巨噬细胞 ros 产生的流式细胞仪测量对 fcγr 交联的响应

摘要

这项研究表明, 使用流式细胞仪检测活性氧 (ros) 的产生, 由于激活的 fcγr。该方法可用于评估吞噬细胞对免疫复合物、光化微生物或直接 fcγr 交联的抗菌和氧化还原信号功能的变化。

摘要

氧化或呼吸爆裂是用来描述快速消耗氧气和产生活性氧物种 (ros) 的吞噬细胞响应各种免疫刺激。免疫激活过程中产生的 ros 主要通过 ros 破坏 dna 和蛋白质的能力来发挥有效的抗菌活性, 从而导致微生物死亡。能够可重复地、轻松地测量 ros 的生产是必要的, 以评估各种途径和分子对这种宿主防御机制的贡献。本文演示了荧光探针和流式细胞仪在检测 ros 生产中的应用。虽然广泛使用, 荧光测量 ros 是出了名的问题, 特别是在测量 ros 引起的特定和非有丝分裂的刺激。我们提出了一个详细的方法来检测 rs 产生的特定 fcγr 刺激的结果, 从巨噬细胞的产生, 启动, 染色, fcγr 交联, 并结束与流式细胞仪分析结束。

引言

活性氧 (ros) 是活性分子或自由基, 是有氧呼吸的副产品 (^{综述在 1})。其中包括超氧化物阴离子、过氧化物、过氧化氢、羟基自由基和羟基离子等。在正常的生理条件下, ros 主要由线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nadph) 氧化酶产生, 并由超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等多种酶和蛋白质快速解毒。ros 的夸大产生或去除 ros 能力的缺陷会导致氧化应激, 其中活性氧物种会促进蛋白质、脂质和 dna 的损害, 导致细胞应激或死亡和病理疾病状态。然而, 目前人们认识到 ros 也可以作为信号分子 (氧化还原信号), 而 ros 介导的各种分子和途径中间体的修饰可以影响细胞代谢、增殖、生存、炎症信号, 和老化²。在吞噬细胞中, ros 在提供所谓的 "呼吸爆裂"^{1、3、4、5、6}期间发挥着至关重要的作用。在吞噬细胞对外部刺激的反应中, nadph 氧化酶复合物 (^{p40 phox}、p40^phox、p40^phox) 的成分从细胞溶胶转移到含有 gp91 phox 和 p22phox 的吞噬膜上亚基, 并与 rac半的行动, 形成一个全功能的 nadph 氧化酶复合物。然后, 组装的 nadph 氧化酶利用 nadph 将氧气还原为脂肪体液泡内的超氧化物。超氧化物阴离子可直接造成损害或分解成过氧化氢。超氧化物和过氧化氢都可以与其他分子发生反应, 产生高活性的羟基自由基。损伤是由这些 ros 与蛋白质上的铁硫簇反应或导致 dna 的碱基氧化来介导的, 最终导致微生物代谢受限或微生物⁵死亡。在慢性肉芽肿病 (cgd)^7, 8, 9,¹⁰. 患有 cgd 的个体在 gp91phox 中具有突变, 导致缺乏 ros 的产生, 并容易受到细菌和真菌的反复感染, 而细菌和真菌通常与免疫能力的个人无关。因此, 无论是研究氧化应激、氧化还原信号, 还是宿主防御, 能够实时测量 ros 的产生都是一个有益的尝试。

多项检测已被用来测量 ros 的产生或氧化应激^{的结果 11,12,13}。其中, 其中最广泛使用的是荧光探针 2 ', 7 ' 二氯氢荧光素二乙酸 (dcfh 2-da)¹⁴.这种分子是无色和亲脂性的。dcfh-da 在细胞膜上的扩散使其能够通过细胞内酯酶作用, 从而将其转化为 dcfh₂ , 使其具有不渗透性。多种类型的 ros (过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮和过氧自由基) 在 dcfh₂上的作用将其氧化为荧光的 dcf (报告为 exsem:485-500 nm\ 15-530 nm), 并可通过流量检测细胞仪配备了荧光素 (fl1 通道) 的标准过滤器集。超氧化物与 dcfh_{2 不}强烈反应, 但可与另一种探针二氢乙二酸 (dfe) 反应, 产生荧光产物 2-羟基乙酸 (以及其他与荧光超氧化物无关的氧化产物)^15.使用518纳米的激发波长和 605 nm (fl2 通道) 的发射波长可以检测到 dfe 氧化的荧光产物。虽然使用起来相对简单, 但要利用这些探针检测 ros, 需要了解它们的局限性, 并仔细地将染色程序和控制纳入正在进行的具体检测中, 以便有有效的实验结果和结论。下面的协议演示了使用商用套件的方法, 该套件采用了这两个探头, 用于流式细胞仪测量 ros。用这些探针染色引种骨骨髓衍生的巨噬细胞, 通过 fcγr 交联诱导 ros 的产生。我们提供了使用该协议获得的具有代表性的数据, 并强调了成功试验必须采取的适当预防措施。

