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摘要

我们提出了一个标准化的方案来表征晚期小鼠动脉粥样硬化病变的细胞组成, 包括动物解剖、组织包埋、切片、染色和腕头动脉分析的系统方法从动脉粥样硬化平滑肌细胞谱系追踪小鼠。

摘要

动脉粥样硬化仍然是全世界的主要死因, 尽管有无数临床前研究描述了有希望的治疗目标, 但新的干预措施仍然遥遥无期。这在一定程度上可能是由于依赖临床前预防模型, 调查基因操作或药物治疗对动脉粥样硬化发展的影响, 而不是既定疾病。另外, 由于使用了表面病变分析, 缺乏对病变细胞群的定性, 这些研究的结果往往令人困惑。为了帮助克服这些转化障碍, 我们建议更多地依赖干预模型, 利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜对单个细胞水平细胞组成的变化进行研究。为此, 我们描述了一种在小鼠干预模型中测试假定治疗药物的方案, 包括动物解剖、嵌入、切片、染色和臂头动脉病变定量的系统方法。此外, 由于晚期动脉粥样硬化病变中细胞的表型多样性, 我们描述了使用细胞特异性、诱导的谱系追踪小鼠系统的重要性, 以及如何利用这种方法对细胞进行无偏见的表征。动脉粥样硬化病变细胞群。总之, 这些策略可以帮助血管生物学家更准确地模拟治疗干预措施和分析动脉粥样硬化疾病, 并有望转化为更高的成功率的临床试验。

引言

动脉粥样硬化是全球大多数冠心病、外周动脉疾病和中风的主要发病和死亡原因。晚期冠状动脉粥样硬化可导致严重并发症, 包括心肌梗塞占世界人口死亡人数的近 16% 1,2。由于其对公众健康的破坏性影响, 已经作出了大量的努力, 以破译机制, 推动动脉粥样硬化的进展, 并制定新的治疗策略。然而, 与其他临床领域 (第一阶段仅为 8.7%) 相比, 心血管疾病临床试验的批准可能性 (loa)是最低的。这在一定程度上可以用动脉粥样硬化对有效药物开发构成的许多障碍来解释, 包括其几乎无处不在的性质、临床上沉默的进展和显著的疾病异质性。此外, 临床前动物研究的次优设计也可以解释临床翻译缺乏成功的原因。具体而言, 我们认为有必要尽可能实施干预研究, 以调查治疗策略的疗效。此外, 有一个迫切需要执行标准化的程序, 病变分析, 包括先进的定性后期动脉粥样硬化病变细胞组成的命运图和表型。

绝大多数动脉粥样硬化研究的重点是模型动脉粥样硬化预防包括药物治疗或基因操作 (敲除或敲入) 健康的幼鼠, 在疾病的开始和进展之前。这些研究发现了大量的基因和信号分子, 它们在动脉粥样硬化的发展中起着作用。然而, 这些目标大多未能转化为人类有效的治疗方法。事实上, 很难推断治疗对健康的幼鼠有影响的老年患者的晚期动脉粥样硬化病变。因此, 在临床前实验管道中实施干预研究可能会更准确地描述一种新治疗方法的相关性和有效性。在采用预防 4、5、6或干预策略7时, 抑制促炎性细胞因子白细胞素-1β (il-1β) 的显著发散效应支持了这一想法。预防和干预研究之间的差异表明, 不同的细胞过程发生在动脉粥样硬化发展的不同阶段, 并突出表明预防研究可能不足以模拟临床情景充分。

美国心脏协会最近发表了一份科学声明, 详细介绍了正确的实验设计、程序标准化、分析和报告动物动脉粥样硬化研究的建议 8。报告强调了该领域使用的主要技术的好处和局限性。例如,面对苏丹主动脉的 iv 染色通常作为第一次读出进行。虽然面对苏丹 iv 染色的脂质沉积是一个合适的方法来评估全球斑块负担, 它是无法区分早期阶段脂肪条纹病变和更先进的晚期病变。因此,对面部染色的解释往往是模糊和肤浅的.使用形态参数血管、病变、腔大小和病变稳定性指标的量化对组织横截面进行仔细分析, 可以更准确地了解实验的效果。

