סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

Summary

ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה של התרמילים, phenyoxadiazolyl מתיל מבוססי sulfone ריאגנט של הקובץ המצורף באתר סלקטיבית של מטענים תיולים של מולקולות, במיוחד נוגדנים. בנוסף, נתאר את סינתזה ואפיון של chelator bifunctional של תרמילי מניבי, ההטיה שלה נוגדן מודל.

Abstract

הגששים bifunctional Maleimide מניבי יש כבר מועסקים במשך עשרות שנים על השינוי באתר סלקטיבית של תיולים במולקולות, במיוחד נוגדנים. עדיין מבוסס maleimide conjugates להציג ויוו מוגבל יציבות כי ניגודים thioether succinimidyl ניתן לעבור ריאקציה רטרו-מיכאל. זה, כמובן, יכול להוביל לשחרור המטען רדיואקטיבי או exchange שלו עם מולקולות תיול מניבי במחזור. שני התהליכים הללו יכולים לייצר פעילות מוגברות ריכוזים באיברים בריאים, כמו גם ירד ריכוז פעילות ברקמות היעד, וכתוצאה מכך ניגודיות הדמיה מופחתת יחסי טיפולית נמוכה יותר. ב-2018, דיווחנו הבריאה של קרונות, יציב ו- phenyloxadiazolyl נגיש בקלות מתיל sulfone ריאגנט – שכונתה "תרמילים" — כפלטפורמה מבוססי תיול bioconjugations. הראו בבירור כי מבוססי תרמילי bioconjugations האתר סלקטיבית reproducibly ו- robustly ליצור radioimmunoconjugates הומוגנית, מוגדרים היטב, immunoreactive מאוד, יציבה מאוד. יתר על כן, ניסויים פרה במודלים מאתר של סרטן המעי הגס הראו כי אלה באתר באופן סלקטיבי מתויג radioimmunoconjugates התערוכה ביצועים ויוו בהרבה בהשוואה radiolabeled נוגדנים מסונתז via מבוסס-maleimide ההטיות. ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה ארבעה שלבים של התרמילים, היצירה של variant תרמילי מניבי bifunctional של chelator נמצא בכל מקום דוטה (תרמילים-דוטה), הבניין של תרמילי-DOTA הרצפטין נוגדן פילוח HER2.

Introduction

כימאים radiopharmaceutical זמן לנצל את סלקטיביות וספציפיות של נוגדנים עבור סמנים ביולוגיים של המחלה עבור שניהם הדמיה גרעינית, ממוקד הקרנות¹. הגישה הנפוצה רחוק ביותר radiolabeling של נוגדנים המרקסיסטי מבוסס על הקובץ המצורף ללא הבחנה של קבוצות prosthetic radiolabeled או radiometal chelators כדי חומצות אמינו – לרוב lysines — בתוך המבנה של אימונוגלובולינים ( איור 1A)². אסטרטגיה זו הוא יעיל בהחלט, טבעה אקראיות, לא אתר-ספציפית ניתן ליצור בעיות. באופן ספציפי, גישות מסורתיות bioconjugation מייצרים מוגדרת היטב, immunoconjugates הטרוגנית המורכבת תערובות של אלפי regioisomers שונים, כל אחד עם ערכה ייחודית של תכונות ביולוגיות תרופתי³. יתר על כן, bioconjugation אקראיים לטרפד את immunoreactivity של נוגדנים אם המטען מצורף לתחומים של נוגדן-אנטיגן מחייב.

במהלך השנים פותחו מגוון רחב של אסטרטגיות ספציפיות-לאתר, האתר-סלקטיבי bioconjugation כדי לטפל אלה בעיות^4,5. הנפוצה ביותר של גישות אלה מסתמך על מצדו של הגששים maleimide מניבי לקבוצות sulfhydryl של cysteines (איור 1B). IgG1 נוגדנים באופן טבעי מכיל 4 דיסולפידי בין שרשרת גשרים, קישורים כי ניתן להפחית באופן סלקטיבי להניב מסוגל שעברו מייקל תגובות תוספת עם maleimides כדי ליצור קשרים thioether succinimidyl חינם תיולים. השימוש תיולים maleimides הוא בהחלט שיפור לעומת שיטות מסורתיות, מגוון רחב של נושאי maleimide synthons, bifunctional chelators זמינים כעת. עם זאת, חשוב לציין כי מתודולוגיה זו יש מגבלות רציניות גם כן. Immunoconjugates מבוססי Maleimide שהפגינו ויוו מוגבל יציבות כי הצמדה thioether יכולות לעבור. מייקל רטרו התגובה (איור 2)^{6,7,8,9, 10}. זה, כמובן, יכול להוביל לשחרור המטען רדיואקטיבי או exchange שלו עם מולקולות תיול מניבי במחזור (למשל, גלוטתיון או אלבומין). שני התהליכים הללו יכולים להגדיל את ריכוז פעילות באיברים בריאים וכן להקטין ריכוז פעילות ברקמות היעד, וכתוצאה מכך ניגודיות הדמיה מופחתת יחסי טיפולית נמוכה יותר. מספר חלופי ריאגנטים תיול-תגובתי פותחו במטרה לעקוף סוגיות אלה, כולל tosylates, ברומו - ו iodo-acetyls, ויניל sulfones^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17}. עם זאת, כל הגישות האלה יש מגבלות יש הקשו את היישום הנרחב שלהם.

