АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы предлагаем стандартизированный протокол характеризовать клеточного состава поздней стадии мышиных атеросклеротических поражений, включая систематические методы животных рассечение, встраивание ткани, секционирование, окрашивание и анализ плечеголовной артерии от atheroprone гладкомышечные клетки линии трассировки мышей.

Аннотация

Атеросклероза остается ведущей причиной смерти во всем мире, и, несмотря на бесчисленные доклинические исследования, описывающие перспективных терапевтических целей, Роман мероприятия остаются недостижимой. Это, вероятно, частично, обусловлено опоры на доклинических предупреждения модели, изучение последствий генетических манипуляций или фармакологических препаратов по развитию атеросклероза, а не установленного заболевания. Кроме того результаты этих исследований часто смешанные из-за использования поверхностных поражений анализов и отсутствие характеристика поражения клеточных популяций. Чтобы помочь преодолеть эти поступательные препятствия, мы предлагаем растущая зависимость модели вмешательства, которые используют исследование изменения клеточного состава на уровне отдельной ячейки immunofluorescent окрашивание и confocal микроскопии. С этой целью мы описываем протокол для тестирования предполагаемый терапевтический агент в модели мышиных вмешательства, включая систематический подход для животных рассечение, встраивание, секционирование, окрашивание и количественной оценки поражения плечеголовной артерии. Кроме того вследствие фенотипического разнообразия клеток в поздней стадии атеросклеротических поражений, опишем важность использования конкретных ячеек, индуцибельной линии трассировки мыши систем и как это может быть использованы для объективной характеристики атеросклеротические поражения клеточных популяций. Вместе эти стратегии могут помочь сосудистой биологи более точно модель терапевтических вмешательств и анализировать атеросклеротического заболевания и многообещающе будет перевести на более высокий уровень успеха в клинических испытаниях.

Введение

Атеросклероз является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире лежащие в основе большинства ишемической болезни сердца, заболевания периферических артерий, и инсульта. Поздней стадии коронарный атеросклероз может привести к тяжелых осложнений, включая учет миокарда нарушения почти 16% мирового населения смертности1,2. Из-за его разрушительное воздействие на общественное здравоохранение расшифровать механизмы вождения прогрессирование атеросклероза, а также разрабатывать новые терапевтические стратегии был достигнут значительные усилия. Тем не менее уровень вероятность утверждения (LOA) клинических испытаний для сердечно-сосудистых заболеваний является одним из самых низких по сравнению с другими клинических областях (только 8,7% для этапа I)3. Это можно объяснить отчасти многие барьеры, атеросклероз представляет для разработки эффективной лекарств, включая почти повсеместный характер, клинически молчаливый прогрессии и значительные болезни неоднородности. Кроме того субоптимальные дизайн доклинические исследования на животных также могут учитываться для отсутствие успеха в клинической перевода. В частности мы считаем, что это необходимо для осуществления вмешательства исследования возможности исследовать эффективность терапевтических стратегий. Кроме того ощущается насущная необходимость для выполнения стандартных процедур для поражения анализов, включая передовые характеристики поздней стадии атеросклеротических поражений клеточного состава судьба сопоставления и фенотип.

Подавляющее большинство исследований атеросклероза сосредоточиться на модели профилактики атеросклероза, состоящий из наркотиков лечения или гена манипуляций (нокаут или забивные) в здоровых молодых мышей, до начала болезни и прогрессии. Эти исследования обнаружили большое количество генов и сигнальных молекул, которые играют определенную роль в развитии атеросклероза. Однако большинство из этих целей не перевести на эффективной терапии в человека. Действительно трудно экстраполировать эффект терапии на здоровых молодых мышей для пожилых пациентов с передовых атеросклеротических поражений. Таким образом осуществление исследований вмешательства в доклинические экспериментальные конвейере вероятно обеспечивает более точное описание актуальность и эффективность нового терапевтического. Идея поддерживается поразительно различные эффекты ингибирующих провоспалительных цитокинов интерлейкина 1β (IL-1β) при найме предупреждения4,5,6 или вмешательства стратегия7. Различия между предотвращением и практические исследования показывают, что различные клеточные процессы происходят на разных этапах развития атеросклероза и подчеркивается тот факт, что предотвращение исследования, вероятно, недостаточно для моделирования клинических сценарий адекватно.

