Mesure de débit par cytométrie en flux de Production de ROS dans les Macrophages en réponse à la réticulation FcγR

Résumé

Cette étude démontre l’utilisation de la cytométrie à détecter une production réactives de l’oxygène (dro) résultant de l’activation de la FcγR. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les changements dans les antimicrobiens et oxydo-réduction fonction des phagocytes en réponse à des complexes immuns, micro-organismes opsonisées ou direct FcγR réticulation de signalisation.

Résumé

Le burst oxydatif ou respiratoire est utilisé pour décrire la consommation rapide d’oxygène et de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les phagocytes en réponse à divers stimuli immunitaires. ROS générées au cours de l’activation immunitaire exerce une activité antimicrobienne puissante principalement par le biais de la capacité du ROS à endommager l’ADN et les protéines, causant la mort des micro-organismes. Être capable de mesurer la production de ROS avec facilité et de façon reproductible est nécessaire afin d’évaluer la contribution des différentes voies et des molécules à ce mécanisme de défense de l’hôte. Dans cet article, nous montrent l’utilisation de sondes fluorescentes et cytométrie en flux pour détecter la production de ROS. Bien que largement utilisé, fluorescent mesure de ROS est notoirement difficile, surtout en ce qui concerne la mesure de ROS induite par des stimuli spécifiques et non mitogènes. Nous présentons une méthodologie détaillée pour détecter les ROS due à la stimulation spécifique de FcγR commençant par génération de macrophage, amorçage, coloration, FcγR réticulation et se terminant par cytométrie.

Introduction

Espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules réactives ou des radicaux libres qui sont des sous-produits de la respiration aérobie (évaluée à ¹). Il s’agit de l’anion superoxyde, peroxyde, peroxyde d’hydrogène, radical hydroxyle et ions d’hydroxyle, entre autres. Dans des conditions physiologiques normales, ROS sont produites principalement par les mitochondries et les oxydases de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) et sont rapidement détoxifiés par diverses enzymes et protéines comme la superoxyde dismutase et de glutathion. Une production exagérée de ROS ou un défaut de la possibilité de supprimer les ROS peut entraîner un stress oxydatif, selon laquelle les espèces réactives de l’oxygène promouvoir les dégâts des protéines, les lipides et l’ADN entraînant stress cellulaire ou mort et les États pathologiques de la maladie. Cependant, on constate actuellement que ROS peut aussi servir de molécules de signalisation (signalisation redox) et ROS induite par la modification des différentes molécules et intermédiaires de la voie peut influer sur le métabolisme cellulaire, la prolifération, la survie, inflammatoire signalisation et le vieillissement². Dans les cellules phagocytaires, ROS joue un rôle essentiel en fournissant une activité antimicrobienne durant la soi-disant « burst respiratoire »^1,3,4,5,6. Au cours de la réaction des phagocytes à des stimuli externes, composants de la NADPH oxydase complexe (p40^phox, p47^phox, p67^phox) translocation du cytosol vers la membrane phagosome contenant la gp91phox et p22phox sous-unités, et avec les actions de Rac1/2, forment un entièrement fonctionnel NADPH oxydase complexe enzymatique. La NADPH oxydase Assemblée puis utilise NADPH pour réduire l’oxygène de superoxyde dans la vacuole phagosome. Les anions superoxyde peuvent causer directement des dommages ou être dismutated en peroxyde d’hydrogène. Superoxyde et peroxyde d’hydrogène peuvent réagir avec d’autres molécules pour générer des radicaux hydroxyles très réactifs. Dommage est médiée par la réaction de ces ROS avec les clusters fer-soufre sur des protéines ou en provoquant une base oxydation de l’ADN, conduisant finalement à métabolisme microbien restreint ou mort du microbe⁵. L’importance de l’enzyme oxydase de NADPH complexe et ROS produites pendant l’explosion respiratoire est illustrée sur le plan clinique chez les patients avec maladie granulomateuse chronique (CGD)^{7,8,9, 10}. individus avec DMC possèdent des mutations gp91phox, ce qui entraîne un manque de production de ROS et la susceptibilité aux infections récurrentes avec les bactéries et les champignons qui ne sont pas habituellement une préoccupation avec les individus immunocompétents. Par conséquent, si étudiant oxidative stress, signalisation redox ou défense de l’hôte, étant capable de mesurer la production de ROS en temps réel est un effort utile.