לפני כחמש שנים במעבדה של המנוח קרלוס השלישי Barbas במכון המחקר סקריפס חלוץ השימוש phenyloxadiazolyl מתיל sulfones כמו ריאגנטים עבור היווצרות סלקטיבי של קישורים יציב מאוד עם תיולים (1C איור, איור 3) ^{18 , 19}. המחברים המועסקים וריאציה sulfone מניבי מתיל phenyloxadiazolyl של fluorescein כדי לשנות את מספר נוגדנים מתוכנן להכיל שאריות ציסטאין חינם, בסופו של דבר לייצר immunoconjugates עם יציבות גבוהה יותר מאשר מקביל בונה שנוצרו באמצעות הגששים מבוסס maleimide. רואה את זה מבטיח, היינו מופתעת כי טכנולוגיה זו היה בשימוש רק בקושי ב radiochemistry, היה לא עדיין בשימוש בכלל בסינתזה של bifunctional chelators או^20,radioimmunoconjugates²¹ . זה מחסור של יישומים, אולם עד מהרה החלו הגיוני יותר: מספר נסיונות ברכישת הכימית של סיגמה-אולדריץ הביא הקבלה של תערובות מורכבים של השפלה מוצרים עם < 15% משטח המתחם הרצוי. בנוסף, סינתזה הכימית דווח על עצמנו לא היה אופציה ריאלית, כפי המסלול סינתטי שפורסם הוא קצת מסורבל ודורש ציוד מתוחכם כימיה אורגנית זה רוב radiochemistry והדמיה מולקולרית מעבדות — לרבות שלנו – פשוט לא ניחנת.

בתגובה מכשולים אלה, יצאנו כדי ליצור נגישה בקלות ויציבה מאוד ריאגנט sulfone מתיל phenyloxadiazolyl שניתן להשיג באמצעות מסלול סינטטי למדי נתיישב ועמיד. מוקדם יותר השנה, דיווחנו הבריאה של קרונות, יציב ו- phenyloxadiazolyl נגיש בקלות מתיל sulfone ריאגנט – המכונה "תרמילים" — כפלטפורמה מבוססי תיול bioconjugations (1C איור, איור 3)²². ההבדל העיקרי בין התרמילים הכימית שדווחו על-ידי Barbas, et al. הוא לשעבר מעסיקה טבעת אנילין המצורפת את moiety sulfone מתיל phenyloxadiazolyl, בזמן האחרון כולל של פנול באותה תנוחה (איור 4). שינוי זה מקלה על מסלול סינטטי פשוטה ונגישה יותר וכן — אם הניסיון שלנו עם המתחם זמינים מסחרית הוא סמלי – ריאגנט הסופי יותר יציב. בעבודה זו, אנחנו גם מסונתז זוג תרמילי מניבי chelators bifunctional — תרמילי-DFO ואת התרמילים-CHX-A '-DTPA — כדי להקל על היצירה של ⁸⁹Zr - ¹⁷⁷התווית על-ידי Lu radioimmunoconjugates, בהתאמה. כפי שנדון, הראו כי מבוססי תרמילי bioconjugations האתר סלקטיבית reproducibly ו- robustly ליצור radioimmunoconjugates הומוגנית, מוגדרים היטב, immunoreactive מאוד, יציבה מאוד. יתר על כן, ניסויים פרה במודלים מאתר של סרטן המעי הגס הראו כי אלה באתר באופן סלקטיבי הנקרא radioimmunoconjugates התערוכה ביצועים מעולים ויוו בהשוואה radiolabeled נוגדנים מסונתז via מבוסס maleimide ההטיות.