Американская ассоциация сердца недавно опубликовал научное заявление, подробно рекомендации для надлежащего экспериментальный дизайн, процедурные стандартизации, анализа и отчетности о животных атеросклероза исследования8. В нем освещаются преимущества и ограничения преобладающим методы, используемые в поле. Например en лицом Судан IV пятнать аорты часто выполняется как первого считывания. Хотя en лицом Судан IV пятнать липидов осаждения является подходящим методом для оценки глобальных налет бремя, она не может отличить ранней стадии жирных полоса поражений от более продвинутые поздней стадии поражения. Таким образом интерпретация en лицом окрашивание часто является двусмысленным и поверхностные9. Тщательный анализ ткани сечений, используя судно, поражения и Люмене размер морфологических параметров и количественной оценки показателей стабильности поражения обеспечивает более точное понимание последствий эксперимента.

Наконец человека гистопатология исследования показали, что клеточный состав является лучше предиктором разрыв чем сам, размер поражения с бедными поражений в клетках гладких мышц (SMC) и богатыми в макрофагах, которые более восприимчивы к разрыву10, 11. Эти замечания были основаны на окрашивание для маркеров, классически используется для идентификации клетки (то есть, ACTA2 для SMC и LGALS3 или CD68 для макрофагов). Однако выражение этих маркеров не является строго ограничивается одной ячейки типа в атеросклеротических поражений благодаря пластичности несколько линий, включая SMC, эндотелиальных клеток и миелоидных клеток12. В частности однозначной идентификации SMC в пределах атеросклеротического поражения было практически невозможно до последнего десятилетия из-за свойства этих клеток дедифференцироваться и подавления их линии конкретных маркерных генов (процесс называют Фенотипические переключение) в13раненых или больных сосудов. Это ограничение в SMC идентификации было обойти путем развития линии трассировки7,14,,1516,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. Он состоит из постоянно маркировки SMC и их потомства для отслеживания их судьба и фенотипические эволюции во время прогрессирование атеросклероза, используя комбинацию выражения рекомбиназа Cre, движимый SMC-конкретных промоутеров (т.е., Myh117,15,,1718,19,20,21,,2223 , 24,25, Acta226 и SM22α14,16) и активация журналистов (например, флуоресцентных белков, β-галактозидазы) [обзор в Bentzon и Majesky 201827]. В одном из первых исследований, используя SMC трассировки линии вне эмбриогенеза параметр Шпеер et al.14 представила доказательства того, что SMC может модулировать их фенотипа и transdifferentiate в хондрогенном клетки во время сосудистой кальцификации с помощью модель трассировки линии Cre R26R LacZ SM22α . Хотя эти исследования впервые трассировки линии SMC, они были частично двусмысленным в том, что выражая SM22α любого заданного номера SMC в параметре болезни будут обозначены репортер. Это ограничение было обойти путем разработки и использования тамоксифен индуцибельной Cre ERT/LoxP разрешительные временной контроль маркировки клеток. Маркировки клеток происходит исключительно во время доставки тамоксифен и будет ограничен в ячейку, выражая ячейки конкретного типа промоутер вождения Cre ERT выражение в то время экспозиции тамоксифен, избегая трассировки типов альтернативных клеток, активация КРР в Настройка прогрессирования заболевания. Для трассировки линии SMC в атеросклероза, тамоксифен индуцибельной Myh11- Cre/ERT2 трансген, связанные с журналистами флуоресцентные (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, конфетти20,,2223 клоновых расширения исследований) продемонстрировал замечательную эффективность и специфичность в SMC маркировки и имеет используется для населения SMC карта судьбы в атеросклеротических поражений в последних исследованиях. Важно отметить, что эти исследования показали, что: 1) 80% SMC в расширенный атеросклеротическим поражением ДУ не выразить любые обычные SMC маркеры (ACTA2, MYH11) используется в иммуногистохимического анализа и поэтому будет ошибочно без родословной трассировки 17; 2) подмножеств SMC Экспресс маркеры типов альтернативных клеток, включая маркеры макрофагов или мезенхимальных стволовых клеток маркеры16,,1719; и 3) SMC инвестировать и заполнить атеросклеротического поражения, расширение oligoclonal и SMC клоны сохраняют пластичности для перехода к фенотипически различных популяциях20,23. Итак, теперь ясно, что гладкомышечные клетки представляют замечательную фенотипического разнообразия в атеросклеротических поражений и может иметь положительное или ущерб роли в патогенезе поражений в зависимости от характера их фенотипические переходы. Эти открытия представляют собой замечательные новые терапевтические авеню для ориентации SMC athero содействие фенотипические переходы в поздней стадии атеросклероза.