研究方案

动物处理协议得到了中佛罗里达大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 骨髓巨噬细胞的产生

1. 文化媒体的准备
   1. 准备 d10f 基础媒体: 到 dulbecco 的修改鹰媒体 (dmem), 加入10% 热灭活的胎儿牛血清 (fbs)、1 mm 丙酮酸钠、10 mm 4-(2-羟基乙基)-1-吡嗪-乙酸 (hepes) 和 0.05 mm β-硫醇。
      注: 虽然最好使用新鲜的 d10f 介质, 但 d10f 基介质最多可以提前两周准备好, 以便在一周内用于多个实验。对于一只老鼠, 需要175毫升左右的 d10f 基介质 (25 毫升冲洗骨骼, 150 毫升用于巨噬细胞分化介质)
   2. 准备 ladmac 生长介质: 到鹰的最小必需介质 (emem), 添加10% 的热灭活 fbs 和 2 mm l-谷氨酰胺。在你计划开始你的文化的那一天, 为媒体做新鲜的准备。
      注: 一公升 ladmac 生长介质将产生大约 (19) 毫升的 ladmac 调节介质。
   3. 准备完整的 dmem 介质: 到 dmem 中, 加入10% 的热灭活 fbs 和1x 抗生素-抗真菌。准备新的媒体, 在生日 bmdm 将被收获的那一天。
      注: 对于一个鼠标, 将需要大约100毫升的 dmem 完整的介质。这包括用于启动细胞的介质。
2. ladmac 调理介质的制备
   1. 使用10毫升的 ladmac 生长介质 (定义于 1.1.2) 将 adammac 细胞生长到10厘米的盘子中。在 37°c, 5% co 2 下培养细胞_.
   2. 在融合时, 通过在细胞上强制分配培养基来分离细胞。通过在 t-175 瓶中加入1毫升分离细胞, 含有100毫升的 ladmac 生长介质, 通过通道细胞。在37°c、5% co_{2 (}约一周) 时将细胞孵化至完全融合。这样, 一个10厘米的菜可以产生 10 t-175 烧瓶或大约1升的条件介质。
   3. 一旦细胞准备好, 收集有条件的介质和离心机在 350 x g 5分钟, 以颗粒不需要的细胞。通过 0.2 mm 滤镜过滤收集到的上清液, 并在-80°c 下存储50毫升的。在 ladmac 条件下的介质的液体可以保持在-80°c 下几个月, 活动损失最小。
      注: 如果预计会进行大的实验, 请同时制备大批的 ladmac 条件介质, 以确保一致性。如果这是不可能的, 使用从相同批次或大量的 admac 条件下的介质中获得的 aliquots 为每个实验。
3. 骨髓巨噬细胞的制备
   1. 在实验当天, 准备新鲜的巨噬细胞分化培养基, 将25% 的 ladmac 条件介质添加到以前准备的 d10f 介质中 (1份死于 admmac 的条件介质, 分为 3个 d10f 部分)。不要提前准备好这个媒体!仅准备所需的 bmdm 区域性的媒体。
   2. 第1天: 根据前面描述的方案¹⁶隔离小鼠骨髓细胞, 并通过修改, 使用 d10f 基部介质从股骨中冲洗骨髓并进行滴定。使用2.5 毫升的 d10f 介质冲洗 (4) 骨骼的每一端。将骨髓细胞直接冲洗到放置在50毫升管顶部的湿前40毫米细胞过滤器中。剩余的介质 (~ 5 毫升) 可用于冲洗细胞过滤器。
   3. 离心以 350 x g的速度收集骨髓细胞 5分钟, 在巨噬细胞分化介质 (每只小鼠) 中丢弃上清液并重新悬浮细胞。
   4. 准备和标签 (6) 无菌10厘米的培养皿。板5毫升的巨噬细胞分化培养基成每个培养皿。在巨噬细胞分化培养基中再悬浮骨髓细胞的5毫升, 进入每个培养皿, 总体积为每盘10毫升。在37°c、5% co_{2 下}孵化5天。
   5. 第5天: 从细胞中吸收培养基。用1-2 毫升的 pbs 清洗一次, 加入10毫升新鲜制备的巨噬细胞分化培养基。额外孵化3天。
   6. 第8天:按照下面的说明继续收获 bmdm。

