합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

요약

이 프로토콜에서 포드는 phenyoxadiazolyl 메 틸 sulfone 기반 시 약 쓰이므로, 특히 항 체의 thiols 화물의 사이트 선택 첨부 파일에 대 한 종합을 설명 합니다. 또한, 합성 및 포드 베어링 bifunctional chelator 및 모델 항 체에의 활용의 설명 합니다.

초록

Maleimide 베어링 bifunctional 프로브는 생체, 특히 항 체에서에서 thiols의 사이트 선택 수정에 대 한 수십 년 동안 고용 되었다. 아직 maleimide 기반 어원이 같은 말 표시 제한 안정성 vivo에서 succinimidyl thioether 연계 역-마이클 반응을 받 다 수 있습니다. 이것, 물론, 방사성 페이로드 또는 순환에 thiol 베어링 쓰이므로 그 교류의 출시 발생할 수 있습니다. 이러한 프로세스의 둘 다 건강 한 장기에 높은 활동 농도 생산할 수 있는 뿐만 아니라 대상 조직, 감소 된 이미징 대비 하 고 낮은 치료 비율 활동 농도 감소. 2018, 우리 보고 모듈, 안정, 그리고 쉽게 접근할 수 있는 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 시 약의 창조-불리는 '포드'-bioconjugations thiol 기반 플랫폼으로. 우리는 명확 하 게 그 사이트 선택 bioconjugations 포드 기반 reproducibly 튼튼하게 만들 균질 성, 잘 정의 된, 높은 immunoreactive, 그리고 매우 안정적인 radioimmunoconjugates 증명 하고있다. 또한, 대 장 암의 murine 모델에서 전 임상 실험 보여주었다는 이러한 사이트에 선택적으로 표시 된 radioimmunoconjugates 전시까지 우수한 vivo에서 성능 maleimide 기반을 통해 합성 방사선된 항 체에 비해 활용형입니다. 이 프로토콜에서 포드, DOTA (포드-DOTA), 유비 쿼터 스 chelator의 bifunctional 포드 베어링 변형 및 항 HER2 타겟팅 trastuzumab 포드 DOTA의 활용의 창조의 4 단계 합성을 설명 합니다.

서문

Radiopharmaceutical 화학자 긴 선택도 및 두 핵 영상에 대 한 질병의 생체에 대 한 항 체의 특이성을 악용 하 고 방사선 치료¹대상. 멀리 떨어져 가장 일반적인 접근 radiolabeling 항 체의 아미노산을 방사선된 prosthetic 그룹 또는 radiometal chelators 무차별 부착에 입각 한-가장 자주 lysines-면역 글로불린 ( 의 구조 내에서 그림 1A)². 이 전략은 확실히 효과적인, 무작위, 사이트 일반적인 자연의 문제를 만들 수 있습니다. 특히, 전통적인 bioconjugation 접근 생산 제대로 정의 하 고 이기종 immunoconjugates 생물학과 약리학 속성³의 그것의 자신의 세트에 각각 다른 regioisomers의 수천의 혼합물의 구성. 또한, 임의의 bioconjugation 화물 면역 글로불린의 항 원 묶는 도메인을 추가 하는 경우 항 체의 immunoreactivity를 방해 수 있습니다.

년 동안, 다양 한 사이트 및 사이트 선택 bioconjugation 전략 문제^4,5를 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 접근의 가장 일반적인 maleimide 베어링 프로브 시스테인 (그림 1B)의 sulfhydryl 그룹의 결 찰 의존합니다. IgG1 항 체는 자연스럽 게 4 간 체인 이황화 다리, 선택적으로 무료 thiols succinimidyl thioether 채권 형태로 maleimides와 마이클 추가 반응 진행의 수를 줄일 수 있는 관계를 포함 합니다. Thiols 및 maleimides의 사용은 확실히 전통적인 방법에 비해 개선 및 다양 한 maleimide 베어링 synthons와 bifunctional chelators 현재 수 있습니다. 그러나,이 방법론 뿐만 아니라 심각한 한계는 중요 하다. Maleimide 기반 immunoconjugates thioether 연계 역-마이클 반응 (그림 2)^6,7,,89, 를 받을 수 있기 때문에 제한 된 안정성 vivo에서 전시 ¹⁰.이, 물론, 방사성 페이로드 또는 thiol 베어링 생체 순환 (예를들면, 티 또는 혈 청 알 부 민)에 그것의 교류의 릴리스를 이어질 수 있습니다. 이러한 프로세스의 둘 다 수 건강 한 기관에서 활동 농도 증가 시킬 뿐 아니라 대상 조직, 감소 된 이미징 대비 하 고 낮은 치료 비율 활동 농도 감소. 여러 대체 thiol 반응 시 약 tosylates, 브로 모 및 요오드 독점, 그리고 비닐 sulfones^11,12,13, 를 포함 하 여 이러한 문제를 회피 하기 위해에서 개발 되었습니다. ^{14 , 15 , 16 , 그러나 17}., 이러한 접근의 제한이 그들의 광범위 한 응용 프로그램을 방해 하는.