Здесь мы предлагаем стандартный протокол для анализа поздней стадии мышиных атеросклеротических поражений, включая систематические методы для животных рассечение, встраивание, секционирование, окрашивание и количественной оценки поражения плечеголовной артерии. Чтобы определить влияние интерлейкинов 1β торможения на судьбу SMC и фенотип, мы использовали SMC линии отслеживания ароЕ- / - мышей кормили западной диеты в течение 18 недель до получения еженедельных инъекций антитела анти IL1β или управления IgG изотипа соответствием.

протокол

Животноводство, обработки и процедуры были утверждены Виргинского университета и университета Питтсбурга институционального ухода за животными и использования Комитетом.

1. поколение мышей трассировки линии SMC

  1. Породы Myh11мужчины - Cre/ERT228 (Лаборатория Джексон; #019079) с R26R-EYFP самок (Лаборатория Джексон; #006148), чтобы получить Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + мужчин.
  2. Порода - Cre/ERT2 Myh11+ R26R-EYFP+/ + мужчины с ароЕ- / - самок мышей (Лаборатория Джексон; #002052). Крест потомства и выберите по генотипированию Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ароЕ- / - мужчин и R26R-EYFP+/ + ароЕ- / - самок мышей как окончательный заводчиков. Обрезать хвосты и выполнить генотипирования однопометники. Все мужчины мыши должно быть Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ароЕ- / - и может использоваться в качестве экспериментальных мышей (рис. 1А).
    Примечание: Протоколы генотипирования можно найти на веб-сайте Лаборатория Джексон. Трансген Cre/ERT2 Myh11 расположен в Y хромосоме, исключающих использование женщин. Другие системы трассировки линии могут быть использованы, но эта система является на сегодняшний день наиболее надежным стратегию трассировки линии судьбы карта SMC в атеросклероза.

2. гладких мышц клеток линии отслеживание мыши диета и лечение

  1. У мужчин - Cre/ERT2 Myh11+ R26R-EYFP+/ + - / - мышей ароЕ получают серии инъекций 1 мг тамоксифен от шести до восьми недель возраста постоянно маркировать Myh11+ SMC с рекламы ЯФП и отслеживать их судьба (рис. 1 A).
    1. Тепла арахисовое масло при температуре 55 ° C.
    2. Добавление тамоксифен в предварительно нагретой арахисовое масло приготовляют раствор на 10 мг/мл и Инкубируйте на 55 ° C до полного растворения тамоксифен.
    3. Выполните внутрибрюшинной инъекции с 0,1 мл раствора 10 мг/мл тамоксифен для серии 10 инъекций более двух недель.
      Примечание: Тамоксифен биологической и должны быть обработаны с осторожностью.
  2. 5-7 дней после последнего введения тамоксифен, заменить Чоу диеты с высоким содержанием жиров (например, Западная диета; 42% ккал от жира 0,2% общего холестерина) продолжительностью в 18 недель, чтобы разрешить для развития передовых атеросклеротических поражений, которые последовательно развивается в нескольких сосудов кровати, включая аорты, корня аорты, плечеголовной артерии и брюшной аорты.
  3. В 18 недель, высоким содержанием жиров питание Начните терапевтического вмешательства для требуемой продолжительности (рис. 1Б).
    Примечание: В качестве примера, мы провели загрузок внутрибрюшинной инъекции с анти IL1β антитела или элемент IgG изотипа соответствием между 18 и 26 недель высоким содержанием жиров.
  4. Удаление продовольствия быстро мышей для 8-16 h до тканей, заготовки для выполнения точных результатов Плазменные холестерина и триглицеридов.