2. bmdm 的收集、播种和启动

1. 在巨噬细胞分化培养基中生长 bmdm 7天后, 去除上清液。用1-2 毫升的 pbs 清洗一次粘附巨噬细胞。吸收 pbs。
2. 将1毫升0.25% 的 trypsin-edta 分配到每个巨噬细胞板中, 并将其留在37°c 孵化器 5-10, 并频繁攻丝分离细胞。使用 p1000 移液器上下移液分离胰蛋白酶巨噬细胞, 并在含有 10-15 ml 完整 dmem 介质的50毫升管中收集巨噬细胞。用额外的2毫升完整的 dmem 介质清洗盘子, 以收获任何剩余的巨噬细胞。
   注意: 不要将巨噬细胞留在胰蛋白酶中超过10分钟。
3. 以 350 x g 离心50毫升管 5分钟, 丢弃上清液。轻轻分离颗粒, 并在10毫升的完整 dmem 介质中重新悬浮细胞。在有活力染料 (如色氨酸蓝) 的情况下使用血细胞计计数巨噬细胞, 如下所示:
   1. 例如, 将色氨酸蓝的90μl 与10μl 的细胞混合, 进行1:10 稀释。
   2. 在这种混合物中, 将10μl 加载到血细胞计中, 并对中心正方形 (5 x 5 网格) 进行计数。总细胞计数 = 计数 x 10 4 x 稀释系数 (10) x 体积 (10 毫升)。
4. 将细胞悬浮液调整为1百万/ml, 在完整的 dmem 介质和板4毫升的这种细胞悬浮液到每个6厘米的菜。
   注: 每个实验至少需要3个板。一个细胞板将不受刺激, 第二套细胞将通过 fcγr 的交联受到刺激, 第三盘细胞将用于所有额外的实验和流式细胞仪控制。
5. 在 37°c 5% co 2 下将板材连夜培育.
6. 第二天, 吸上清液, 用1-2 毫升的 pbs 清洗细胞一次。在每个板材中加入含有 100 ngml 小鼠 ifn-γ的完整介质的4毫升。在 37°c 5% co 2 下将板材连夜培育.
7. 如果需要, 取一个细胞的比例, 以评估适当的生成的 bmdm 流式细胞仪。每次试验使用 1x10 6 个电池, 并为以下条件制备聚苯乙烯 fac 管: 等一式控制, 用 fnμ80染色 (或者用 cd11b 染色).
8. 加入 0.1% fbs, 加入 1x pbs, 制备流式细胞仪染色缓冲液。仅使用此数量的 fbs, 以便在以后的步骤中不会抵消血清饥饿的影响。
9. alicot 1 x 10⁶每个管的细胞和离心机在 750 x g 5分钟。
10. 在流式细胞术缓冲液的2毫升中, 通过脱脂或吸气上清液和再悬浮细胞清洗一次。离心 5分钟, 750 x 克 。
11. 在100μl 流式细胞仪染色缓冲液中吸收上清液和再悬浮细胞。在每个管中加入1μl 的抗小鼠 cc16/32fc 阻滞抗体。在冰上孵化5分钟。
12. 在不清洗的情况下, 将 fitc 抗小鼠 F4/80 或 1μl apc 抗小鼠 cd11b 抗体添加到 "染色" 管中, 并将相应数量的同型控制抗体添加到 "同型" 管中。在冰上, 在黑暗中, 孵化30分钟。
13. 通过将2毫升的 pbs 直接添加到细胞中来清洗细胞。离心 5分钟, 750 x 克 。
14. 在150μl 的 pbs 中吸收上清液和再悬浮细胞。
15. 使用100μl 或 10, 000个事件在感兴趣的门上的停止条件采集流式细胞仪上的样本, 并确保选择 fsc、ssc、fl1 (fitc 反鼠标 fm\ 80) 或 fl4 (apc 抗鼠标 cd11b) 通道进行分析。
16. 使用流式细胞仪软件, 打开 fsc (在 x 轴上) 与 ssc (在 y 轴上) 的点图, 并在感兴趣的细胞周围绘制一个门, 不包括死细胞和碎片 (死细胞和碎片比主细胞群要小很多, 出现在 lowe 上r 左图)。
17. 在感兴趣的细胞上打孔, 用 fl1 (fitc 抗鼠标 F4/80) 或 fl4 (apc 抗鼠标 cd11b) 在 x 轴上打开直方图图。
18. 运行 "同型" 样本。生成标记门, 使大多数 "同型" 样本事件位于栅极左侧 (& lt;1% 为正)。将此模板应用于染色示例文件。
19. 运行 "染色" 样本。成功生成的 bmdm 将导致 fitc 抗鼠标 F4/80 或 apc 抗鼠标 cd11b (图 1a) 的表达 gt;95%, 而不正确的培养条件可能导致巨噬细胞的生成不理想 (图 1 b)。
    注: 如果从多个基因型生成 bmdm, 请注意这些标记在每一批生成的 bmdm 中的表达式, 如果这可能是在评估 ros 产生以应对刺激时将样本排除在分析之外的理由。

