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요약

우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.

초록

동맥 경화 남아 죽음은 전세계의 주요 원인이 고, 유망한 치료 목표를 설명 수많은 임상 연구에도 불구 하 고 소설 개입 하기 어려운 남아 있다. 이것은 가능성이 인해, 부분적으로, 설립된 질병 보다는 오히려 유전 조작 또는 아 테 롬 개발에 약물 치료의 효과 조사 하는 임상 예방 모델에 대 한 신뢰. 또한, 이러한 연구의 결과 종종 혼동 표면 병 변 분석의 사용 및 병 변 세포 인구 특성의 부족 때문에. 이러한 변환 장애물을 극복 하기 위해, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지 고 confocal 현미경 검사 법에 의해 단일 세포 수준에서 세포 구성에서 변경의 조사를 고용 하는 개입 모델에 증가 신뢰를 제안 합니다. 이 위해, 우리는 murine 개입 모델 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 접근을 포함 하 여 상 상속 치료 에이전트를 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 더하여, 단계의 동맥 경 화성 병 변 내의 세포의 phenotypic 다양성으로 인해 셀 전용, 유도할 수 있는 혈통 추적 마우스 시스템 및 어떻게이 편견된 특성에 대 한 활용할 수 있는 사용의 중요성 설명 동맥 경 화성 병 변 세포의 인구 함께, 이러한 전략 혈관 생물학 더 정확 하 게 치료 개입 모델 동맥 경 화성 질환 분석을 지원할 수 있다 하 고 잘하면 임상 시험에 성공의 높은 속도으로 번역할 것 이다.

서문

동맥 경화 병 적 상태와 사망률 전세계 기본 관상 동맥 질환, 말 초 동맥 질환 및 뇌졸중의 대부분의 주요 원인입니다. 단계의 관상 동맥 경화는 심근 위반 회계 세계 인구 사망률1,2의 거의 16%를 포함 하 여 심각한 합병증으로 이어질 수 있습니다. 때문에 공중 보건에 미치는 파괴적인 영향, 상당한 노력이 했다 비 발한 치료 전략 개발로 동맥 경화 진행을 운전 메커니즘을 해독. 그러나, 심장 혈관 질환에 대 한 임상 시험의 승인 가능성 (LOA) 속도 (단 대 8.7% 단계) 다른 임상 분야와 비교할 때 낮은 중3입니다. 이 설명 될 수 있는 부분에 많은 방 벽에 의해 그 롬 포즈 효율적인 신약 개발 거의 유비 쿼터 스 자연, 침묵-임상 진행 및 중요 한 질병이 포함. 또한, 전 임상 동물 연구의 차선 디자인 또한 임상 번역에 성공의 부족에 대 한 차지 수 있습니다. 특히, 우리는 개입 연구 가능한 치료 전략의 효능을 조사 하기 위해 구현 해야 하는 것을 믿는다. 또한, 병 변 분석 단계의 동맥 경 화성 병 변 세포 구성의 고급 특성을 포함 하 여 운명 매핑 및 형질에 대 한 표준화 된 절차를 수행 하는 중요 한 필요가 있다.

아 테 롬 연구의 대부분은 동맥 경화 예방 약물 치료 나 유전자 조작 (녹아웃 또는 노크-) 질병 개시 및 진행 하기 전에 건강 한 젊은 쥐에서 구성 된 모델에 초점. 이러한 연구는 유전자 및 아 테 롬 개발에 역할을 하는 신호 분자의 많은 수를 발견 했다. 그러나, 이러한 목표의 대부분 인간의 효율적인 치료를 번역 하지 못했습니다. 사실, 고급 동맥 경 화성 병 변 노인 환자에 게 건강 한 젊은 쥐에는 치료 효과 추정 하는 것이 어렵습니다. 등, 구현 가능성이 전 임상 실험 진행중 개입 연구의 관련성 및 새로운 효능 치료의 더 정확한 묘사를 제공 한다. 아이디어는 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨-1β (IL 1β)을 억제 하는 예방4,,56 또는 개입 전략7을 사용 하는 경우의 현저 하 게 분기 효과 의해 지원 됩니다. 예방 및 개입 연구의 차이점 제안 다른 세포질 과정 동맥 경화 증 개발의 여러 단계에서 발생 하 고 예방 연구 가능성이 있다는 사실을 강조 임상 시나리오를 모델링 하는 데 부족 한 적절 하 게.