3. заготовка плечеголовной артерии (МДС)

  1. Эвтаназия животных должны следовать животное уход и использование Комитета (ACUC) требований и правил. Усыпить экспериментальной мышей CO2 удушение приблизительно 5 минут и проверить смерть, мыс пинча.
  2. Весят мыши и собирать кровь.
    1. Весят мыши
    2. Spray вентральной стороне мыши с 70% этанол
    3. Выполните сердечной прокол, вставляя иглу 25G подключен к 1 мл шприц в желудочке с левой стороны грудной полости. 0,1-1 мл крови могут быть собраны.
    4. Передать ЭДТА механотронное крови промывкой шприц и поместите трубки на качалку или ротатор для 10-15 мин.
    5. Передача крови 1,5 мл трубки и центрифуги для 10 минут 250 x g при 4 ° C. Осторожно снять этапа Топ плазмы с пипетки и адекватные советы и передачи новой трубки. Хранить при температуре-20 ° C до измерения холестерина и триглицеридов.
      Примечание: цельная кровь может использоваться для дополнительных исследований, включая клеток крови и других компонентов крови, включая цитокинов или профилирование иммунных клеток.
  3. Сделать надрез около 2 см в коже в середине живота с помощью ножницы и потяните кожу подвергать брюшной полости. Вырежьте брюшины до грудины без повреждения тканей. Сделайте два надреза в середине подмышечных линии через грудной клетки, стараясь не повредить сердце и легкие.
  4. Поднимите грудины с помощью пинцета и сократить диафрагму частично подвергать сердце. Если сердце не является легко доступной, срезаем грудной клетки достаточно, чтобы добраться до правого предсердия.
  5. Perfuse мышь с системой перфузии гравитации (рисA). Установка системы перфузии гравитации, таким образом, что давление жидкости перфузии эквивалентен средняя мышиных кровяного давления (рис. 2B). Эта система позволяет для последовательности в перфузии и поддерживает оба судна морфологии и сбрасывает красных кровяных клеток.
    Примечание: Как ссылка, C57Bl6 мышей у физиологическое кровяное давление между 120 мм рт.ст. (среднего систолического артериального давления) и 70 мм рт.ст. (средняя диастолическое артериальное давление)29,30. Средняя систолическое и диастолическое кровяное давление может варьироваться с мыши генетический фон.
    1. Подключите 23 или 25G Бабочка иглы к системе перфузии гравитации и запустить фосфат амортизированное Saline (PBS) через иглу изгнать воздух из трубы. Вставить иглу в левый желудочек и зафиксируйте иглы в месте. С помощью ножниц Ирис, Сделайте небольшой надрез (< 2 мм) в правое предсердие или восходящей части аорты.
    2. Perfuse с 5 мл PBS, затем 10 мл 4% раствора параформальдегида (PFA), затем 5 мл ФСБ. Используйте решение PFA PBS и 4% при температуре окружающей среды.
    3. Собирать ткани интерес (например, печени, легких, селезенки) и поместите их в 4% раствор PFA.
  6. Разоблачить BCA
    1. Чистота области шеи путем удаления кожи и слюнных желез.
    2. Выполнение одной сократить срединной линии грудины через рукоятка, с помощью ножниц. Будьте осторожны, что ножницы остаться близко к задней части грудины, чтобы избежать повреждения сосудистую, тесно расположенные ниже грудины. Вытяните обе стороны грудной клетки с щипцами полностью открыть грудной полости. Аорт должно быть частично видимым.
    3. Очистка, потянув мышц и соединительной ткани и удаление жира с помощью пинцета, штраф до правой сонной артерии, плечеголовной артерии подключичные бифуркации аорты очищены и изолированной окружающей соединительной ткани и жира (Рисунок 2C).
  7. Удаление BCA
    1. С помощью щипцов, захватить правой сонной ниже его раздвоения и первоначальный голову выше щипцы (Рисунок 2D).
    2. Все еще держа сонной артерии, сделайте второй разрез через подключичной артерии. Окончательный два разрезы через аорты, по обе стороны плечеголовной артерии (Рисунок 2D).
    3. Сбор других сосудистых тканей интерес (например, брюшной аорты, Улучшенный часть сердца, содержащий корня аорты).
    4. Место BCA и другие ткани в 4% раствор PFA на ночь при комнатной температуре.
      Примечание: Время фиксации должны быть постоянной в течение всего исследования.