3. 用于 ros 测量的试剂和材料制备

1. 在无水 dmf 60μl 中重新制备冻干氧化应激检测试剂, 得到 5 mm 的库存溶液。使用前轻轻混合。
   注: ros-id 试剂盒手册中规定, 重组试剂的保质期约为-20°c 时的保质期。在重组后立即将试剂油酸加入小型防光小瓶, 最大限度地减少其氧化, 并最大限度地延长-20°c 的保质期。
2. 在无水 dmf 的60μl 中重新制备冻干超氧化物检测试剂, 得到 5 mm 的库存溶液。使用前轻轻混合。
   注意: 如试剂盒手册中所述, 请将这两种检测试剂视为可能的诱变剂, 小心处理每种试剂, 并妥善处理。
3. 在20μl 无水 dmf 中重新制备 ros 诱导剂 (py青 anin), 以产生 50 mm 的库存溶液。
4. 将 ros 抑制剂 (n-乙酰-l-半胱氨酸) 重新构建为123μl 的去离子水, 以产生 0.5 m 的库存浓度。
5. 标记5毫升圆形聚苯乙烯管 (流式细胞仪管) 与实验控制和条件。(请参见4。检测条件和控制)
6. 在无酚 dmem 中加入0.1% 的 fbs, 制备低血清 dmem (无苯酚红)。
7. 将抗 bsa 抗体注入小等价物 (取决于使用情况), 并将其存储在-80°c。
8. 在 hbss (hanks 的平衡盐溶液) 或 pbs 中制备 100 mgmml bsa 的库存溶液。将其注入100μl 的等价物, 并在-20°c 下存储。
9. 制备 ros 探针的2倍溶液 (2倍探针溶液): 对于低血清 dmem 的每10毫升, 添加4μl 的氧化应激检测试剂 (绿色染料) 和4μl 的超氧化物检测试剂 (橙色染料)。
10. 准备2x 探针溶液, 仅包含氧化应激检测试剂 (2x 探针溶液, 仅限绿色), 或仅包含超氧化物检测试剂 (2x 探针溶液, 仅限橙色)。只准备实验所需的试剂量, 并在使用前立即准备2x 溶液。
    注: 要准备较小体积的2倍检测溶液, 在 dmem 中最后稀释之前, 请使用中间的 1:10 稀释绿色和橙色检测试剂。例如, 要制备2倍检测溶液的1毫升, 请将每个探头的1:10 稀释为9μl 的 dmem (1:10 中间稀释)。将这1:10 中间稀释的4μl 稀释成1毫升的 dmem。

4. 检测条件和控制

1. 包括以下每个实验的流式细胞仪补偿实验控制:
   a) 未染色和未受刺激的细胞。
   b) 仅使用氧化应激检测试剂 (绿色试剂) 染色并使用 ros 诱导剂处理的细胞。
   c) 仅使用超氧化物检测试剂 (橙色试剂) 染色并使用 ros 诱导剂处理的细胞。
2. 对于每个小鼠或生物复制, 包括以下6个条件:
   a) 未染色和未受刺激的细胞
   b) 染色和未受刺激的细胞
   c) 用阳性诱导剂处理的染色细胞
   d) 用阳性诱导剂和 ros 抑制剂处理染色细胞
   e) 通过 fcγr 交联激活的染色细胞
   f) 通过 fcγr 交联活化的染色细胞, 用 ros 抑制剂处理
3. 根据小鼠数量和条件计算所需的2倍探针溶液的数量 (对于需要染色的每个条件, 将使用2x 探针溶液的 200μl)。
   注: 对于使用6只小鼠的检测, 每只小鼠需要5个需要用探针染色的条件。这使条件总数达到30个。因此, 所需的2倍探头溶液总量至少为6毫升 (30 * 200μl)。

5. 细胞制备

1. 在给巨噬细胞启动一夜后, 吸气上清液。用 pbs 清洗细胞一次。
2. 血清通过用同样体积的低血清 dmem 取代培养基使细胞挨饿。对于每只老鼠, 一个盘子将用抗 bsa igg1治疗, 而血清饥饿, 而另一个盘子将不治疗。只在未经处理的板材中添加低血清 dmem。在处理过的钢板中加入含有2.5μgml 抗 bsa igg1 的低血清 dmem。
   注: 对于流式细胞仪补偿控制, 每个实验都需要一个额外未经处理的板材。
3. 在37°c、5% co₂下将板材培育4小时。
4. 血清饥饿后, 通过温和刮擦或在 pbs 中使用 0.2 mm edta 来收获细胞。将它们收集在标记为5毫升的圆底管中, 并以 750 x g的速度离心 5分钟. 跟踪哪些细胞被用小鼠抗 bsa igg₁处理。
5. 用2毫升的 pbs 清洗细胞颗粒一次, 以去除所处理细胞中残留的抗 bsa。
6. 在低血清 dmem 600μl 中再利用细胞颗粒。
7. 从600μl 电池悬浮液中, aliquot 200μl 进入预先标记的 5 ml 圆形底管, 如下所示:
   1. 从未经处理的细胞中, 对贴有 "无刺激" 标签的管采取 200μl, 为标记为 "阳性诱导剂" 的管取 200μl, 对标记为 "阳性诱导剂 + 抑制剂" 的管采取200μl
   2. 从抗 bsa_igg1处理的电池中, 对于标记为 "fcγr 交联/fcγr xl" 的管, 取 200μl, 对于标记为 "fcγr xl + 抑制剂" 的管, 采用200μl
   3. 从用于补偿控制的未经处理的电池中, 为标记为 "未染色未受刺激" 的管取 200μl, 为 "绿色 + 感应器" 控制取 200μl, 为 "橙色 + 感应器" 控制取200μl。
      注: 如果来自5.7.1 和5.7.3 的细胞来自同一只老鼠, 则相同的 "未染色未受刺激" 细胞可用于实验和补偿控制。如果没有, 将需要额外的200μl 细胞为 a) 的 "未染色未受刺激" 实验控制。
8. 将管子放在冰上, 直到染色和刺激。在血清饥饿和 igg1 结合期间_,准备探针、特定刺激和诱导剂, 如下所述。
   注: 如果第一次执行检测, 如果没有模板, 或没有事后补偿的流动细胞仪和相应的软件, 刺激和染色补偿控制, 并运行这些在流细胞仪执行在实验样品中添加刺激之前进行人工补偿。