미국 심장 협회는 최근 과학 문을 자세히 적절 한 실험 설계, 절차 표준화, 분석, 및 동물 아 테 롬 연구8의 보고에 대 한 권장 사항을 출판. 그것은 혜택 및 필드에 사용 되는 주된 기술의 한계를 강조 표시 합니다. 예를 들어 en 얼굴 수단 IV는 대동맥의 얼룩 종종 첫 번째 읽기로 수행 됩니다. En 얼굴 수단 IV의 지질 증 착 얼룩 글로벌 패 부담에 대 한 평가 적당 한 방법 이지만, 고급 단계의 병 변 초기 단계 지방 조 흔 병 변을 구별할 수 아니다. 이와 같이, en 얼굴 얼룩의 해석 종종 모호 하 고 피상적인9입니다. 조심 분석 조직의 횡단면 형태 론 적 매개 변수 그릇, 병 변, 고 루멘 크기와 병 변 안정성의 지표의 정량화를 사용 하 여 실험의 효과의 더 정확한 이해를 제공 합니다.

마지막으로, 인간의 histopathology 연구 세포 구성 부드러운 근육 세포 (SMC)에 병 변 가난한와 풍부한 세포10, 파열을 더 따르게 되 고, 병 변 크기 보다 파열의 더 나은 예언자는 제안 했다 11. 이러한 관측 마커 고전적인 셀 식별에 사용에 대 한 얼룩에 근거 했다 (즉, SMC 및 LGALS3 또는 세포에 대 한 CD68 ACTA2). 그러나, 이러한 마커 표현의 여러 계보 SMC, 골수성 세포12, 내 피 세포 등의 동맥 경 화성 병 변에서가 소성 때문에 단일 셀 형식에 엄격 하 게 제한 되지 않습니다. 특히, 동맥 경 화성 병 변 내 SMC의 명확한 식별 사실상 불가능 했다 지난 10 년간까지 dedifferentiate 및 그들의 계보 특정 마커 유전자 (프로세스 라고 참다 이러한 셀의 속성 때문에 phenotypic 스위칭) 부상 또는 질병 혈관13에. SMC 식별에서이 제한 혈통 추적7,14,15,,1617,18, 의 개발에 의해 피할 되었습니다. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 영구적으로 Cre recombinase SMC 특정 발기인에 의해 구동의 식의 조합을 사용 하 여 동맥 경화의 진행 하는 동안 그들의 운명 및 phenotypic 발전을 추적 하는 SMC와 그들의 자손을 라벨로 구성 됩니다 (즉, Myh117,15,17,18,19,20,21,,2223 , 24, Acta225,26 , SM22α14,16)와 기자 (형광 단백질, β-galactosidase) [검토 Bentzon와 Majesky의 활성화 201827]입니다. 첫 번째 연구 채용 embryogenesis 설정 외부 SMC 혈통 추적 중 하나에서 Speer 외.14 는 SMC 수 변조 그들의 표현 형 및 transdifferentiate chondrogenic 세포로 혈관 석 회화 하는 동안 사용 하 여 증거를 제공 SM22α Cre R26R LacZ 혈통 추적 모델. 그 질병의 설정에서 어떤 주어진된 비 SMC 표현 SM22α 기자에 의해 표시 된 것이 이러한 연구 개척 SMC 혈통 추적, 비록 그들은 부분적으로 애매 했다. 이 제한 사항은 개발 및 사용의 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cre ERT/LoxP 셀 라벨의 일시적인 제어 허용에 의해 무시 되었습니다. 셀 라벨 tamoxifen 전달 중 독점적으로 발생 하 고 다른 종류의 세포에 Cre 활성화 추적을 피하고 셀 형식 관련 발기인 Cre ERT 식 tamoxifen 노출 시간에 운전을 표현 하는 셀을 제한 될 것 이다는 질병의 진행의 설정입니다. 동맥 경화, tamoxifen을 유도할 수 있는 Myh11-Cre/ERT2 transgene 형광 기자 (eYFP7,15,,1718 연관에 SMC의 혈통 추적에 대 한 , 21, mTmG19,25, 클론 확장 연구 색종이20,,2223 ) 놀라운 효율성과 SMC 라벨에 특이성을 입증 했다 고 최근 연구에서 동맥 경 화성 병 변에서 운명 지도 SMC 인구에 사용 되었습니다. 중요 한 것은, 이러한 연구는 계시 했다: 1) SMC의 80% 이내 고급 동맥 경 화성 병 변 할 표현 하지 어떤 기존의 SMC 마커 (ACTA2, MYH11) immunohistological 분석에 사용 하 고 따라서 것가지고 되었습니다 오인 혈통 추적 없이 17; 다른 종류의 세포 대 식 세포 마커 또는 중간 엽 줄기 세포 마커16,,1719;를 포함 하 여 마커를 표현 하는 2) SMC의 하위 집합 그리고 3) SMC 투자 oligoclonal 확장 동맥 경 화성 병 변 채울 및 SMC 클론 phenotypically 다른 인구20,23전환가 소성 유지. 요약, 그것은 이제 분명 부드러운 근육 세포 동맥 경 화성 병 변에서 놀라운 phenotypic 다양성을 제시 하 고 그들의 phenotypic 전환의 성격에 따라 병 변 병에 유익한 또는 해로운 역할을 가질 수 있습니다. 이러한 발견 단계의 동맥 경화에 athero 홍보 phenotypic 전환 SMC 대상에 대 한 놀라운 새로운 치료 애비뉴를 나타냅니다.