약 5 년 전, 스 크립 스 연구소에서 늦은 카를로스 Barbas III의 실험실 thiols (그림 1C 및 그림 3)와 매우 안정적인 연계의 선택적 형성에 대 한 시 약으로 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfones의 사용을 개척 ^{18 , 19}. 저자 고용 fluorescein 수정 설계 무료 시스테인 잔류물을 포함 하는 여러 항 체의 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 베어링 변종 궁극적으로 유사한 보다 높은 안정성과 immunoconjugates를 생산 maleimide 기반 프로브를 사용 하 여 만든 구조입니다. 우리가이 기술을 radiochemistry에서 거의 사용만 했 고 했다 사용 하지 않은 모든 bifunctional chelators 또는 radioimmunoconjugates^20,21 의 합성에 다소 놀 랐 다이 유망한 작품을 보고, 시 . 그러나 응용 프로그램,,의이 부족은 곧 더 이해 하기 시작: 시그마 올드 리치에서 시 약 조달에 여러 번 시도 결과 저하 제품의 복잡 한 혼합물의 영수증에 < 원하는 화합물의 15%. 또한, 합성 보고 시 스스로 아니었다 현실적인 옵션, 게시 된 합성 경로 다소 복잡 하 고 정교한 유기 화학 장비를 필요로 하는 대부분 radiochemistry 및 분자 영상 실험실-우리를 포함 한-단순히가지고 있지 않습니다.

이러한 장애물에 대응, 우리는 쉽게 접근할 수 있는 만들고 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 시 강력 하 고 합리적으로 손쉬운 합성 경로 통해 얻을 수 있는 매우 안정적인 밖으로 설정 합니다. 올해 초, 우리 보고 모듈, 안정, 그리고 쉽게 접근할 수 있는 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone 시 약의 창조-불리는 '포드'-thiol 기반 bioconjugations (그림 1C 및 그림 3)²²에 대 한 플랫폼으로. 포드 시의 주요 차이점 Barbas에서 보고 외 전 고용 동안 후자 기능 같은 위치 (그림 4)에 페 놀 phenyloxadiazolyl 메 틸 sulfone moiety에 연결 된 아닐린 반지입니다. 이 변경 용이 하 게 더 간단 하 고 접근 가능한 합성 노선 뿐만 아니라-만약 상용 화합물과 우리의 경험 상징 이다-더 안정적인 최종 시. 이 작품에서는, 우리는 또한 포드 베어링 bifunctional chelators의 쌍 합성-포드-돌연 사 했을까와 포드-CHX-A '-DTPA-각각 ⁸⁹Zr- ¹⁷⁷루 라는 radioimmunoconjugates의 창조를 촉진 하기 위하여. 우리가 토론 하는 것입니다, 우리는 포드-기반 사이트 선택 bioconjugations reproducibly 튼튼하게 만들 균질 성, 잘 정의 된, 높은 immunoreactive, 그리고 매우 안정적인 radioimmunoconjugates 증명 하고있다. 또한, 대 장 암의 murine 모델에서 전 임상 실험 보여주었다는 이러한 사이트에 선택적으로 표시 된 radioimmunoconjugates 전시 우수한 vivo에서 성능 maleimide 기반을 통해 합성 방사선된 항 체에 비해 활용형입니다.