最后, 人类组织病理学研究表明, 细胞组合物是一个更好的预测破裂比病变大小本身, 病变在平滑肌细胞 (smc) 和丰富的巨噬细胞更容易破裂10, 11个。这些观察是基于经典用于细胞鉴定的标记的染色 (即 smc 的 acta2 和巨噬细胞的 lgals3 或 cd68)。然而, 由于包括 smc、内皮细胞和骨髓细胞12在内的多种谱系的可塑性, 这些标记的表达并不严格限于动脉粥样硬化病变中的单个细胞类型。特别是, 在过去十年之前, 几乎不可能在动脉粥样硬化病变中明确识别 smc, 因为这些细胞具有去分化和抑制其谱系特异性标记基因的特性 (这一过程称为表型转换) 在受伤或患病的血管13。由于血统追踪7、14、15、16、17、18、19,20,21,22,23,24. 它包括永久标记 smc 及其后代, 以跟踪其在动脉粥样硬化进展过程中的命运和表型演变, 使用 smc 特定启动子驱动的 cre 重组酶的表达组合 (即, myh117、15、17、18、19、20、21、22、23,24, acta225、26和sm2α14、16) 和记者的激活 (例如, 荧光蛋白、β-半乳糖苷酶) [在 btzon 和 majesky 中评论201827]。在最早的一项研究中, speer 等人在胚胎发生环境之外进行了研究, 其中一项研究提供了证据, 证明 smc 可以在胚胎发生过程中调节其表型并转化为软骨细胞, 方法是sm22α cre r26r lacz 谱系追踪模型。尽管这些研究开创了 smc 谱系追踪的先河, 但他们在一定程度上模棱两可, 因为任何在疾病发生时表达 sm2α的给定非 smc 都会被记者标记。通过开发和使用允许对细胞标记进行时间控制的他莫西芬诱导 cre ertlexp, 绕过了这一限制。细胞标记仅在他莫西芬分娩过程中发生, 并将仅限于在他莫西芬接触时表达细胞类型特特的细胞, 从而避免追踪激活 cre 的替代细胞类型。疾病进展的设置。对于动脉粥样硬化中 smc 的谱系追踪, 与荧光记者相关的他莫西芬诱导myh11-cre/ert2转基因 (eyfp7、15、17、18),21、mtmg19、25、五彩食品20、22、23为克隆扩频研究已证明了 smc 标签的显著效率和特异性, 并具有显著的应用效率和特异性。在最近的研究中, smc 种群被用于命运图。重要的是, 这些研究表明: 1) 在晚期动脉粥样硬化病变中, 80% 的 smc 不能表达免疫组织学分析中使用的任何常规 smc 标记物 (acta2, myh11), 因此在没有谱系追踪的情况下, 会被误认错误。17岁;2) 包括巨噬细胞标记或间充质干细胞标记 16、17、19的替代细胞类型 smc 表达标记的子集;smc 通过寡克隆扩张和 smc 克隆体保留可塑性, 过渡到表型不同的 20,23。总之, 现在可以清楚地看到, 平滑肌细胞在动脉粥样硬化病变中具有显著的表型多样性, 并可根据其表型转变的性质对病变发病机制产生有益或有害的作用。这些发现是针对 smc 动脉粥样硬化促进表型转变在晚期动脉粥样硬化中的一个显著的新治疗途径。

在此, 我们提出了一个标准化的程序, 分析晚期小鼠动脉粥样硬化病变, 包括动物解剖, 嵌入, 切片, 染色, 和定量的腕头动脉病变。为了确定白细胞介素-1β抑制 smc 的影响, 我们使用 smc 系追踪 apoe-/-小鼠喂养了18个月的西方饮食, 然后接受每周注射抗 il1 β抗体或同位素匹配的 igg 控制。

研究方案

弗吉尼亚大学和匹兹堡大学动物护理和使用机构委员会批准了动物育种、处理和程序。

1. smc 系追踪小鼠的生成

  1. 养殖 myh11-cre/ert2 男性28 (杰克逊实验室; #019079) 与 r26r-eyfp 女性 (杰克逊实验室; #006148) 获得myh11-cre/ert2 + r26r-eyfp+/+男性.
  2. 用 apoe - ///雌性小鼠养殖 myh11-cre/ert2 + r26r-eyfp+/+雄性 (jackson 实验室; #002052).交叉后代, 并选择基因分型 myh11-cre/ert2 + r26r-eyfp+/+ apoe-//-男性和 r26r-eyfp+/ + apoe-\-雌性小鼠作为最终的繁殖者. 夹尾和执行基因分型的垃圾伙伴。所有雄性小鼠应为 myh11-cre/ert2+ r26r-eyfp+/+ apoe/,并可用作实验性小鼠 (图 1a)。
    注: 基因分型协议可在杰克逊实验室网站上找到。myh11 cre/ert2 转基因位于 y 染色体上, 不允许女性使用。其他血统追踪系统可以使用, 但该系统是迄今为止最可靠的血统追踪策略, 以确定动脉粥样硬化中 smc 的命运图。