여기, 우리는 분석 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변을 포함 하 여 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 방법에 대 한 표준화 된 프로토콜을 제안 합니다. SMC 운명과 표현 형에 인터 루 킨-1β 억제의 효과 확인 하려면 우리는 SMC 혈통 ApoE-/- 생쥐는 안티-IL1β 항 체의 IgG 제어 isotype 일치 주간 주사를 받기 전에 18 주 동안 서쪽 규정식 먹이 추적을 사용 합니다.

프로토콜

동물 사육, 처리 및 절차는 버지니아의 대학 및 피츠버그 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 세대 SMC 혈통 추적 마우스의

  1. Myh11-Cre/ERT2 남성28 번 식 (잭슨 실험실; #019079) R26R-EYFP 여성와 (잭슨 실험실; #006148)를 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + 남성.
  2. 번 식 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE-/- 여성 쥐와 남성 (잭슨 실험실, #002052). 자손을 교차 하 고 유전형 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP에 의해 선택+ + ApoE-/- 남자와 R26R-EYFP+ + 최종 종 축으로 ApoE-/- 여성 쥐. 꼬리를 클립 하 고 유전형 littermates에서 수행. 모든 남성 쥐 해야 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE-/- 실험 쥐 (그림 1A)로 사용 될 수 있다.
    참고: 유전형 프로토콜 잭슨 실험실 웹사이트에서 찾을 수 있습니다. Myh11 Cre/ERT2 transgene은 암컷의 사용을 제외 하는 Y 염색체에 있습니다. 다른 계보 추적 시스템을 사용할 수 있습니다, 하지만이 시스템은 가장 신뢰할 수 있는 혈통 추적 전략 운명 지도 SMC 동맥 경화에 데이트.

2. 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스 식이 요법과 치료

  1. 남성 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE-/- 생쥐를 영구적으로 Myh11 나이의 8 주 6 1 mg tamoxifen 주사의 시리즈를 받을+ SMC YFP와 그들의 운명 (그림 1 을 추적 하 A)입니다.
    1. 55 ° c.에 열 땅콩 기름
    2. 10 mg/mL에서 솔루션을 준비 하 고 55 ° C에서 tamoxifen의 완전 한 해체까지 품 어를 미리가 열된 땅콩 기름에 tamoxifen을 추가 합니다.
    3. 2 주 동안 10 주사의 시리즈에 대 한 tamoxifen 솔루션 10 mg/mL의 0.1 mL와 함께 복 주사를 수행 합니다.
      참고: Tamoxifen는 생물 이며, 관리와 처리 해야 합니다.
  2. Tamoxifen와 마지막 주입 후 5 ~ 7 일 고급 동맥 경 화성 병 변의 개발에 대 한 허용을 18 주 동안 높은 지방 다이어트 (예를 들어, 서양 다이어트 42% 지방에서 kcal, 0.2% 총 콜레스테롤)와 차 우 다이어트를 대체 하 지속적으로 대동맥 아치, 대동맥 루트, brachiocephalic 동맥 및 복 부 대동맥을 포함 하 여 여러 혈관 침대에서 발전 한다.
  3. 높은 지방 다이어트를 먹이의 18 주, 원하는 기간 (그림 1B)에 대 한 치료 적 개입을 시작 합니다.
    참고: 예를 들어, 우리는 안티-IL1β 항 체 또는 isotype 일치 IgG 제어 높은 지방 다이어트의 18와 26 주 사이 주간 복 주사를 수행.
  4. 8 ~ 16 h 이전에 수확 하는 플라즈마 콜레스테롤과 트리 글리세라이드에 대 한 정확한 판독을 수행 하는 조직에 대 한 빠른 마우스 식품을 제거 합니다.