이 작품의 아치를 만들 목표는 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 정의 균질, 매우 안정적이 고, 높은 immunoreactive immunoconjugates의 생성을 촉진. 합성 접근은 거의 모든 실험실에서 아주 간단 하 고 부모 포드 시 다른 chelators, fluorophores, 또는 화물의 과다와 함께 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜에 동반 비디오, 포드 (그림 5);의 간단한, 4 단계 합성 설명 합니다. DOTA, ⁶⁴Cu의 조화, ⁶⁸가, ¹¹¹에, ¹⁷⁷Lu, 및 ²²⁵Ac (그림 6);에 대 한 널리 chelator의 포드 베어링 변형 생성 그리고 모델 항 체, HER2 타겟팅 IgG1 trastuzumab (그림 7)에 포드 DOTA의 bioconjugation.

프로토콜

1. 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)의 합성

참고: 때문에 화합물의 빛 감도, 호 일 적용 선박에 모든 반응을 유지.

1. 10 ml에서 둥근 바닥 플라스 크, 100mg (0.517 mmol, 1 해당) 3 ml 메탄올의 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol의 분해.
2. 이 솔루션에 추가 diisopropylethylamine의 360 μ (DIPEA; 2.07 mmol; 4 등가물, 무수)와 작은 자석 저 어 바. 고무 스 토퍼와 플라스 크를 커버 하 고 실 온에서 10 분 동안 해결책을 저 어.
3. 1 mL 유리 주사기를 사용 하 여, 고무 마 개를 통해 구멍을 신속 하 게이 혼합물에 iodomethane의 32 μ (0.517 mmol, 해당 1)를 추가 합니다. 실 온에서 45 분간 반응 혼합물을 허용 한다.
   참고: iodomethane의 잠재적인 유해한 영향으로이 반응을 할 수 화학 증기 두건에.
4. 40 ° C 회전 증발 기의 물 목욕을 설정 하 고 천천히 여유 백색 고체 용 매를 제거 하는 압력을 줄일 수 있습니다.
5. 에틸 아세테이트의 3 mL에 고체를 녹이 고 separatory 깔때기를 사용 하 여 0.1 M 탄산 나트륨의 5 mL 해결책으로 세 번 이상 씻어.
   참고: 정기적으로 UV 램프; 아래 수성 단계의 자리-검사를 받아 일단 아무것도 램프에서 볼 수 있다는 세척을 중지할 수 있습니다.
6. Separatory 깔때기에 유기 단계를 수집 하 고 수성 단계의 pH 6.8-7.0에 도달할 때까지 물으로 그것을 씻어 (pH 종이 사용 하 여).
7. 유기 단계를 수집 하 고 물의 모든 흔적을 제거 하려면 황산 마그네슘을 추가.
   참고: 황산 마그네슘 후 솔루션 swirled 한다 작은 주걱으로 추가 되어야 합니다. 건조 용 대리인의 미세 입자 여전히 보인다면,이 솔루션은 건조. 그렇지 않은 경우에 미세 입자를 볼 수 있습니다 때까지 황산 마그네슘의 작은 금액을 추가.
8. 중간 유리 frit 또는 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 합니다.
9. 로터리 증발 기, 흰색 바늘으로 원하는 제품을 생산 해야 하는 과정을 사용 하 여 휘발성 증발.

2. tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl의 합성] carbamate (2)

참고: 때문에 화합물의 빛 감도, 호 일 적용 선박에 모든 반응을 유지.

1. 25 ml에서 둥근 바닥 플라스 크, 387의 밀리 그램 (0.92 m m o l, 1.0에 해당) NBoc-n ′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine dichloromethane 10 mL에 녹.
2. 이 솔루션에 추가 480 μ (2.76 mmol, 3에 해당)의 DIPEA, N의 264 mg (1.38 mmol, 1.5 등가물)-에틸-n ′-[3-(dimethylamino) 틸] carbodiimide 염 산 염 (EDCI), 200 밀리 그램 (0.97 mmol, 1.1 등가물) 1. 유리 스 토퍼와 함께 용기를 밀봉 하 고 상 온에서 5 일 동안 저 반응.
   참고: dichloromethane의 증발의 수 있습니다. 필요한 경우, 일주일 내내 더 추가.
3. 1 M 염 산 (3 x 5 mL)의 솔루션 separatory 깔때기에 혼합물을 씻어.
4. 유기 단계를 수집 하 고 계속 separatory 깔때기, 먼저 1 M 나₂CO₃ (2 x 5 mL)의 해결책 그리고 물 (3 x 5 mL)에 그것을 씻어.
5. 유기 단계를 수집 하 고 물의 모든 흔적을 제거 하려면 황산 마그네슘을 추가 (단계 1.7 참조). 중간 유리 frit 또는 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 합니다.
6. 회전 증발 기를 사용 하 여 오프 화이트 솔리드 감당할 감압에서 휘발성 용 매를 제거 합니다.
7. 다시이 고체의 에틸 아세테이트 10 mL에 녹이 고 침전 cyclohexane의 30 mL의 점진적 (예를 들어, 한 번에 2 mL) 추가 통해 제품.
8. 필터 종이 또는 백색 분말으로 제품을 얻기 위해 중간 유리 릿 솔루션을 필터링 합니다.

3. tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl의 합성] carbamate (3)

참고: 때문에 화합물의 빛 감도, 호 일 적용 선박에 모든 반응을 유지.

1. 10 mL 둥근 바닥 플라스 크에서 30 mg (0.05 m m o l, 1 해당) dichloromethane 4 mL에 2 의 분해.
2. 천천히이 혼합물에 70 %m-chloroperbenzoic 산의 49 mg (0.2 m m o l, 4에 해당)에 추가 하 고 유리 스 토퍼와 함께 반응 배를 커버. 실내 온도에, 궁극적으로 저조한 노란색 혼합 솔루션 밤새 저 어.
3. Separatory 깔때기, 먼저 솔루션과 0.1 M NaOH (3 x 5 mL)의 그리고 물 (3 x 5 mL)에 노란색 혼합물을 씻어.
4. 마그네슘 황산 염과 유기 단계를 건조 하 고 중간 유리 frit 또는 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 합니다.
5. 회전 증발 기를 사용 하 여, 창백한 솔리드로 제품을 감소 압력에서 용 매를 제거 합니다.

4. N¹-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N⁴-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] 페 닐} succinamide (포드)의 합성

1. 25 ml에서 둥근 바닥 플라스 크, 3 dichloromethane의 2.0 ml에서의 30 mg을 분해.
2. Trifluoroacetic 산의 400 μ를 추가 하 고 유리 스 토퍼와 플라스 크를 밀봉.
3. 3 시간 동안 실 온에서 반응 혼합물을 저 어.
4. 회전 증발 기를 사용 하 여, 휘발성 기름 잔류물을 떠나 실내 온도에서 감소 된 압력 하에서 제거 합니다.
5. 물 7 ml에서 기름 찌 꺼 기를 녹이 고, 에틸 아세테이트 (3 x 4 mL)로 씻어 separatory 깔때기를 사용 하 여. 수성 층을 유지.
6. 백색 분말으로 포드 를 감당할 수성 층 lyophilize
   참고: 280 298 nm에서 포드에 대 한 어 금 니 흡수 계수 각각 9,900 및 12400 c m^-1M^-1은.

5. 포드 DOTA의 합성

1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 디 메 틸 sulfoxide (0.018 m m o l, 1에 해당)의 300 μ에 포드의 10mg을 녹이 고 26 μ N, N-diisopropylethylamine (0.15 mmol; 8 등가물)의 추가.
2. Dimethylsulfoxide의 100 μ에 DOTA-Bn-NCS (0.02 m m o l, 1.2 등가물)의 15.2 mg를 녹이 고 단계 5.1에서 솔루션으로이 솔루션을 결합 하 여. Microcentrifuge 관 봉인.
3. 하룻밤 실 온에서 품 어에 반응을 수 있습니다.
4. 역 상 C₁₈ HPLC 크로마토그래피를 사용 하 여 모든 unreacted DOTA Bn NCS를 제거 하는 제품을 정화.
   참고: 보존 회는 분명히 매우 (펌프, 열, 튜브, 등), 각 연구실의 HPLC 장비에 의존 하 고 정화 하기 전에 적절 한 컨트롤을 실행 해야 합니다. 그러나, 만약과 MeCN/H₂O의 그라데이션 예제를 제시 (모두 0.1 %TFA)과 MeCN/h 조₂O를 (모두 0.1 %TFA) 30 분 이상 반 대리점 19 x 250 m m C₁₈ 칼럼 및 6 mL/min의 유량 사용 됩니다 포드, p-SCN-Bn-DOTA, 그리고 포드 DOTA 14.4, 18.8, 19.6 분 주위의 정체 시간을 각각 있을 것 이다. 모든 세 가지 화합물 254에 감시 될 수 있다 nm.