מטרת עבודה זו מתקשת יתר היא להקל על יצירת immunoconjugates מוגדרים היטב, הומוגנית, יציבה מאוד, immunoreactive מאוד ליישומים במבחנה ויוו. הגישה סינתטית היא פשוט מספיק כדי לבצע כמעט כל במעבדה, הכימית תרמילי האב יכול להיות שונה עם שפע של chelators שונים, fluorophores או מטענים. פרוטוקול זה, הסרטון הנלווה, נתאר את הסינתזה פשוט בן ארבעה שלבים של תרמילי (איור 5); היצירה של variant תרמילי מניבי של DOTA, chelator בשימוש נרחב עבור תיאום של ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ¹¹¹ב, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac (איור 6); את bioconjugation של תרמילי-DOTA נוגדן מודל, הרצפטין IgG1 פילוח HER2 (איור 7).

Protocol

1. הסינתזה של 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

הערה: בשל האור-הרגישות של המתחם, שמור כל התגובות בכלי מכוסה בנייר כסף.

1. בסיבוב 10 מ"ל בתחתית הבקבוק, להמיס 100 מ ג (mmol 0.517, 1 שוות ערך) של 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol ב 3 מ"ל של מתנול.
2. כדי פתרון זה, להוסיף μL 360 של diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 מקבילות; נטול מים), בר קטן מערבבים מגנטי. לכסות את הבקבוק עם פקק גומי ומערבבים את הפתרון ל-10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. באמצעות מזרק זכוכית 1 מ"ל, לתקוע חור פקק הגומי ולהוסיף במהירות μL 32 (mmol 0.517, 1 שוות ערך) של iodomethane תערובת זו. לאפשר את התערובת להגיב במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: בשל ההשפעות המזיקות פוטנציאלי של iodomethane, התגובה הזו צריך להיעשות בשכונה fume כימי.
4. מוגדר האמבט במים המאדה 40 ° C , לאט להפחית את הלחץ כדי להסיר הממס לממן מוצק לבן.
5. ממיסים המוצק ב- 3 מ"ל של אתיל אצטט ושוטפים לפחות שלוש פעמים עם פתרון מ של 0.1 M נתרן פחמתי באמצעות משפך מפריד.
   הערה: מעת לעת לקחת נקודה-בדיקות של שלב מימית תחת מנורת UV; לאחר דבר הוא ראה תחת המנורה, אתה יכול לעצור את שוטף.
6. לאסוף את השלב אורגני ב משפך, לשטוף אותה עם מים עד ה-pH של שלב מימית מגיע 6.8-7.0 (באמצעות נייר pH).
7. לאסוף את שלב אורגני, להוסיף מגנזיום גופרתי כדי להסיר את עקבות של מים.
   הערה: יש להוסיף את מגנזיום גופרתי עם מרית קטנה, אחרי אשר צריך להיות התרוצצו הפתרון. אם עדיין נראים חלקיקים זעירים של סוכן ייבוש, הפתרון הוא יבש. אם לא, מוסיפים כמויות קטנות של מגנזיום גופרתי, עד שניתן לראות חלקיקים.
8. לסנן את התערובת באמצעות זכוכית בינוני frit או נייר סינון.
9. להתנדף שיכללו חומרים נדיפים באמצעות המאדה, תהליך שאמור ליצור את המוצר הרצוי כמו מחטים לבן.

2. הסינתזה של tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (2)

הערה: בשל האור-הרגישות של המתחם, שמור כל התגובות בכלי מכוסה בנייר כסף.