6. 进行检测

1. 通过稀释2x 探针溶液中的 py青素 1:100 (步骤3.9 中准备), 制备2x 阳性诱导剂溶液, 以获得2倍浓度为500μm 的 py舞in (最终浓度为 250μm)。另外, 稀释吡咯素1:100 到每一个 "2x 探针溶液, 绿色" 和 "2x 探针溶液, 橙色只" 管准备在3.10。
   注: 两个条件标记为 "阳性诱导剂" 和 "阳性诱导剂 + 抑制剂" 将使用阳性诱导剂进行处理。在计算要准备的2个正诱导器溶液的数量时, 请进行相应的规划。例如: 如果对3只小鼠进行检测, 6个条件 (3 * 2) 将使用阳性诱导剂进行处理, 因此请准备出2x 阳性诱导剂溶液的 6 * 200μl = 1.2 ml ml。
2. 通过在2x 探针溶液中稀释 bsa 库存溶液来制备 2x bsa 溶液, 以获得2μgml 的浓度 (最终浓度为 1μg/ml)。
   注: 这两个条件标记为 "fcγr xl" 和 "fcγr xl + 抑制剂" 将使用 2x bsa 溶液进行处理。在计算要准备的溶液量时进行相应的规划。例如: 如果使用3只小鼠进行检测, 将使用 bsa 溶液处理 6 (3 * 2) 条件, 因此需要 6 * 200μl 或 1.2 ml 的 2x bsa 溶液。
3. 在开始特定刺激 (fcγr 交联) 之前, 请确保所有试剂和细胞都准备好了。按刺激的顺序将管子放在冰上。
4. 对于带有自动采样器的流式细胞仪, 请注意细胞仪分析一个样本并进入下一个样本所需的时间, 包括任何混合和探头清洗步骤 (例如3.5 分钟)。
   注:时间是非常关键的此检测.为了很好地控制每一个条件, 需要对每个条件进行准确的时间 (30分钟) 的刺激。按顺序刺激细胞, 并将流式细胞仪采集样品之间的滞后时间。例如, 如果细胞仪分析一个样本并进入下一个样本所需的时间为3.5 分钟, 则按每3.5 分钟分析一次的顺序刺激细胞。
5. 如果此时进行手动补偿, 则刺激用于补偿的控制管 (步骤 5.7.3)。在标有 "绿色 + 感应器" 的管中加入200μl 的 "2x 探头溶液, 仅限绿色", 其中包含感应器 (从6.1 开始)。在标有 "橙色 + 感应器" 的管中加入200μl 的 "2x 探头溶液, 仅限橙色", 其中包含感应器 (步骤 6.1), 标记为 "橙色 + 感应器" (步骤 5.7.3)。
6. 在37°c 下将细胞培养 30分钟, 在黑暗中培养5% 的 co2.
7. 使用流式细胞仪软件, 生成和标记3个样品文件的控制 "未经染色", "绿色 + 感应器", 和 "橙色 + 感应器" 样品, 确保指示要分析的通道参数 (fsc, ssc, fl1, fl2) 和所需的停止条件 (100μl、3分钟等)。为实验示例生成和标记一组类似的文件。
8. 运行 "未经染色, 未经处理" 的样品。打开 fsc (在 x 轴上) 与 ssc (在 y 轴上) 的点图, 并在感兴趣的细胞周围绘制一个门, 不包括死细胞和碎片 (死细胞和碎片比主细胞群要小很多, 出现在剧情的左下角)。
9. 使用此 "单元格" 门, 打开 fl1 (x 轴) 与 fl2 (y 轴) 的另一个点图。绘制一个初始象限门。调整象限门, 使事件出现在 fl1 与 fl2 图的左下角象限上。