4. ткань обработки и секционирование

  1. Удаление ткани от 4% PFA и место в кассету Приклеенные этикетку ткани (рис. 3А). Использование пены колодки в кассету для обеспечения ткани сохраняют свою ориентацию и остается в кассету через шаг обработки (рис. 3B). Закройте кассеты и погрузиться в 70% этанол до тканей, обработки (24-72 ч).
    1. Процесс BCA и другие ткани, собранные для гистологического и immunofluorescent окрашивание следующим образом (пример рутинной процедурой в течение ночи, использование процессора с вакуумной проникновения): 10% нейтральные буферизуются формалином для 30 мин при температуре (2 x), 75% этанол 60 мин при 30 ° C (1 x), 90% этанола для 60 мин при 30 ° C (1 x), этанол 95% за 60 мин при 30 ° C (1 x), 100% этанола для 60 мин при 30 ° C (3 x), ксилол 60 мин при 30 ° C (3 x) и парафин для 80 мин на 62 ° C (3 x).
  2. Внедрить BCA вертикально, с аорты ближе к поверхности блока (рис. 3C).
  3. Вырежьте через блок парафин микротом роторный (10 мкм толщина) до достижения встроенных ткани.
  4. Как только ткань является видимым, изучите раздел под микроскопом для определения позиции. Если все еще виден аорты, удалите до десяти 10 мкм разделы одновременно, изучения раздела на каждом интервале.
  5. Когда аорты была секционного через и плечеголовной артерии является видимым, Отрегулируйте ориентацию блока в положение ткани полностью перпендикулярно ножа микротома.
  6. Вырежьте BCA на секции толщиной 10 мкм. В тот момент все разделы собираются серийно с тремя разделами на слайд. Собирайте до достижения подключичные бифуркации (рис. 3D).
    Примечание: Важно сократить BCA на секции толщиной 10 мкм для последующих z стек конфокальное изображение приобретения и одноклеточного подсчета. Эта толщина позволит строгий и не cofounding оценки ассоциации между одного ядра и цитоплазмы или мембраны, пятнать хотя глубина поперечного сечения.

5. immunofluorescent окрашивание

Примечание: Полной характеристики атеросклеротических поражений включает оценку морфологических параметров и показателей стабильности налета или нестабильности и клеточного состава, который не будет в центре внимания настоящего Протокола. Поражением морфологии, содержание коллагена и intraplaque кровоизлияния могут быть проанализированы по Movat7,17, PicroSirius Red 7,31, Ter119 окрашивание 7,18, соответственно. Здесь мы будем описывать протокол для анализа состав клеточных повреждений.

  1. Инкубируйте слайды в следующих решениях при комнатной температуре под капотом химического: Ксилол за 5 мин (2 x), 100% этанола за 5 мин (2 x), этанол 95% для 5 мин (2 x), этанол 70% для 5 мин (2 x) и деионизированную H2O (diH2O) за 5 мин (2 x).
  2. Инкубируйте слайды в антиген поиска решения согласно инструкции производителя.
    1. С лимонной кислотой антигена демаскирующих решение на базе (см. Таблицу материалы), разбавить 3 мл раствора в 320 мл diH2O. место слайды в окрашивание резервуара и заполнить на вершину с подготовленной антигена поиска решения.
    2. Заполните любые пустые слоты в стойке слайд с пустых слайдов обеспечить равномерный нагрев. Обложка контейнер с крышкой, чтобы позволить антигена поиска решения варить без испарения.
    3. Тепло слайды в микроволновую печь на 20 мин в приблизительно 675-700 Вт. Проверьте слайды регулярно и заменить испарится жидкость с diH2O такие, которые разделы остаются погруженной в разоблачении решения во все времена.
    4. Разрешить слайды остыть в растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Растворите 6 g рыбы кожу желатина (ФСГ) в 1 Л PBS. PBS/FSG используется как отмывающего буфера. Приготовляют блокирующий раствор 10% нормальной сыворотки в PBS/FSG.
    Примечание: Рыба кожи желатин используется в подготовке блокировки буфера. FSG не содержат сыворотку белков, которые могут cross-react с млекопитающих антител, минимизации фонового шума. Однако другие блокирования должно быть предпочтительным с системами обнаружения биотина FSG содержит эндогенный биотин. Тип нормальной сыворотки используется основан на вторичные антитела, используемые. Когда осел вторичные антитела используются, сыворотке нормальный лошади должны выбираться для блокирования и антитела разведениях.
  4. Инкубируйте слайды в PBS для 5 мин при комнатной температуре. Разделах ткани в круг с гидрофобным пера. Охватывают разделы с блокирующий буфер PBS/ФСГ/нормальной сыворотки 1 ч при комнатной температуре. Подготовьте раствор основной антител в сыворотке PBS/ФСГ/нормальный во время этого шага, в то время как блокирование тканей.
  5. Проинкубируйте с первичных антител, разбавленных в PBS/ФСГ/нормальной сыворотки на ночь при 4 ° C в камере влажности. Один раздел на слайд следует инкубировали с смесь антител IgG управления на такой же концентрации как основного антитела к управления для основного антитела специфичности.
  6. Вымойте слайды следующим при комнатной температуре: PBS/FSG 5 мин (3 x), затем PBS для 5 мин (1 x).
  7. Инкубируйте с Флюорофор конъюгированных вторичные антитела (см. Таблицу материалы) и diamidino-2-phenylindole (DAPI) ядро counterstaining разводят в PBS/ФСГ/нормальной сыворотки 1 ч при комнатной температуре. Защищайте от света слайды.
  8. Вымойте слайды, как описано в шаге 5.6.
  9. Смонтировать слайды с помощью монтаж носителей, подходящих для флуоресценции (см. Таблицу материалы).