6 trastuzumab 포드 DOTA의 bioconjugation

참고:이 단계에 대 한 우리 trastuzumab의 16.4 mg/mL 재고 솔루션으로 시작 했다.

1. 낮은 단백질 바인딩 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 인산 염 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)의 859 μ와 trastuzumab 재고 솔루션 (1 mg, 6.67 nmol, 1 해당) 61 μ 희석.
2. 이 혼합물에 갓 만든된 10 mM의 솔루션 TCEP H₂O (66.7 nmol, 10에 해당)의 6.7 μ를 추가 합니다.
3. DMSO에 포드-DOTA의 1 mg/mL 해결책을 준비 하 고 반응 혼합물 (66.67 nmol, 10에 해당)에이 포드 DOTA 솔루션의 73 μ를 추가.
4. Microcentrifuge 관을 밀봉 하 고 상 온에서 2 시간에 대 한 솔루션을 품 어.
5. 2 시간 후, 사전 포장된 일회용 크기 제외 염 열을 사용 하 여 immunoconjugate 정화.
   1. 첫째, 어떤 방부 제는 열에 저장 하는 동안 제거 하는 공급자에 의해 설명 된 대로 크기 제외 열을 equilibrate. 전형적인 절차 포함 열 열의 볼륨에 해당 하는 PBS의 볼륨을 5 번 세척: 5 x 2.5 mL PBS의.
   2. 다음, 지적 반응 혼합물의 볼륨 크기 제외 열에 반응 혼합물을 추가 합니다.
   3. 반응 혼합물이 열을 입력 한 후 추가 열에 추가 솔루션의 전체 볼륨을가지고 PBS의 적절 한 금액 최대 2.5 mL. 예를 들어 활용 반응 1.3 mL의 전체 볼륨에 있는 경우, 추가 PBS의 1.2 mL 해야 열에 추가 합니다.
   4. 마지막으로,는 eluent로 PBS의 2 개 mL를 사용 하 여 제품을 수집 합니다.
6. 마지막 immunoconjugate 50 kDa 분자량 컷오프로 원심 여과 단위로 집중.

결과

이 프로토콜의 처음 네 단계-포드의 합성-강력 하 고 안정 되도록 설계 되었습니다. Deprotonation 및 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol 원하는 thioether 제품의 대체 월급에서 thioether > 99% 수율 45 분 후. 다음, 결 찰 1 과 N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine 표준 펩 티 드 프로시저를 커플링, 55% 수율에서 (2) 제품의 컬렉션에서 결과 통해 달성 되었다. ?...

토론

이 보고서에서 우리는 하지 radiolabeling 또는 vivo에서 실험에 대 한 모든 프로토콜을 포함 하도록 선택 했습니다. 우리의 이유는 간단 합니다. 전에 관하여 radiolabeling 포드 기반 immunoconjugate의 차이가 하지 않는 전혀 다른 bioconjugation 전략을 사용 하 여 합성 하는 immunoconjugate의 그리고이 종합적으로 검토 하는 다른² . 후자에 관해서는 전 임상 생체 조건 실험 (즉, 마우스 모델, 복용량...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol	Sigma-Aldrich	675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube	Eppendorf	925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube	Fisherbrand	05-408-129
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	EN300000141G
Cyclohexane	Fisher Scientific	C556-4
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC383780010
Diisopropylethylamine	MP Biomedicals, LLC	150915
Dimethylsulfoxide	Fisher Scientific	31-727-5100ML
Ethyl Acetate	Fisher Scientific	E145 4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566-100G
Magnesium Sulfate	Acros Organics	413485000
m-chloroperbenzoic acid	Sigma-Aldrich	273031
Methanol	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine	Sigma-Aldrich	671401	Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	3450
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5493	10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17085101
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
Triethylamine	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid	Fisher Scientific	A116-50