2. 平滑肌细胞血统追踪小鼠饮食和治疗

  1. 让男性myh11-ert2+ r26r-eyfp+/+ apoe-\-小鼠从6周到8周接受一系列1毫克他莫西芬注射, 用 yfp 永久贴上 myh11 + smc的标签, 并跟踪它们的命运 (图 1)a)。
    1. 在55°c 加热花生油。
    2. 在预热花生油中加入他莫西芬, 在10mgml 时制备溶液, 在55°c 孵育, 直至他莫西芬完全溶解。
    3. 在两周内, 用 0.1 ml 的 10 mgml 他莫西芬溶液进行腹腔注射。
      注: 他莫西芬是一种生物危害, 必须小心处理。
  2. 最后一次注射他莫西芬后 5至7天, 用高脂肪饮食 (如西餐; 42% 的脂肪; 0.2% 总胆固醇) 代替食物饮食, 为期 18周, 以便发展晚期动脉粥样硬化病变,在包括主动脉弓、主动脉、臂头动脉和腹主动脉在内的多个血管床上不断发展。
  3. 在18周高脂肪饮食喂养时, 开始在所需时间内进行治疗干预 (图 1b)。
    注: 例如, 我们每周在18至26周的高脂肪饮食中, 用抗 il1β抗体或同位素匹配的 igg 控制进行腹腔内注射。
  4. 在组织采集前, 将食物移给快速小鼠 8至16小时, 以对血浆胆固醇和甘油三酯进行准确的读数。

3. 臂头动脉的采集

  1. 动物安乐死应遵循动物护理和使用委员会 (acuc) 的要求和规定。用 co2 窒息对实验小鼠进行约5分钟的安乐死, 并通过脚趾夹紧验证死亡情况。
  2. 称重鼠标并收集血液。
    1. 称重鼠标
    2. 用70% 乙醇喷洒小鼠腹侧
    3. 通过插入25g 针插入从胸腔左侧的心室1毫升注射器进行心脏穿刺。可以收集0.1 到1毫升的血液。
    4. 通过冲洗注射器将血液输送到 edta 真空管, 并将试管放在摇杆或转子上10-15。
    5. 在4°c 下将血液输送到 1.5 ml 管和离心机, 时间为 10分钟 250 x g 。小心地取出顶部等离子相位与移液器和足够的尖端, 并转移到一个新的管。在测量胆固醇和甘油三酯之前, 请在-20°c 下存放。
      注: 全血可用于其他研究, 包括血细胞计数和其他血液成分, 包括细胞因子或免疫细胞分析。
  3. 用剪刀在腹部中部的皮肤上做一个大约2厘米的切口, 拉皮肤露出腹腔。在不破坏组织的情况下, 将腹膜切割成胸骨。在腋下中线穿过胸部做两次切割, 注意不要损害心脏和肺。
  4. 用推子提起胸骨, 并将横隔膜部分暴露心脏。如果心脏不容易进入, 把胸腔剪掉, 足够到达右心房。
  5. 使用重力灌注系统完美地使用鼠标 (图 2a)。安装重力灌注系统, 使灌注液的压力相当于小鼠的平均血压 (图 2b)。该系统允许在灌注的一致性, 并既保持血管形态和冲洗红血球。
    注: 作为参考, c57bl6 小鼠的生理血压在120毫米汞柱 (平均收缩压) 和70毫米汞柱 (平均舒张压)29,30之间。平均收缩压和舒张压可能因小鼠遗传背景而异。
    1. 将23或25g 蝶针连接到重力灌注系统, 并通过针头运行磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 将空气从管中排出。将针头插入左心室, 并将针头固定到位。使用虹膜剪刀, 在右心房或上升的主动脉做一个小切口 (< 2 毫米)。
    2. 用5毫升的 pbs, 然后是10% 的4% 对苯二甲醛 (pfa) 溶液, 然后是5毫升的 pbs。在环境温度下同时使用 pbs 和 4% pfa 溶液。
    3. 收集感兴趣的组织 (如肝脏、肺、脾脏), 并将其放入 4% pfa 溶液中。
  6. 公开 bca
    1. 通过去除皮肤和唾液腺来清洁颈部区域。
    2. 用剪刀把胸骨的中线通过子剪下。注意剪刀保持靠近胸骨的背面, 以避免损坏位于胸骨下方的血管。用钳子拉住胸腔的两侧, 以完全打开胸腔。颈动脉应该是部分可见的。
    3. 通过拉扯肌肉和结缔组织, 用精细的推拿器去除脂肪, 直到右颈动脉, 腕头动脉, 锁骨下分叉和主动脉弓被清洗, 周围的结缔组织和脂肪被隔离 (图2c)。
  7. 删除 bca
    1. 使用钳子, 抓住它的分叉下方的右颈动脉, 并在钳子上方进行初始切割 (图 2d)。
    2. 还拿着颈动脉, 第二次穿过锁骨下动脉。最后两次割伤是通过主动脉弓, 在腕头动脉的两侧 (图 2d)。
    3. 收集其他感兴趣的血管组织 (例如, 腹主动脉, 心脏上半部分包含主动脉根)。
    4. 在室温下将 bca 和其他组织放入4% 的 pfa 溶液中过夜。
      注: 在整个研究过程中, 固定时间应保持一致。