3. Brachiocephalic 동맥 (BCA)의 수확

  1. 동물 안락사는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) 요구 사항 및 규정을 따라야 합니다. Approximatively 5 분 CO2 질 식에 의해 실험 쥐를 안락사 고 발가락 핀치에 의해 죽음을 확인 합니다.
  2. 마우스 무게 및 혈액을 수집 합니다.
    1. 마우스 무게
    2. 마우스의 복 부 측 스프레이 70% 에탄올
    3. 1 mL 주사기는 심 실에 흉의 왼쪽에서 연결 25g 바늘을 삽입 하 여 심장 펑크를 수행 합니다. 혈액의 0.1 ~ 1 mL은 수집할 수 있습니다.
    4. 주사기를 홍 조에 의해 EDTA 진공 튜브에 혈액을 전송 하 고 로커 또는 10-15 분에 대 한 회전에 튜브를 놓습니다.
    5. 1.5 mL 튜브 및 원심 분리기 g 에 4 ° c.에서 10 분 250 x에 대 한 혈액을 전송 신중 하 게는 피 펫 및 적절 한 팁, 최고의 플라즈마 단계를 철회 하 고 새 튜브를 전송. 콜레스테롤 및 트리 글리세라이드를 측정 하기 전에-20 ° C에서 저장 합니다.
      참고: 전체 혈액 혈 구 수와 cytokines 또는 면역 셀 프로 파일링을 포함 하 여 다른 혈액 구성 요소를 포함 하 여 추가 연구에 대 한 사용할 수 있습니다.
  3. 확인 사용 하 여 중간 복 부 피부에 approximatively 2cm의 절 개가 위 및 복 부 구멍을 노출 피부를 당겨. 조직에 손상 없이 흉 골까지 복을 잘라. 흉부, 심장 및 폐 손상 되지 않도록 주의 되 고 통해 중간 겨드랑이 라인에서 두 컷을 확인 합니다.
  4. 핀셋으로 흉 골을 들어올리고 부분적으로 마음을 폭로 하는 다이어 프 램을 잘라 합니다. 마음에 쉽게 액세스할 수 없는 경우 잘라 거리 만큼 오른쪽 아 트리 움 도달 하는 흉 곽.
  5. 중력 관류 시스템 (그림 2A) 마우스 perfuse 관류 액체의 압력은 평균 murine 혈압 (그림 2B)는 중력 관류 시스템을 설치 합니다. 이 시스템 관류에 일관성과 모두 선박 형태 및 플러시 붉은 혈액 세포를 유지 합니다.
    참고: 참고로 C57Bl6 마우스는 physiologic 혈압 120 mmHg (평균 수축 기 혈압)과 70 mmHg (평균 확장기 혈압)29,30사이. 평균 수축 기 및 확장기 혈압 마우스 유전 배경으로 달라질 수 있습니다.
    1. 연결 하는 23 또는 25 G 나비 바늘 중력 관류 시스템을 튜브에서 공기를 추방 하는 바늘을 통해 염 인산 염 버퍼 (PBS)를 실행. 좌 심 실에 바늘을 삽입 하 고 자리에 바늘을 확보. 아이리스가 위를 사용 하 여 오른쪽 아 트리 움 또는 오름차순 대동맥에 작은 절 개 (< 2 m m)를 확인 합니다.
    2. Perfuse 5 mL PBS의 4 %Paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 다음 10 mL와 함께 다음 5 mL PBS의. PBS와 4 %PFA 솔루션을 사용 하 여 주위 온도에.
    3. (예: 간, 폐, 비장)의 조직 수집 하 고 4 %PFA 솔루션에 그들을 배치.
  6. BCA 노출
    1. 피부 침 샘을 제거 하 여 목 부분을 청소.
    2. 가 위를 사용 하 여 위를 통해 흉 골의 중간 선 아래 한 컷을 수행 합니다. 가 위 흉 골 아래 밀접 하 게 위치한 맥 관 구조를 손상을 방지 하려면 흉 골의 뒤쪽 가까이 있어 주의 해야 합니다. 완전히 흉을 열고 집게와 흉 곽의 양쪽을 당겨. 년은 부분적으로 표시 되어야 합니다.
    3. 당기는 근육과 결합 조직 및 오른쪽 경 동맥, brachiocephalic 동맥 subclavian 분기 대동맥 아치를 청소 하 고 주위 결합 조직 및 지방 (그림의 절연까지 정밀한 핀셋으로 지방을 제거 하 여 정리 2C).
  7. BCA를 제거
    1. 집게를 사용 하 여 그것의 분기 아래 오른쪽 경 동맥을 겸 자 (그림 2D) 위에 초기 컷을 확인.
    2. 아직도 들고 경, 확인 하 동맥을 통해 두 번째 컷. 마지막 두 컷 통해 대동맥 아치, brachiocephalic 동맥 (그림 2D)의 양쪽에 있습니다.
    3. 다른 혈관 조직 (예: 복 부 대동맥, 대동맥 루트를 포함 하는 심장의 우수한 부분)의 수집 합니다.
    4. 하룻밤 실 온에서 4 %PFA 솔루션에서 다른 조직과 BCA를 놓습니다.
      참고: 고정 시간 유지 되어야 한다 연구에 걸쳐 일관성.

4. 조직 처리 및 단면

  1. 4 %PFA 레이블이 조직 카세트(그림 3)에서 조직을 제거 합니다. 조직을 위해 카세트에서 사용 거품 패드의 방향 및 처리 단계 (그림 3B) 카세트에서 유지 합니다. 카세트를 닫고 (72 h에 24)를 처리 하는 조직까지 70% 에탄올에 몰두 합니다.
    1. 다른 조직과 프로세스 BCA 조직학 및 immunofluorescent (진공 침투와 프로세서를 사용 하 여 일상적인 하룻밤 프로시저의 예제) 다음과 같이 얼룩에 대 한 수집: 10% 중립 버퍼링 주변 온도 (2 x)에서 30 분 동안 말린 75% 30 ° C (1x), 90% 에탄올 30 ° C (1x), 95% 에탄올 30 ° C (1x), 100% 에탄올 30 ° C (3 배), 60 분에 30 ° C (3 배), 크 실 렌 그리고 파라핀 왁 스 62 ° C (3 배)에서 80 분에서 60 분에서 60 분에서 60 분에서 60 분의 에탄올
  2. BCA, 블록 면 (그림 3C)에 가까운 대동맥 아치 포함 됩니다.
  3. 로타리 톰 (10 µ m 두께)에 포함 된 조직에 도달할 때까지 파라핀 블록을 통해 잘라.
  4. 조직 표시 되 면 위치를 결정 하는 현미경 아래 섹션을 검사 합니다. 대동맥 아치 여전히 표시 하는 경우 각 간격에 섹션을 검사 한 번에 10 10 µ m 섹션까지 제거 합니다.
  5. 대동맥 아치를 통해 구분 되는, brachiocephalic 동맥 표시 됩니다 때 완전히 톰 블레이드 수직 조직 위치를 블록의 방향을 조정 합니다.
  6. 섹션 두께 10 µ m의 BCA를 잘라. 그 시점에서, 모든 섹션 슬라이드 당 3 개의 섹션으로 순차적으로 수집 됩니다. Subclavian 분기 (그림 3D)에 도달할 때까지 수집 합니다.
    참고: 다음 z-스택 confocal 이미지 수집 및 단일 셀 계산 10 µ m의 섹션 두께에 BCA을 중요 하다. 이 두께 단일 핵과 세포질 협회 또는 막 얼룩 비록 횡단면의 깊이의 엄격 하 고 비 cofounding 평가 허용할 것 이다.

5. immunofluorescent 얼룩

참고: 동맥 경 화성 병 변의 완전 한 특성 형태학 매개 변수 평가 및 플 라크 안정성 또는 불안정성 및 현재 프로토콜의 초점 되지 것입니다 세포 구성의 인덱스를 포함 합니다. 병 변의 형태, 콜라겐, 내용과 intraplaque 출혈 분석할 수 있습니다 Movat7,17, PicroSirius 레드 7,31, Ter119 착 7,18, 각각. 여기, 우리 병 변 세포 구성을 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

  1. 실 온 화학 후드 아래에서 다음 솔루션에 슬라이드를 품 어: 5 분 (2 배), 5 분 (2 x)에 대 한 100% 에탄올, 5 분 (2 x)에 대 한 95% 에탄올, 5 분 (2 배), 그리고 이온된 H2O에 대 한 70% 에탄올에 대 한 크 실 렌 (diH2O) 5 분 (2 배).
  2. Antigen 검색 솔루션 제조 업체의 지침에 따라 슬라이드를 품 어.
    1. 구 연산 산 항 unmasking 솔루션을 기반으로 ( 재료의 표참조), 희석 3 mL 320 mL diH2오 장소에에서 솔루션의 준비 항 원 검색 솔루션 위로 얼룩 저수지와 채우기 슬라이드.
    2. 도 열 되도록 빈 슬라이드 슬라이드 선반에 있는 빈 슬롯을 채우십시오. 증발 없이 종 항 원 검색 솔루션 수 있도록 뚜껑 컨테이너 커버.
    3. 약 675-700 와트에 20 분 동안 전자 레인지에 슬라이드를 열. 검사 정기적으로 슬라이드와 diH2O 섹션 같은 남아 바꾸기 증발 액체 침수 unmasking 솔루션에 항상.
    4. 실 온에서 1 h에 대 한 솔루션을 슬라이드 수 있습니다.
  3. PBS의 1 L에 물고기 피부 젤라틴 (FSG)의 6 g을 녹. PBS/FSG 버퍼 세척으로 사용 됩니다. PBS/FSG의 정상적인 혈 청을 10%의 차단 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 물고기 피부 젤라틴 블로킹 버퍼의 준비에 사용 됩니다. FSG 포함 하지 않는다 포유류 항 체와 cross-react 수 있는 혈 청 단백질 배경 잡음을 최소화. 그러나, 다른 차단 옵션 FSG 생 biotin을 포함 biotin 탐지 시스템 선호 해야 한다. 정상 혈 청 사용의 유형은 사용 하는 이차 항 체를 기반으로 합니다. 당나귀 2 차 항 체를 사용 하면 정상적인 말 혈 청 및 항 체 희석에 대 한 선택 되어야 합니다.
  4. 실 온에서 5 분에 대 한 PBS에 슬라이드를 품 어. 소수 성 펜으로 동그라미 조직 섹션입니다. 블로킹 버퍼 PBS/FSG/정상 혈 청 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 커버. 조직에서 차단 하는 동안이 단계 동안 PBS/FSG/정상 혈 청에서 항 체를 기본 솔루션을 준비 합니다.
  5. 1 차 항 체에 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤 PBS/FSG/정상 혈 청 희석으로 품 어. 슬라이드 당 한 섹션 1 차적인 항 체 특이성에 대 한 제어를 기본 항 체로 같은 농도에서 IgG 제어 항 체의 믹스와 함께 알을 품을 한다.
  6. 실 온에서 다음과 같이 슬라이드를 세척: PBS/FSG 5 분 (배), 5 분 (1x) 다음 PBS.
  7. 핵에 실 온에서 1 h에 대 한 PBS/FSG/정상 혈 청 희석 counterstaining에 fluorophore 활용 된 이차 항 체 ( 재료의 표참조)와 diamidino-2-phenylindole (DAPI) 품 어. 빛에서 슬라이드를 보호 합니다.
  8. 5.6 단계에서 설명한 대로 슬라이드를 씻어.
  9. 형광에 대 한 적합 한 설치 미디어를 사용 하 여 슬라이드 마운트 ( 재료의 표참조).

6. confocal 현미경 검사 법

참고: confocal 현미경 및 z-스택 수집의 사용은 단일 셀 계산 하는 것이 중요 합니다.