6. конфокальная микроскопия

Примечание: Использование Конфокальный микроскоп и приобретение z стека имеет решающее значение для подсчета одной ячейки.

  1. Задать параметры приобретения использоваться на протяжении всего исследования: изображения резолюции (1024 x 1024 или 2048 x 2048 пикселей); Оптического пути и количество каналов, которые являются функцией комбинацию вторичных антител выбран; скорость сканирования (рекомендуется скорость сканирования: 7-8); и дифференциальной помехи контраст (DIC) канала.
  2. Использование секций, окрашенных и первичных антител IgG управления, установите чувствительность детектора, мощность лазера и смещение для каждого отдельного канала. IgG управления используется для минимизации фонового сигнала.
  3. Установите вверх верхней и нижней позиции для приобретения z стека. Предопределяют толщины и количество стеков для приобретения. Эти параметры должны оставаться постоянной в течение всего исследования.
    Примечание: Мы рекомендуем изображений 8 до 10 штабеля толщиной 1 мкм. Оставаться последовательной в количество стеков, отображаемого на протяжении всего исследования.
  4. Изображения из разделов ткани окрашивали первичных антител и IgG управления для всех каналов, включая DIC.
  5. Ярлык по крайней мере одно изображение с линейки для калибровки изображения во время подсчета одну ячейку.

7. одну ячейку подсчета

  1. Установка и запуск ImageJ. При необходимости, скачать плагины в разделе скачать > ввода/вывода из ImageJ веб-сайт, чтобы открыть файл изображения создаются в зависимости от формата изображений, генерируемых конфокального микроскопа.
  2. Откройте файл изображения в ImageJ.
  3. Калибровка изображения с ссылкой шкалы используя изображения, созданные в 6,6.
  4. Разграничить области интереса, в котором одну ячейку подсчет будет осуществляться с помощью DIC канал (рис. 4).
    Примечание: Один регион могут быть определены одновременно. В зависимости от экспериментальных вопросов, считая одной ячейки может быть выполнена в поражения всей области (см. 7.3.1) и/или в район поражения. Например расследование области волокнистые Кап (см. 7.3.2) имеет особое значение, поскольку его клеточного состава является важным индекс поражения склонность к разрыву.
    1. Разграничить области поражения, следуя люмен границы (рис. 4A; белые стрелки) и внутренней упругой пластинки (рис. 4A; Желтые стрелки) видно на изображении DIC.
    2. Для анализа области волокнистые Кап определить границы далекие 30 мкм от просвета и отслеживать границы ( рис. 4B-D).
      Примечание: Классически области волокнистые Кап определяется как региона, обогащенный ACTA2 + клетки и коллаген нижележащего люмен (Рисунок 4B). Обогащения в ACTA2 + клеток и коллаген играет важную роль в стабильности поражения. Предыдущие исследования определили, что область ячейки богатых фиброзной Кап ACTA2 + средние толщиной 30 мкм от просвета в SMC-линии отслеживания ароЕ- / - мышей кормили высоких жиров 18 до 26 недель (рис. 4C). Таким образом дотошный характеристика влияния генетических манипуляций или медикаментозное лечение на клеточный состав области волокнистые Кап чрезвычайно актуальна.
  5. Открыть панель Инструментов каналы (изображение > Цвет > инструменты канала) и псевдо-различные цвета окрашивания каналов (рис. 5A; Вставка 1).
  6. Слияние цветовые каналы (изображение > Цвет > слияния цвета) (рис. 5A; вставку 2). Все каналы должны быть видны на то же изображение (рис. 5B). Включение и выключение отдельных цветовых каналов, с помощью панели Инструментов канала (рис. 5A; Вставка 1).
  7. Настройте средство подсчета.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши на значке подсчета в панели инструментов (рис. 5C; Вставка 1) и выберите Многоточечный инструмент.
    2. Дважды щелкните на тот же значок, чтобы открыть панели Инструментов точки (рис. 5C; вставку 2).
    3. Выберите тип и размер элементов, используемых для подсчета клеток.
    4. Проверьте, Показать все.
  8. Включите канал DAPI только в панели Инструментов канал и выберите счетчик канал 0 (рис. 5C; вставку 3). Нажмите на отдельных ядер, которые будут помечены (например, желтые точки на рис. 5C-D). Прокрутки z стеки для подсчета всех ядер, окрашенных в регионе интереса. Количество событий, указанных ниже счетчика канал в Точку, инструмент панели (рис. 5C; вставку 4).
  9. Включите другой окрашивание канал (например, eYFP окрашивание). Выберите счетчик канал 1. Щелкните ячейки, в которых есть colocalization между DAPI и пятнать. Для окрашивания цитоплазмы, выберите ячейки для окрашивания окружает ядро на всю глубину ядра (проверить несколько z стеки).
  10. Повторите, изменяя пятнать комбинаций и выбор новых каналов счетчик для подсчета популяции клеток интерес. Каждый цвет точка представляет население различных клеток (рис. 5D). Результаты могут быть выражены как количество клеток на общее количество DAPI или количество клеток в области.