10. 运行 "绿色 + 感应器" 示例。调整电压, 使事件出现在 fl1 与 fl2 图的左下角和右象限。将此补偿矩阵应用于所有3个示例文件。
11. 运行 "橙色 + 感应器" 示例。调整电压, 使事件出现在 fl1 与 fl2 图的左上角和下象限。将此补偿矩阵应用于所有3个示例文件。
12. 检查每个补偿文件, 并确保 "无污染, 未经处理" 事件出现在左下角象限, "绿色 + 诱导" 事件出现在左下角和右象限, "橙色 + 诱导器" 事件出现在 fl1 的左上角和下象限fl2 情节。将补偿矩阵应用于所有实验示例文件。
    1. 确保在将补偿矩阵应用于所有实验示例文件之前, 对所有控制示例文件进行适当的补偿。有关显示未补偿和正确补偿样品的代表性数据, 请参见图 2 。
       注: 许多细胞仪将 fl1 指定为标准的 FITC/GFP 通道 (由蓝色 488 nm 激光激发, 并用530滤光片集检测), fl2 指定为标准 pe 通道 (由蓝色488纳米激光激发, 用58/40 过滤器检测)。我们使用同样的惯例, 但请注意新的流式细胞仪用户咨询他们的流式细胞术核心经理, 以确保他们的细胞仪是类似的配置, 并使用适当的通道来检测这些探头。根据流式细胞仪和附带软件的模型, 可以在采集样品之前或之后进行补偿。如果事后补偿是可能的, 补偿步骤可以执行后, 所有实验样品已获得的细胞仪。对于动态范围内不需要 pmt 电压调整的细胞计, 也可以在单独的一天进行补偿实验, 并可节省实验模板 (包括补偿矩阵), 以减少执行所需的时间手动补偿。
13. 一旦进行了人工补偿, 并获得了实验模板, 就开始对实验样品进行处理。在用正极诱导剂或 fcγr 电池刺激治疗前, 标记哪些管得到 ros 抑制剂。在阳性诱导剂或 fcγr 刺激之前至少30分钟用 ros 抑制剂治疗这些细胞。
14. 要添加 ros 抑制剂, 请在200μl 的再悬浮细胞中加入1μl 的抑制剂 (不含抗 bsa igg₁), 以制备 5 mm 的最终浓度。
15. 用刺激 (或阳性诱导剂) 治疗细胞, 用 ros 探针加载细胞, 如下所示:
    1. 对于未受刺激的细胞: 在标记为 "染色、无刺激" 的200μl 细胞悬浮液中加入200μl 的2x 探针溶液, 而不刺激任何刺激。
    2. 对于阳性控制: 在标记为 "正诱导剂" 或 "正诱导剂 + 抑制剂" 的200微米细胞悬浮液中加入200μl 的2x 正诱导剂溶液 (在步骤6.1 中制备)。
    3. 对于 fcγr 交联 (特异性刺激) 刺激的细胞: 在标记为 "fcγr xl" 或 "fcγr xl + 抑制剂" 的200μl 细胞悬浮液中加入200μl 的 2x bsa 溶液 (在6.2 中制备)。
       注: 请记住, 通过每 x 分钟添加一次刺激来合并样本分析之间的滞后时间, 其中 x 是获取一个样本和下一个样本之间的滞后时间。
16. 在37°c 下将细胞培养 30分钟, 在黑暗中培养5% 的 co2.使用配备自动采样器的流式细胞仪对样品进行分析, 并对其进行刺激。使用初始补偿步骤中生成的分析模板。在分析之前不要清洗细胞。

7. 流式细胞术数据分析和预期结果

1. 在流式细胞仪软件中, 打开先前为实验样本生成的分析文件 (模板在步骤 6.7-6.12 中生成, 样本在步骤6.12 中运行)。确保对实验样品正确应用人工补偿矩阵。
   注: 对于流式细胞仪和流式细胞仪软件, 能够事后补偿, 如果补偿矩阵以前未应用于实验样本文件, 请将其应用于此时。
2. 类似于验证正确的手动补偿, 请确保实验样本中的控件按预期方式运行。
   1. 确保 "未经染色、未经处理" 事件出现在 fl1 与 fl2 图的左下角象限上, "正诱导器" 事件显示 fl1 对 fl2 图的左上角、右上角和右下角象限的荧光增加, 并且 "与 "正极诱导剂" 样本观察到的荧光相比, 正诱导剂 + ros 抑制剂 "事件显示 fl1 与 fl2 图的左上角、右上角和右下角象限的荧光减少。
   2. 如果实验样品中的对照没有显示出任何增加的荧光, 请检查是否执行了所有检测步骤, 验证骨髓衍生巨噬细胞 (2.7-2.19) 的适当生成和启动, 并重复实验。如果实验样品中的控制显示了预期的趋势, 请继续分析通过 fcγr 刺激的实验样品 (图 3a)。
3. 验证 fcγr 特异性刺激是否正常工作。运行 c57bl/6j wt 鼠标的以下样本: "未染色, 未受刺激"、"染色、未受刺激"、"染色、通过 fcγr 受刺激" 和 "染色, 通过 fcγr + ros 抑制剂受到刺激"。这些分别对应于第4节的 4.2 a、4.2 b、4.2 e 和 4.2 f 的样本。
   1. 确保 "未染色、未受刺激" 事件出现在 fl1 与 fl2 图的左下角象限上, "染色、未受刺激" 事件也将出现在 fl1 对 fl2 图的左下角象限上, 即 "染色, 通过 fcγr 受刺激" 事件在 fl1 与 fl2 图的左上角、右上角和右下角象限显示荧光增加, "通过 fcmar + ros 抑制剂刺激染色" 事件将显示左上角、右上角和右下角的荧光减少fl1 与 fl2 图的象限与 "染色, 通过 fcγr 刺激" 样品进行比较 (图 3 a)。
   2. 例如, 如果这些期望不能满足, 则与 "染色、未受刺激" 的样品或 "染色、未受刺激" 样品相比, "通过 fcγr 刺激的染色" 样品显示出的荧光量很小或没有增加与 "未染色、未受刺激" 的样品相比, 荧光水平提高, 检查所有检测步骤是否正确进行, 验证 bmdm 的适当生成、启动和处理 (2.7-2.19), 并重复实验。如果这些期望得到满足, 请对其余的实验样本进行分析。
      注: 产生与绿色探针 (过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮、过氧自由基等) 反应的 ros 的电池将出现在日志 fl1 (x 轴) 与日志 fl2 (y 轴) 点图的右上角和右下角象限。产生与橙色探针 (主要但不限于超氧化物) 反应的 ros 的细胞将出现在对数 fl1 (x 轴) 与对数 fl2 (y 轴) 点图的两个上象限中。
4. 生成单个直方图, 在感兴趣的细胞上控控, 用于分析 fl1 和 fl2 荧光。使用 "未染色, 未受刺激" 样本, 生成直方图标记, 使所有 "未染色, 未受刺激" 事件出现在此标记的左侧。将带有标记的此图应用于实验样本的其余部分 (图 3b)。
5. 以每个 ros 探针的细胞阳性百分比或通过显示受激样品的平均荧光强度 (mfi) 与对照 (图 3c)。

8. 细胞表面染色与 ros 生产的流式细胞仪分析相结合 (可选)

注: 此步骤提供了一种在刺激 fcγr 和 ros 测量之前使用细胞表面标记对巨噬细胞进行染色的协议。这可能有助于评估混合细胞群体中的 ros 产量。重要的是要选择一个抗体的巨噬细胞表面标记共轭到适当的氟, 不干扰荧光从氧化应激或超氧化物检测试剂。在该协议中, 使用了与亚历克莎氟化物647共轭的小鼠 f4/80 抗体。

1. 生成 bmdm, 收获和优质它们, 如前面所述 (第1节和第2节)。
   注: 至少需要三个6厘米板, 以执行所有实验控制和条件, 如下所述。一个盘子将用抗 bsa igg1 治疗 , 而血清饥饿, 而其他两个板块将不治疗。
   1. 包括4个实验控制, 用于流式细胞仪补偿 (每个实验):
      a) 未染色和未受刺激的细胞。
      b) 用氧化应激检测试剂 (绿色试剂) 和 ros 诱导剂处理的细胞。
      c) 使用超氧化物检测试剂 (橙色试剂) 和 ros 诱导剂处理的细胞。
      (d) 仅用与亚历克莎647结合的抗鼠 f480 染色的细胞。
   2. 对于每个小鼠或生物复制, 包括以下3个条件:
      a) 被 fn 80 染色, 没有受到刺激
      b) 用 fn 80 染色, 并通过 fcγr 激活
      c) 用 fnma/80 染色, 通过 fcγr 激活, 并用 ros 抑制剂处理
2. 在给巨噬细胞启动一夜后, 吸气上清液。用1-2 毫升的 pbs 清洗细胞一次。血清通过用同样体积的低血清 dmem 取代培养基使细胞挨饿。对于每只老鼠, 一个盘子将用抗 bsa igg1治疗, 而血清饥饿, 而其他两个盘子将不治疗。在37°c、5% co₂下将板材培育4小时。
3. 血清饥饿后, 通过温和刮擦或在 pbs 中使用 0.2 mm edta 来收获细胞。将每个板收集在标记为5毫升的圆底管中, 并以 750 x g的速度离心 5分钟. 跟踪哪些细胞被用小鼠抗 bsa igg₁处理。
4. 用1-2 毫升的 pbs 清洗细胞颗粒一次, 以去除所处理细胞中残留的抗 bsa。
5. 从低血清 dmem 600μl 中没有得到抗 bsa igg1 的细胞颗粒中的一个重新拔粒。这些细胞不会受到细胞表面染色。使用这些用于补偿控制。该细胞的 al2μl 悬浮在 (3) 5 毫升圆底管中, 标记为 a) 未染色, 未受刺激的 b) 绿色氧化应激试剂 + ros 诱导剂, c) 橙色超氧化物检测试剂 + ros 电感。
6. 在300μl 流式细胞术染色缓冲液 (pbs + 0.1% fbs₎中, 从没有得到抗 bsa igg 1 的板中重新拔粒其中一个细胞颗粒。用亚历克莎647抗小鼠 F4/80 将这种细胞悬浮到 (2) 5 毫升圆底管中。
7. 从接受抗 bsa igg1 的流式细胞术染色缓冲液中的板上重新注射细胞颗粒。用亚历克莎647抗小鼠 F4/80 将这种细胞悬浮到 (2) 5 毫升圆底管中。
8. 在8.6 和8.7 中被引用的细胞, 用5μl 的亚历克莎647抗鼠 fn 80 在冰上, 在黑暗中呆上30分钟。
9. 染色后, 在 750 x 克处加入2毫升的 pbs 和离心机清洗细胞, 吸入上清液, 并将每个管重新悬浮在200μl 的低血清 dmem 中, 不含苯酚红色。留出一个未经处理的管作为单独染色的 fl4 控制。如第3.9、3.5、6.1、6.2 和6.14 节所述, 准备探针、感应器、fcγ r 刺激和 ros 抑制剂。
   1. 对于不接受抗 bsa igg₁的细胞, 标签管具有以下: a) 无刺激或 b) ros 诱导。
   2. 对于接受抗 bsa igg₁的细胞, 贴上以下标签: a) fc xl 或 b) fc xl + 抑制剂。
10. 按照 6.5-6.6 中所述的各自处理方法, 根据其各自的处理方法, 对用于补偿的样品进行刺激, 以便在流式细胞仪上读取, 并将获取一个样本与下一个样本之间的滞后时间结合起来。
11. 在37°c 下将细胞培养 30分钟, 在黑暗中培养5% 的 co2.使用配备自动采样器的流式细胞仪对样品进行分析, 并对其进行刺激。
12. 按照6.7-6.12 中所述执行人工补偿, 并进行第7节所述的数据分析。
13. 使用流式细胞仪软件, 生成4个样品文件, 用于控制 "未经染色, 未经处理"、"绿色 + 感应器"、"橙色 + 感应器" 和 "fm\ 80 染色" 样品, 确保指示要分析的通道参数 (fsc、ssc、fl1、fl2、fl4)和所需的停止条件 (100μl、3分钟等)。
14. 运行示例并生成点图以执行手动补偿。
    1. 对于细胞表面染色, 生成两个附加图: fl1 (x 轴) 与 fl4 (y 轴) 和 fl2 (x 轴) 与 fl4 (y 轴)。调整电压, 以确保应用适当的补偿, 如图7a 所示。正确执行所有补偿后, 将补偿矩阵应用于所有实验示例文件。
15. 一旦进行了人工补偿并获得了实验模板, 即开始对 6.13-6.15.3 所述的实验样品进行处理, 并在6.13 中所述的流式细胞仪上获取样品。

结果

利用内概述的协议, 我们提出了具有代表性的数据, 证明流式细胞仪检测的 ros 生产产生刺激 wt c57bl/6j bmdm 通过 fcγr。如预期的那样, 我们观察到在未受刺激的细胞中 fl1 或 fl2 荧光在背景水平之上的微小变化 (图 3 a, 将 "染色、未受激" 与 "未染色、未受刺激" 的点图进行比较)。我们观察到 fl1 和 fl2 荧光在 fcγr 交联剂刺激时显著增加 (图 3a, 比较 "染色和刺...

讨论

dcfh 2-da 和基于 dhes 的 ros 检测是一种广泛使用的技术^14,15.这些 ros 探针在动力学微板格式、荧光显微镜或流式细胞仪分析中的易用性和适应性有助于其普及。然而, 在我们对 fcγr 介导的巨噬细胞功能的研究中, 似乎没有一个标准的方法来进行 fcγr 交联细胞的流式细胞仪分析。鉴于所评估的分析物的反应性, 我们发现时间安排对于确保实现重现性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BSA IgG1	Innovative Research	IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400626
Anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647	BD Biosciences	565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC	BioLegend	123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647	BioLegend	101218
beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV	Fisher	BP1600-100
C57BL/6J	Jackson labs	Stock No.000664
CM-H2DCFDA	Molecular Probes	C6827	Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE)	Molecular Probes	D11347	Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x	Corning	10-013-CV
DMEM no phenol red	Gibco	31053-028
DMF Anhydrous	Acros Organics	61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400506
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
L glutamine	Gibco	25030-081
LADMAC cells	ATCC	CRL-2420
MEM	Corning	10-010-CV
mouse IFN-g	GoldBio	1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine	EMD Milipore	106425	Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler	Acea	2060R
Pyocyanin (ROS inducer)	Cayman chemical	10009594	Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit	ENZO	ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056