Plusieurs essais ont été utilisés pour la production de ROS de mesure ou les résultats du stress oxydatif^11,12,13. Parmi ceux-ci, un des plus couramment utilisé est la sonde fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC₂-DA)¹⁴. Cette molécule est incolore et lipophiles. Diffusion de DHFC₂-DA à travers la membrane de la cellule lui permet d’être commandés par des estérases intracellulaires, qui il deacetylates en DHFC_2, rendant la cellule imperméable. Les actions de plusieurs types de ROS (peroxyde d’hydrogène, peroxynitrite, les radicaux hydroxyles, oxyde nitrique et radicaux peroxy) sur DHFC₂ il s’oxyder en DCF qui est fluorescent (déclarés Ex / Em : 485-500 nm/515-530 nm) et peut être détecté à l’aide d’un flux cytomètre équipé d’un filtre standard défini pour la fluorescéine (FL1 canal). Superoxyde ne réagit pas fermement avec DHFC₂ mais elle peut réagir avec une autre sonde dihydroethidium (DHE) pour donner le produit fluorescent 2-hydroxyethidium (ainsi que d’autres produits d’oxydation de superoxyde indépendant fluorescent)¹⁵. Les produits fluorescents d’oxydation DHE peuvent être détectés à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 518 nm et une longueur d’onde d’émission de 605 nm (FL2 canal). Bien que relativement simple d’utilisation, utilisation de ces sondes de détection de ROS nécessite une connaissance de leurs limites et intégration minutieuse de coloration des procédures et des contrôles dans le dosage spécifique en cours afin d’avoir valide expérimentale résultats et conclusions. Le protocole suivant illustre l’utilisation d’un kit disponible dans le commerce qui emploient ces 2 sondes conçues pour mesurer les ROS par cytométrie en flux. Nous avons tache apprêtées macrophages dérivés de la moelle osseuse avec ces sondes et induire la production de ROS par réticulation FcγR. Nous présentons des données représentatives obtenues à l’aide de ce protocole et insister sur les précautions appropriées doivent être entrepris dans une expérimentation réussie.

Protocole

Le protocole pour manutention des animaux a été approuvé par le Comité animalier institutionnel et l’utilisation (IACUC) de l’Université de Central Florida.

1. génération de moelle osseuse provenant des macrophages (BMDMs)

1. Préparation de milieux de culture
   1. Préparer les milieux base D10F : À de Dulbecco modifié Eagle (DMEM), ajouter 10 % chaleur inactivé sérum fœtal (SVF), pyruvate de sodium 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES) et 0,05 mM β-mercaptoéthanol.
      Remarque : Bien qu’il soit préférable d’utiliser les supports neufs D10F, D10F base médias peuvent être préparés vers le haut à deux semaines à l’avance pour être utilisé pour des expériences multiples dans une semaine. Pour une souris, environ 175 mL de D10F base médias est nécessaire (25 mL pour vider les OS) et 150 mL pour faire des médias de différenciation de macrophage
   2. Préparation des milieux de culture LADMAC : Minimum indispensable milieu Eagle au (EMEM), ajouter 10 % chaleur inactivé FBS et 2 mM de L-glutamine. Préparer les médias frais, le jour que vous souhaitez démarrer vos cultures.
      Remarque : Un litre de milieux de culture LADMAC se traduira par environ (19) 50 ml de médias conditionné par le LADMAC.
   3. Préparer les médias DMEM complet : DMEM, ajouter 10 % chaleur inactivé FBS et 1 x antibiotique-antimycosiques. Préparer les médias frais, le jour que bmdms seront récoltées.
      Remarque : Pour une souris, environ 100 mL de médias complet DMEM sera nécessaire. Cela inclut les supports utilisés pour l’amorçage les cellules.
2. Préparation du milieu conditionné LADMAC
   1. La croissance de LADMAC cellules à confluence dans un plat de 10 cm à l’aide de 10 mL de milieu de culture de LADMAC (défini au paragraphe 1.1.2). Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % CO_2.
   2. À la confluence, détacher les cellules en distribuant avec force les médias comparativement aux cellules. Cellules de passage en ajoutant 1 mL de cellules individuelles dans des fioles de T-175 contenant 100 mL de milieu de culture LADMAC. Incuber les cellules jusqu'à ce que complètement confluentes à 37 ° C, 5 % de CO₂ (environ une semaine). De cette façon, un plat de 10 cm peut produire des flacons de dix T-175 ou environ 1 L de milieux conditionnés.
   3. Une fois que les cellules sont prêtes, recueillir les milieux conditionnés et centrifuger à 350 x g pendant 5 min granuler les cellules non désirées. Filtrer les surnageants recueillies sur un filtre de 0,2 mm et stocker les aliquotes de 50 mL à-80 ° C. Aliquotes de médias conditionné par le LADMAC peuvent être conservés à-80 ° C pendant des mois avec une perte minimale de l’activité.
      Remarque : Si grandes expériences sont pressentis, préparer des lots importants de médias LADMAC-conditionné en même temps d’assurer la cohérence. Si ce n’est pas possible, utiliser des aliquotes provenant du même lot ou beaucoup de médias conditionné par le LADMAC pour chaque expérience.
3. Préparation de la moelle osseuse provenant des macrophages
   1. Le jour de l’expérience, préparer les milieux de différenciation macrophage frais en ajoutant 25 % de médias LADMAC conditionné dans préalablement préparée D10F médias (1 partie LADMAC conditionné en 3 parties D10F). Ne préparez pas ce média à l’avance ! Ne préparer autant de médias que nécessaire pour la culture BMDM.
   2. Jour 1: isoler les cellules de la moelle osseuse de souris selon le protocole décrit précédemment¹⁶ avec une modification pour vider la moelle osseuse du fémur et tibia à l’aide de médias de base D10F. 2,5 mL de D10F médias permet de rincer chaque extrémité des os (4). Rincer les cellules de la moelle osseuse directement dans une passoire de cellule pré humide de 40 mm posée sur un tube de 50 mL. Les médias restants (environ 5 mL) peuvent être utilisés pour rincer la crépine de la cellule.
   3. Centrifuger recueillies la moelle osseuse des cellules à 350 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un total de 30 mL de médias de différenciation de macrophages (par la souris).
   4. Préparer et identifiez les boîtes de Petri stérile de 10 cm (6). Plaque de 5 mL de médias de différenciation de macrophages dans chacun dans une boîte de pétri. Aliquote 5 mL d’extrait la moelle osseuse des cellules dans les médias de différenciation de macrophages dans chaque boîte de pétri pour un volume total de 10 mL par plat. Incuber pendant 5 jours à 37 ° C, 5 % CO_2.
   5. Jour 5: aspirer les médias des cellules. Laver une fois avec 1 à 2 mL de PBS et ajouter 10 mL de médias de différenciation macrophage fraîchement préparée. Incuber pendant encore 3 jours.
   6. Jour 8 : Procéder à la cueillette des BMDMs tel que décrit ci-dessous.