Результаты

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP ароЕ- / - мышей вводили тамоксифен от шести до восьми недель возраста до кормили высоких жиров. В 18 недель, высоким содержанием жиров питание две группы восьми мышей лечили еженедельно с мыши моноклональные антитела анти ИЛ 1β или элемент IgG изот?...

Обсуждение

Несмотря на десятилетия научно-технические достижения в изучении атеросклероза поле имеет разочарование истории перевода научных выводов по клинической терапии34,35. Это явление может частично объяснить расхождения в животных моделях, экспериментальны...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим центр за биологическими Imaging (поддерживается низ 1S10OD019973-01) в университете Питтсбурга за их помощь. Эта работа была поддержана, поддерживается грантом научного развития 15SDG25860021 от Американской ассоциации сердца к R.A.B. д.г. была поддержана NIH Грант F30 HL136188.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy SciencesRT 15710Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needleFisherBD367342
25G needleFisher14-821-13D 
A1 Confocal microscopeNikonConfocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse)Sigma AldrichF3777Primary Antibody
Alexa-647 anti goatInvitrogenA-21447Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid basedVector LabsH-3300Antigen retrieval solution
Chow DietHarlan TekladTD.7012
CoverslipFisher12-544-14Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbitInvitrogenA-21206Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-ratAbcamab150154Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and MagnesiumGibco14200166PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassetteFisher15-182-701D
ETDA vacuum tubeFisher02-685-2B
Ethanol 200 proofDecon2701
Foam padFisher22-222-012
Gelatin from cold water fish skinSigma AldrichG7765
GFP antibody (goat)abcamab6673Primary antibody
goat IgG controlVector LabsI-5000IgG control
High Fat DietHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHComputer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat)CedarlaneCL8942APPrimary antibody
LSM700 confocal microscopeZeissConfocal microscope
Microscope Slides, Superfrost PlusFisher12-550-15
Microtome bladesFisher30-538-35
Mouse IgG controlVector LabsI-2000IgG control
NIS element imaging softwareNikonImaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serumSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
Peanut oilSigmaP2144
Prolong gold Antifade mountantInvitrogenP36930Mounting medium 
Rabbit IgG controlVector LabsI-1000IgG control
Rat IgG controlVector LabsI-4000IgG control
RUNX2 antibody (rabbit)Abcamab192256Primary Antibody
SyringeBD3096281 ml syringe
TamoxifenSigmaT5648
XyleneFisherX55K-4
Zen imaging softwareZeissImaging software for z-stack image acquisition

Ссылки

  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены