソリューションの 73 μ L を反応混合物 (66・67 nmol、10 同等) に追加します。
4. 遠心管を密封し、室温で 2 時間インキュベートするソリューション。
5. 2 時間後、あらかじめパックされた使い捨てサイズ排除脱塩カラムを用いる・免疫を浄化します。
   1. 最初に、貯蔵中防腐剤すべて列に存在を削除するサプライヤーのとおりサイズ排除コラムを平衡させ。典型的なプロシージャを含む 5 回列のボリュームに対応する PBS のボリュームと列の洗浄: 5 x 2.5 mL の PBS。
   2. 次に、反応混合物の量を注意してサイズ除外] 列に反応混合物を追加します。
   3. 反応混合物が列を入力列に追加ソリューションの総容積をもたらすに PBS の適切な量を追加 2.5 mL。たとえば、抱合反応 1.3 mL の容量の場合は、1.2 mL の追加の PBS は、列に追加する必要があります。
   4. 最後に、溶離液 2 mL の PBS を使用して製品を収集します。
6. 50 kDa の分子量カットオフと遠心ろ過ユニットの最終・免疫を集中します。

結果

このプロトコルの最初の 4 つのステップ-ポッドの合成-信頼性の高い、堅牢な設計されています。脱プロトン化および目的によるチオエーテルの製品を形成する 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol の置換 affords のチオエーテル > わずか 45 分後 99% の利回り。次に、標準的なペプチド カップリング法、55% で得られる (2) 製品のコレクションの結果を介して結紮...

ディスカッション

本報告で我々 は radiolabeling や生体内で実験の任意のプロトコルを含むことができない分野します。理由は、簡単です。前者に関してポッド ベース ・免疫のカイネティックス違いはありませんまったく他化反応戦略を使用して合成・に免疫のと手順が総合的にされている他の^{2 の見直し}.後者に関して、臨床生体実験 (すなわち、マウスモデル、用量等) の具体的なアプリケー...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol	Sigma-Aldrich	675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube	Eppendorf	925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube	Fisherbrand	05-408-129
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	EN300000141G
Cyclohexane	Fisher Scientific	C556-4
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC383780010
Diisopropylethylamine	MP Biomedicals, LLC	150915
Dimethylsulfoxide	Fisher Scientific	31-727-5100ML
Ethyl Acetate	Fisher Scientific	E145 4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566-100G
Magnesium Sulfate	Acros Organics	413485000
m-chloroperbenzoic acid	Sigma-Aldrich	273031
Methanol	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine	Sigma-Aldrich	671401	Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	3450
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5493	10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17085101
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
Triethylamine	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid	Fisher Scientific	A116-50