  1. 연구 전반에 걸쳐 사용 하는 수집 매개 변수 설정: 이미지 해상도 (1024 x 1024 또는 2048 x 2048 픽셀); 광학 경로 선택; 2 차 항 체의 결합의 함수는 채널의 수 스캐닝 속도 (스캐닝 속도 권장: 7-8); 그리고 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 채널입니다.
  2. 섹션 주 항 체와 IgG 제어 스테인드를 사용 하 여, 검출기 감도, 레이저 파워 및 각 개별 채널에 대 한 오프셋을 설정 합니다. IgG 컨트롤 배경 신호를 최소화 하는 데 사용 됩니다.
  3. Z-스택 수집에 대 한 위쪽과 아래쪽 위치를 설정 합니다. 두께 스택 취득의 수를 미리 지정할. 이러한 매개 변수는 연구에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다.
    참고: 1 µ m 두께의 8 ~ 10 스택을 이미징이 좋습니다. 스택 연구를 통해 몇 군데의 수에서 숙박.
  4. 이미지 조직 섹션 1 차 항 체와 DIC를 포함 한 모든 채널에 대 한 IgG 제어 스테인드.
  5. 레이블을 눈금 막대 단일 셀 계산 하는 동안 이미지 보정을 위한 적어도 하나의 이미지.

7. 단일 셀 계산

  1. 설치 하 고 ImageJ를 엽니다. 필요한 경우 섹션에서 플러그인 을 다운로드 다운로드 > 입/출력 는 ImageJ의 이미지 파일을 웹사이트 생성 confocal 현미경에 의해 생성 된 이미지의 형식에 따라.
  2. ImageJ에서 이미지 파일을 엽니다.
  3. 참고 눈금 6.6에서 생성 된 이미지를 사용 하 여 막대와 이미지 보정.
  4. 관심 있는 단일 셀 계산 수행 됩니다 DIC 채널 (그림 4)를 사용 하 여 영역을 나타냅니다.
    참고: 한 지역은 한 번에 구분 된 될 수 있습니다. 실험적인 질문에 따라, 단일 셀 계산 수행할 수 있습니다 전체 병 변의 영역에서 ( 7.3.1참조) 병 변의 sublocation에. 예를 들어 그것의 세포질 구성 이기 때문에 병 변 성향 파열의 중요 한 인덱스 섬유 모자 영역의 조사 특히 관계가 ( 7.3.2참조).
    1. DIC 이미지에 루멘 테두리 (그림 4A, 흰색 화살표)와 내부 탄력 있는 lamina (그림 4A, 노란색 화살표) 표시를 따라 병 변 위치를 나타냅니다.
    2. 섬유 모자 영역의 분석을 위해 루멘에서 30 µ m의 먼 국경 확인 하 고 테두리 ( 그림 4B-D)를 추적 합니다.
      참고: 섬유 모자 지역 고전적인 ACTA2 + 셀과 콜라겐 underlaying 루멘 (그림 4B)에 농축 하는 지역으로 정의 됩니다. ACTA2 + 셀과 콜라겐에 농축 병 변 안정성에 중요 한 역할을 한다. 이전 연구는 ACTA2 + 셀 풍부한 섬유질 모자 영역 평균 SMC 혈통에 루멘에서 30 µ m 두께 결정 ApoE-/- 추적 마우스 18 26 주 (그림 4C) 높은 지방 다이어트를 먹이. 따라서, 유전자 조작 이나 섬유질 모자 지역 세포 구성에 약리 치료의 효과의 세심 한 특성은 매우 적합 합니다.
  5. 채널 도구 패널을 엽니다 (이미지 > 색상 > 채널 도구)와 다른 의사 색 얼룩 채널 (그림 5A; 상자 1).
  6. 색상 채널을 병합 (이미지 > 색상 > 색상 병합) (그림 5A; 상자 2). 모든 채널에서 동일한 이미지 (그림 5B)에 표시 되어야 합니다. 켜고 채널 도구 패널 (그림 5A; 상자 1)를 사용 하 여 개별 색상 채널을 설정 합니다.
  7. 계산 도구를 설정 합니다.
    1. 도구 모음에서 계산 아이콘에 오른쪽 클릭 (그림 5C, 상자 1) 고 다 지점 도구를 선택 합니다.
    2. (그림 5C; 상자 2) 도구 패널을 열고 동일한 아이콘에 더블 클릭.
    3. 종류와 셀을 계산 하는 데 사용 하는 항목의 크기를 선택 합니다.
    4. 모두 표시를 선택 합니다.
  8. 켜고 채널 도구 패널에만 DAPI 채널 카운터 채널 0 (그림 5C; 상자 3)을 선택 합니다. 태그는 개별 핵에 클릭 합니다 (예를 들어, 노란색 그림 5C D에 점). Z-스택 모든 핵 관심 영역에 스테인드를 스크롤하십시오. 이벤트의 수는 도구 패널 (그림 5C; 상자 4)에서 카운터 채널 아래 표시 됩니다.
  9. 다른 얼룩 채널 설정 (예: eYFP 얼룩이 지기). 카운터 채널 1을 선택 합니다. 셀은 DAPI과 얼룩이 지기 사이 colocalization를 클릭 합니다. 세포질 얼룩에 대 한 얼룩과 선택 셀 주변 핵의 전체 깊이에 핵 (여러 z-스택 확인).
  10. 조합 얼룩 및 관심의 세포 인구를 새로운 카운터 채널 선택 수정 하 여 반복 합니다. 모든 도트 색상 다른 세포 인구를 (그림 5D)를 나타냅니다. 결과는 DAPI의 총 수 또는 지역 영역에는 셀의 수를 셀 수로 표현할 수 있습니다.