1. בסיבוב mL 25 בתחתית הבקבוק, להמיס 387 מ ג (0.92 mmol, המקבילה 1.0) של NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine ב- 10 מ"ל של דיכלורומתאן.
2. כדי פתרון זה, להוסיף 480 μL (2.76 mmol, ושווי 3) של DIPEA, 264 מ"ג (mmol 1.38 אינץ; מקבילות 1.5) של N-אתיל - N′-[3-(דלמטלמינו) propyl] carbodiimide הידרוכלוריד (EDCI), ו- 200 מ ג (0.97 mmol, ושווי 1.1) 1. לאטום את הכלי עם פקק זכוכית ולתת את התגובה מערבבים במשך 5 ימים בטמפרטורת החדר.
   הערה: להיות קשובים אידוי דיכלורומתאן. אם יש צורך, להוסיף יותר במהלך השבוע.
3. לשטוף את התערובת בתוך משפך עם פתרון של חומצת מלח 1 מ' (3 x 5 מ"ל).
4. לאסוף את שלב אורגני וממשיכים לשטוף את זה ב משפך, תחילה עם פתרון של 1 מ ' נה₂CO₃ (2 x 5 מ"ל) ולאחר מכן עם מים (3 x 5 מ"ל).
5. לאסוף את שלב אורגני והוספת מגנזיום גופרתי כדי להסיר את עקבות של מים (ראה צעד 1.7). לסנן את התערובת באמצעות זכוכית בינוני frit או נייר סינון.
6. באמצעות את המאדה, להסיר את ממסים נדיפים בלחץ מופחת לממן מוצק תפר חוט רקמה אופווייט.
7. לפזר מחדש זה מוצק ב 10 מ"ל של אתיל אצטט, לזרז את המוצר באמצעות התוספת של 30 מ של ציקלוהקסאן הדרגתי (למשל, בכל פעם 2 מ"ל).
8. לסנן את הפתרון עם נייר סינון או של זכוכית בינוני frit כדי לקבל את המוצר כמו אבקה לבנה.

3. הסינתזה של tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (3)

הערה: בשל האור-הרגישות של המתחם, שמור כל התגובות בכלי מכוסה בנייר כסף.

1. בבקבוקון סיבוב המדרגה 10 מ"ל, לפזר 30 מ"ג (0.05 mmol; המקבילה 1) של 2 4 מיליליטר דיכלורומתאן.
2. לאט לאט להוסיף במ ג 49 (0.2 mmol; מקבילות 4) של 70% m-chloroperbenzoic חומצה תערובת זו ולכסות את מיכל התגובה עם פקק זכוכית. מערבבים את הפתרון ללילה בטמפרטורת החדר, בסופו של דבר מניב תערובת צהוב.
3. לשטוף את התערובת צהוב ב משפך, תחילה עם פתרון 0.1 M של NaOH (3 x 5 מ"ל) ולאחר מכן עם מים (3 x 5 מ"ל).
4. יבש את שלב אורגני עם מגנזיום גופרתי, לסנן את התערובת באמצעות זכוכית בינוני frit או נייר סינון.
5. באמצעות את המאדה, להסיר את ממיסים תחת לחץ מופחת כדי לקבל את המוצר כמו מוצק חיוור.

4. הסינתזה של N¹-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N⁴- succinamide {phenyl 4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]} (סיר)

1. בסיבוב mL 25 בתחתית הבקבוק, לפזר 30 מ"ג של 3 ב מ 2.0 ל דיכלורומתאן.
2. להוסיף 400 μL של חומצה trifluoroacetic, לאטום את הבקבוק עם פקק זכוכית.
3. מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
4. באמצעות את המאדה, להסיר את שיכללו חומרים נדיפים בלחץ מופחת בטמפרטורת החדר, עוזב של משקע שמנוני.
5. להמיס את השאריות שמנוני ב 7 מ ל מים, שימוש משפך, לשטוף עם אתיל אצטט (3 x 4 מ"ל). להשאיר את השכבה המימית.
6. Lyophilize את השכבה המימית לממן תרמילי כאבקה לבנה.
   הערה: מקדמי קליטה טוחנת עבור התרמילים ב nm 280, 298 הם 9,900 ו- 12,400 ס מ^-1מ'^-1, בהתאמה.

5. הסינתזה של תרמילי-דוטה

1. צינור microcentrifuge 1.5 mL, להמיס 10 מ ג של התרמילים, ב- 300 μL של דימתיל סולפוקסיד (0.018 mmol; המקבילה 1) ולהוסיף μL 26 של N, N-diisopropylethylamine (0.15 mmol; 8 מקבילות).
2. להמיס 15.2 מ"ג של DOTA-בסון-רכיבי NC (0.02 נקודות mmol; מקבילות 1.2) בμl 100 של dimethylsulfoxide ולשלב פתרון זה עם הפתרון של שלב 5.1. חותם את הצינור microcentrifuge.
3. לאפשר התגובה דגירה ללילה בטמפרטורת החדר.
4. לטהר את המוצר באמצעות הפוכה-שלב ג₁₈ hplc, קורס כרומטוגרפיה כדי להסיר את כל unreacted דוטה-בסון-רכיבי NC.
   הערה: שמירה פעמים הם מאוד תלויים בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, אבובים, וכו '), הפקדים המתאימים צריכה לפעול לפני טיהור. עם זאת, להציג דוגמה, אם שיפוע של 5:95 MeCN/H₂O (שניהם עם 0.1% TFA) כדי 70:30 MeCN/H₂O (שניהם עם 0.1% TFA) מעל 30 דקות, עמודה₁₈ למחצה מפוח 19 x 250 מ מ ג, קצב זרימה של 6 מ לדקה משמשים , תרמילים, p-SCN-בסון-דוטה, DOTA תרמילי יהיו פעמים השמירה של סביב 14.4, 18.8 ו- 19.6 דקות, בהתאמה. ניתן לנטר כל התרכובות שלוש-254 ננומטר.

6. bioconjugation של תרמילי-DOTA כדי הרצפטין

הערה: בשלב זה, התחלנו עם פתרון מניות 16.4 מ"ג/מ"ל של הרצפטין.

1. נקז microcentrifuge 1.5 mL מחייב חלבון נמוכה, לדלל μL 61 של הפתרון מניות הרצפטין (1 מ ג; nmol 6.67, 1 שוות ערך) עם μL 859 תמיסת פוספט buffered (pH 7.4).
2. כדי תערובת זו, להוסיף μL 6.7 של טרי 10 מ מ פתרון של TCEP H₂O (66.7 nmol, ושווי 10).
3. להכין פתרון 1 מ"ג/מ"ל של תרמילי-דוטה, דימתיל סולפוקסיד ולהוסיף μL 73 של פתרון זה תרמילים-DOTA תערובת התגובה (66.67 nmol, ושווי 10).
4. לאטום את הצינור microcentrifuge, תקופת דגירה הפתרון של 2 שעות בטמפרטורת החדר.
5. לאחר שעתיים, לטהר את immunoconjugate באמצעות עמודה desalting של הדרה מראש ארז גודל חד פעמיות.
   1. ראשית, equilibrate את גודל אי-הכללה של העמודה כפי שתואר על ידי הספק כדי להסיר כל מוצר קיים בעמודה במהלך האחסון. הליך טיפוסי כולל שטיפת העמודה 5 פעמים עם נפח של PBS המתאים לנפח של העמודה: 5 x 2.5 מ של PBS.
   2. לאחר מכן, להוסיף את תערובת התגובה העמודה אי-הכללה של גודל וציין את עוצמת הקול של תערובת התגובה.
   3. לאחר תערובת התגובה נכנס העמודה, להוסיף כמות מספקת של PBS להביא את הנפח הכולל של פתרון להוסיף את העמודה עד 2.5 מ ל. לדוגמה, אם התגובה ההטיה, גרמו הנפח הכולל של 1.3 מ ל, 1.2 מ של PBS נוספים יהיה צורך להוסיף את העמודה.
   4. לבסוף, לאסוף את המוצר באמצעות 2 מ של PBS כמו eluent.
6. לרכז את immunoconjugate הסופית עם יחידות צנטריפוגליות סינון עם ניתוק משקל מולקולרי kDa 50.

תוצאות

תחילה ארבעת השלבים של פרוטוקול זה — הסינתזה של תרמילי — עוצבו כדי להיות עמיד ואמין. דה-פרוטונציה של החלפה של 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol כדי ליצור את המוצר הרצוי thioether מעניקה את thioether ב > 99% תשואה לאחר 45 דקות בלבד. בשלב הבא, מצדו בין 1 לבין N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine ה?...

Discussion

בדו ח זה, בחרנו לא לכלול כל פרוטוקולים לניסויים radiolabeling או ויוו. הסיבות שלנו הם פשוטה. ביחס לשעבר, radiolabeling של immunoconjugate המבוסס על תרמילי אינו שונה כלל מזו של immunoconjugate מסונתז באמצעות אסטרטגיות bioconjugation אחרים, נהלים אלה היו באופן מקיף שנסקרו במקום אחר² . לגבי האחרון, הפרטים של ניסויים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol	Sigma-Aldrich	675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube	Eppendorf	925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube	Fisherbrand	05-408-129
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	EN300000141G
Cyclohexane	Fisher Scientific	C556-4
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC383780010
Diisopropylethylamine	MP Biomedicals, LLC	150915
Dimethylsulfoxide	Fisher Scientific	31-727-5100ML
Ethyl Acetate	Fisher Scientific	E145 4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566-100G
Magnesium Sulfate	Acros Organics	413485000
m-chloroperbenzoic acid	Sigma-Aldrich	273031
Methanol	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine	Sigma-Aldrich	671401	Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	3450
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5493	10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17085101
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
Triethylamine	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid	Fisher Scientific	A116-50