4. 组织加工和切片

  1. 从4% 的 pfa 中取出组织, 放在贴有标签的纸巾盒中 (图 3a)。在盒式磁带中使用泡沫垫, 以确保纸巾保持其方向, 并在加工步骤中保持在盒式磁带中 (图 3b)。关闭盒式磁带并浸泡在70% 的乙醇中, 直到组织加工 (24 至 72h)。
    1. 处理 bca 和其他组织收集的组织学和免疫荧光染色如下 (使用真空渗透处理器的常规隔夜程序的例子): 10% 中性缓冲福尔宁在环境温度下 30分钟 (2x), 75%乙醇在 30°c (1x) 下 60分钟, 在 30°c (1x) 下, 90% 乙醇 60分钟, 30°c (1x) 时 60分钟, 30°c (3x) 时100% 乙醇 60分钟, 在 30°c (3倍) 下使用二甲苯 60分钟, 在 30°c (3倍) 下使用二甲苯 60分钟, 在 62°c (3倍) 下使用石蜡, 在80分钟内使用石蜡。
  2. 垂直嵌入 bca, 主动脉弓最接近块面 (图 3c)。
  3. 在旋转微孔 (厚度为 10μm) 上穿过石蜡块, 直到到达嵌入的组织。
  4. 一旦组织可见, 检查显微镜下的部分, 以确定位置。如果主动脉弓仍然可见, 一次最多取出10微米的部分, 在每个间隔检查一个部分。
  5. 当主动脉弓被分割, 并且臂头动脉是可见的, 调整块的方向, 以定位组织完全垂直于微生物片。
  6. 在10微米的截面厚度下切割 bca。此时, 将以每张幻灯片三个部分的顺序收集所有部分。收集, 直到达到锁骨下分叉 (图 3d)。
    注: 在10微米的截面厚度下切割 bca 对于后续 z 堆栈共聚焦图像采集和单细胞计数非常重要。这种厚度将允许严格和非共同建立评估之间的关联, 单个细胞核和细胞质或膜染色通过横截面的深度。

5. 免疫荧光染色

注: 动脉粥样硬化病变的完整表征包括评估形态参数和斑块稳定性或不稳定性指数和细胞组成, 这将不是本协议的重点。可分别用 movat7、17、p微天狼星 red 7、31、ter119 染色7、18进行分析. 在这里, 我们将描述用于分析病变细胞组成的协议。

  1. 在室温下, 在化学罩下对以下溶液中的幻灯片进行孵化: 二甲苯 5分钟 (2倍), 100% 乙醇 5分钟 (2倍), 95% 乙醇 5分钟 (2倍), 70% 乙醇 5分钟 (2倍), 去电离 h2o (dih 2x) 5分钟 (2倍).
  2. 根据制造商的指示, 在抗原检索解决方案中对幻灯片进行孵化。
    1. 用柠檬酸为基础的抗原解除掩蔽液 (见材料表), 在二至2o 的320 毫升中稀释3毫升溶液, 将幻灯片放入染色储液中, 用准备好的抗原回收溶液填充到顶部。
    2. 用空白幻灯片填充幻灯片架中的任何空插槽, 以确保均匀加热。用盖子覆盖容器, 使抗原回收溶液在不蒸发的情况下煮沸。
    3. 在微波炉中加热滑块 20分钟, 约675-700 瓦。定期检查滑梯, 用dih2o 代替蒸发液体, 使切片始终淹没在揭开掩蔽的溶液中。
    4. 允许滑块在室温下冷却溶液中的1小时。
  3. 在 pbs 的1升中溶解6克鱼皮明胶 (fsg)。使用 pbsssg 作为洗涤缓冲液。在 pbsssg 中制备10% 正常血清的阻断溶液。
    注: 鱼皮明胶用于制备阻滞缓冲液。fsg 不含血清蛋白, 可以与哺乳动物抗体交叉反应, 最大限度地减少背景噪音。然而, 其他阻止选项应首选与生物素检测系统, 因为 fsg 含有内源性生物素。使用的正常血清类型是基于所使用的二级抗体。当使用驴二级抗体时, 应选择正常的马血清进行阻断和抗体稀释。
  4. 在 pbs 中在室温下将幻灯片孵化5分钟。用疏水的笔环绕组织部分。在室温下, 用阻塞性缓冲液 pbssg 正常血清覆盖部分1小时。在此步骤中, 在组织阻塞期间, 在 pbsssgsp 正常血清中制备主要抗体溶液。
  5. 在4°c 的湿度室用原代抗体在 pbssgsg/正常血清中稀释过夜。每张幻灯片的一个部分应与与原发抗体浓度相同的 igg 控制抗体混合孵育, 以控制初级抗体特异性。
  6. 在室温下清洗幻灯片, 如下所示: pbsssg 5分钟 (3倍), 然后 pbs 5分钟 (1x)。
  7. 用氟结合二级抗体 (见材料表) 和二胺-2-苯林多内 (dapi) 在室温下在 pbssgsg 正常血清中稀释1小时的细胞核反染色。保护幻灯片不受光线影响。
  8. 按照步骤5.6 中的说明清洗幻灯片。
  9. 使用适用于荧光的安装介质安装幻灯片 (参见材料表)。

6. 共聚焦显微镜

注: 使用共聚焦显微镜和 z 堆栈采集对于单细胞计数至关重要。

  1. 设置要在整个研究过程中使用的采集参数: 图像分辨率 (1024x1024 或2048x2048 像素);光学路径和通道数, 这是所选择的二级抗体组合的函数;扫描速度 (推荐扫描速度: 7-8);和差分干扰对比度 (dic) 通道。
  2. 使用使用主要抗体和 igg 控制染色的部分, 为每个通道设置检测器灵敏度、激光功率和偏移。igg 控件用于最小化背景信号。
  3. 设置 z 堆栈采集的上、下位置。预先确定要获取的堆栈的厚度和数量。在整个研究过程中, 这些参数应保持一致。
    注: 我们建议对8至10个厚度为1μm 的堆栈进行成像。在整个研究过程中, 在成像的堆栈数量上保持一致。
  4. 图像组织切片染色的原生抗体和 igg 控制的所有渠道, 包括 dic。
  5. 在单个单元计数过程中, 使用刻度栏标记至少一个图像, 以进行图像校准。