결과

Myh11-Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe-/- 생쥐는 높은 지방 다이어트를 먹이 되 고 전에 나이의 6의 그리고 8 주 사이 tamoxifen을 주입 했다. 높은 지방 다이어트를 먹이의 18 주에 8 쥐의 2 개 그룹 마우스 단일 클로 널 안티-일리노이-1β 항 체 또는 isotype 일치 IgG 컨트롤 8 주 (그림 1)710 mg/kg에서 매주 치료 했다. 마우스 희생 되었고 4% PFA PB...

토론

수십 년간의 연구 및 동맥 경화를 공부 하 고 기술 발전에 불구 하 고 필드 임상 치료34,35과학적인 발견을 번역의 실망 스러운 역사를가지고 있습니다. 이 현상 동물 모델, 실험적인 디자인, 그리고 병 변 분석에 불일치에 의해 부분적으로 설명 될 수 있습니다. 여기는 우리 혈통 추적 마우스7를 사용 하 여 고급 동맥 경 화성 병 변에서 ?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는 그들의 도움에 대 한 피츠버그 대학에서 생물 학적 이미징 (NIH 1S10OD019973-01에 의해 지원)에 대 한 중심을 감사 합니다. 이 작품은 지원 여 D.G. R.A.B.에는 미국 심장 협회에서 15SDG25860021에 의해 지원 되었다 과학 개발 교부 금에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 F30 HL136188.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy SciencesRT 15710Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needleFisherBD367342
25G needleFisher14-821-13D 
A1 Confocal microscopeNikonConfocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse)Sigma AldrichF3777Primary Antibody
Alexa-647 anti goatInvitrogenA-21447Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid basedVector LabsH-3300Antigen retrieval solution
Chow DietHarlan TekladTD.7012
CoverslipFisher12-544-14Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbitInvitrogenA-21206Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-ratAbcamab150154Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and MagnesiumGibco14200166PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassetteFisher15-182-701D
ETDA vacuum tubeFisher02-685-2B
Ethanol 200 proofDecon2701
Foam padFisher22-222-012
Gelatin from cold water fish skinSigma AldrichG7765
GFP antibody (goat)abcamab6673Primary antibody
goat IgG controlVector LabsI-5000IgG control
High Fat DietHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHComputer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat)CedarlaneCL8942APPrimary antibody
LSM700 confocal microscopeZeissConfocal microscope
Microscope Slides, Superfrost PlusFisher12-550-15
Microtome bladesFisher30-538-35
Mouse IgG controlVector LabsI-2000IgG control
NIS element imaging softwareNikonImaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serumSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
Peanut oilSigmaP2144
Prolong gold Antifade mountantInvitrogenP36930Mounting medium 
Rabbit IgG controlVector LabsI-1000IgG control
Rat IgG controlVector LabsI-4000IgG control
RUNX2 antibody (rabbit)Abcamab192256Primary Antibody
SyringeBD3096281 ml syringe
TamoxifenSigmaT5648
XyleneFisherX55K-4
Zen imaging softwareZeissImaging software for z-stack image acquisition

참고문헌

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