7. 单细胞计数

  1. 安装并打开 imagej。如有必要, 请下载 imagej 网站的 "下载 > input\ 输出" 部分中的插件, 以打开根据共聚焦显微镜生成的图像格式生成的图像文件。
  2. 在 imagej 中打开图像文件。
  3. 使用6.6 中生成的图像使用参考刻度条校准图像。
  4. 确定将使用 dic 通道执行单个单元计数的感兴趣区域 (图 4)。
    注: 一次可以划定一个区域。根据实验问题, 单细胞计数可以在整个病变区域 (见7.3.1) 和/或在病变的升华。例如, 对纤维帽区域的调查 (见7.3.2) 尤其重要, 因为其细胞组成是病变破裂倾向的重要指标。
    1. 通过跟随 dic 图像上可见的流明边界 (图 4a; 白色箭头) 和内部弹性层 (图 4a; 黄色箭头) 来划分病变区域。
    2. 为了分析纤维帽面积, 确定与流明的边界距离为 30μm, 并追踪边界 (图 4b-d)。
      注: 纤维帽面积通常定义为在 acta2 + 细胞中丰富的区域和在腔下的胶原蛋白 (图 4b)。acta2 + 细胞和胶原蛋白的富集在病变稳定性中起着至关重要的作用。先前的研究已经确定, 在 smc 系追踪 apoe-/小鼠喂养高脂肪饮食 18至26周 (图 4c)时, acta2 + 细胞丰富的纤维帽面积平均为30μm。因此, 细致地描述基因操作或药理治疗对纤维帽区细胞组成的影响是非常相关的。
  5. 打开"通道工具" 面板 ( "图像 > 颜色 > 通道工具工具"), 并在不同的染色通道上使用伪色 (图 5a; 框 1)。
  6. 合并颜色通道 (图像 > 颜色 > 合并颜色) (图 5a; 框 2)。所有通道都应在同一图像上可见 (图 5b)。使用"通道工具"面板打开和关闭单个颜色通道 (图 5a; 框 1)。
  7. 设置计数工具。
    1. 右键单击工具栏中的计数图标 (图 5c; 框 1), 然后选择多点工具。
    2. 双击同一图标以打开 "点工具"面板 (图 5c; 框 2)。
    3. 选择用于计数单元格的项的类型和大小。
    4. 选中"全部显示".
  8. 仅在"通道工具" 面板中打开 dapi 通道, 然后选择计数器通道 0 (图 5c; 框 3)。单击将标记的单个原子核 (例如, 图 5c-d中的黄点)。滚动 z 堆栈来计算感兴趣区域中所有染色的原子核。事件数显示在点工具面板中的计数器通道下方 (图 5c; 框 4)。
  9. 打开另一个染色通道 (例如, yafp 染色)。选择计数器通道1。单击 dapi 和染色之间有共聚的单元格。对于细胞质染色, 选择细胞, 以染色包围细胞核的整个深度的细胞核 (检查几个 z 堆栈)。
  10. 重复此操作, 方法是修改染色组合, 并选择新的计数器通道来计算感兴趣的细胞群。每个点颜色代表不同的细胞群 (图 5d)。结果可以表示为细胞数量与 dapi 总数或区域区域区域的细胞数量的数量。

结果

myh11-cre/ert2 r26r-yfpapoe---小鼠在6至8周大的时间内注射了他莫西芬, 然后再吃高脂肪饮食。在18周的高脂肪饮食喂养中, 两组八只小鼠每周接受一次小鼠单克隆抗 il-1β抗体或同位素匹配的 igg 对照, 为期 8周 (图 1)7。用4% 的 pfa-pbs 溶液对小鼠进行了牺牲和灌注。如上文所述 (图 2和图 3

讨论

尽管在动脉粥样硬化的研究方面进行了几十年的研究和技术进步, 但该领域将科学发现转化为临床疗法的历史令人失望,34, 35.这种现象的部分原因可能是动物模型、实验设计和病变分析的差异。在此, 我们描述了一个实验管道, 我们用来分析细胞组成的晚期动脉粥样硬化病变使用谱系追踪小鼠7。这种方法可以对细胞命运图和表型进行细?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢匹兹堡大学生物成像中心 (由 nih 1S10OD019973-01 提供的支持) 的协助。这项工作得到了美国心脏协会科学发展赠款15sdg2580021 的支持, d. g. r. a. b. 得到了国家卫生研究院 f30 hl136188 赠款的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy SciencesRT 15710Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needleFisherBD367342
25G needleFisher14-821-13D 
A1 Confocal microscopeNikonConfocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse)Sigma AldrichF3777Primary Antibody
Alexa-647 anti goatInvitrogenA-21447Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid basedVector LabsH-3300Antigen retrieval solution
Chow DietHarlan TekladTD.7012
CoverslipFisher12-544-14Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbitInvitrogenA-21206Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-ratAbcamab150154Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and MagnesiumGibco14200166PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassetteFisher15-182-701D
ETDA vacuum tubeFisher02-685-2B
Ethanol 200 proofDecon2701
Foam padFisher22-222-012
Gelatin from cold water fish skinSigma AldrichG7765
GFP antibody (goat)abcamab6673Primary antibody
goat IgG controlVector LabsI-5000IgG control
High Fat DietHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHComputer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat)CedarlaneCL8942APPrimary antibody
LSM700 confocal microscopeZeissConfocal microscope
Microscope Slides, Superfrost PlusFisher12-550-15
Microtome bladesFisher30-538-35
Mouse IgG controlVector LabsI-2000IgG control
NIS element imaging softwareNikonImaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serumSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
Peanut oilSigmaP2144
Prolong gold Antifade mountantInvitrogenP36930Mounting medium 
Rabbit IgG controlVector LabsI-1000IgG control
Rat IgG controlVector LabsI-4000IgG control
RUNX2 antibody (rabbit)Abcamab192256Primary Antibody
SyringeBD3096281 ml syringe
TamoxifenSigmaT5648
XyleneFisherX55K-4
Zen imaging softwareZeissImaging software for z-stack image acquisition

参考文献

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