2. récolte, ensemencement et d’amorçage de BMDMs

1. Après 7 jours de plus en plus des BMDMs dans les médias de différenciation de macrophage, éliminer le surnageant. Laver les macrophages adhérentes une fois avec 1 à 2 mL de PBS. Aspirer le PBS.
2. Verser 1 mL de 0,25 % trypsine-EDTA dans chaque macrophage plaque et laissez-les dans un incubateur à 37 ° C pendant 5-10 min avec taraudage fréquent pour détacher les cellules. Dissocier les macrophages trypsinisés de pipetage et descendre à l’aide d’une pipette P1000 et collecter des macrophages en tubes de 50 mL contenant de 10 à 15 mL de médias DMEM complet. Laver la plaque avec les médias DMEM complet supplémentaire de 2 mL à la récolte des macrophages restants.
   Attention : Ne pas laisser les macrophages en trypsine pendant plus de 10 min.
3. Centrifuger les tubes de 50 mL à 350 x g pendant 5 min. jeter le surnageant. Doucement se dissocient la pastille et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de médias DMEM complet. Comte de macrophages utilisant un hémocytomètre en présence d’une viabilité teignent comme trypan blus comme suit :
   1. Par exemple, mélanger 90 µL du bleu Trypan avec 10 µL de cellules pour un 01:10 dilution.
   2. De ce mélange, charger 10 µL dans un hémocytomètre et compter la place centrale (grille de 5 x 5). Le nombre total de cellules = comte x 10⁴ x volume de dilution facteur x (10) (10 mL).
4. Ajuster la suspension cellulaire pour 1 million/ml dans les médias DMEM complet et plaque 4 mL de cette suspension cellulaire dans chaque plat de 6 cm.
   Remarque : Il faut un minimum de 3 plaques par expérience. Une plaque de cellules sera gauche non stimulée, une deuxième série de cellules est stimulée par le biais de réticulation de FcγRs, et la troisième plaque de cellules sera utilisée pour tous les autres expérimentaux et contrôles de cytométrie en flux.
5. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO₂.
6. Le lendemain, aspirer le surnageant, cellules de lavage une fois avec 1 à 2 mL de PBS. Ajouter 4 mL de support complet contenant 100 ng/mL la souris IFN-γ pour chaque plaque. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO₂.
7. Si vous le souhaitez, prélever une partie aliquote de cellules à évaluer de génération appropriée de BMDMs par cytométrie en flux. Utiliser 1 x 10⁶ cellules / test et préparer les tubes de FACs en polystyrène pour les conditions suivantes : contrôle de l’isotype, teinté avec F4/80 (ou alternativement, teinté avec CD11b).
8. Préparer la cytométrie en flux, tampon de coloration en ajoutant 0,1 % FBS dans PBS 1 x. Utilisez uniquement cette quantité de FBS manière à ne pas pour annuler les effets de la privation de sérum dans les étapes ultérieures.
9. Aliquote 1 x 10⁶ cellules / tube et centrifuger à 750 x g pendant 5 min.
10. Laver une fois par décantation ou aspirer le surnageant et resuspendant cellules dans 2 mL de tampon de cytométrie en flux. Centrifuger à 750 x g pendant 5 min.
11. Aspirer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 100 µL de cytométrie en souillant la mémoire tampon. Ajouter 1 µL d’anticorps bloquants de CD16/32 Fc anti-souris dans chaque tube. Incuber sur glace pendant 5 min.
12. Sans laver, ajouter 2 µL de anti-souris FITC F4/80 ou 1 µL d’APC de CD11b anticorps anti-souris les tubes « tachés » et un montant similaire de l’anticorps de contrôle isotype correspondant aux tubes « isotype ». Incuber sur la glace, dans l’obscurité, pendant 30 min.
13. Laver les cellules en ajoutant 2 mL de PBS directement aux cellules. Centrifuger à 750 x g pendant 5 min.
14. Aspirer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 150 µL de PBS.
15. Acquérir des échantillons sur un cytomètre en flux à l’aide d’une condition d’arrêt de 100 µL ou 10 000 événements sur la porte de l’intérêt et de veiller à ce que FSC, SSC, FL1 (anti-souris F4/80 FITC) ou FL4 (anti-souris CD11b APC) canaux sont sélectionnés pour les paramètres à analyser.
16. En utilisant le logiciel de cytométrie de flux, ouvrir un terrain de dot à FSC (sur l’axe des abscisses) vs SSC (sur l’axe des ordonnées) et dessiner une barrière autour des cellules d’intérêt, à l’exclusion des cellules mortes et les débris (les cellules mortes et les débris sont des événements beaucoup plus petites que la population des cellules principales et apparaissent sur le lowe r à gauche de l’intrigue).
17. Blocage sur les cellules d’intérêt, ouvrir un graphique histogramme avec FL1 (anti-souris F4/80 FITC) ou FL4 (anti-souris CD11b APC) sur l’axe des abscisses.
18. Exécuter l’exemple de « isotype ». Générer une porte marqueur tant que la majorité des événements d’échantillon « isotype » est à gauche de la porte (< 1 % positifs). Appliquer ce modèle dans le fichier de l’échantillon coloré.
19. Exécutez l’exemple « taché ». Génération succès de BMDMs se traduira par > expression de 95 % de FITC anti-souris F4/80 ou APC anti-souris CD11b (Figure 1 a), alors que les conditions de culture incorrecte peuvent entraîner une génération sous-optimal des macrophages (Figure 1 b).
    Remarque : Si la génération de BMDMs de plusieurs génotypes, prendre note de l’expression de ces marqueurs pour chaque lot de BMDM généré, dans le cas que cela peut être un motif pour exclure un échantillon d’analyse alors génération ROS en réponse au stimulus est évaluée.

3. réactif et matériel de préparation pour la mesure de ROS

1. Reconstituer le réactif de détection de stress oxydatif lyophilisée dans 60 µL de DMF anhydre pour obtenir une solution mère à 5 mM. Mélanger doucement avant de l’utiliser.
   Remarque : Il est indiqué dans le manuel du kit ROS-ID que la durée de vie du réactif reconstitué est environ 1 semaine à-20 ° C. Aliquotage la reconstitution immédiatement après réactif dans les petits flacons d’opaque minimise son oxydation et maximise la durée de conservation à-20 ° C.
2. Reconstituer le réactif de détection de superoxyde lyophilisée dans 60 µL de DMF anhydre pour obtenir une solution mère à 5 mM. Mélanger doucement avant de l’utiliser.
   Attention : comme indiqué dans le manuel de la trousse, traiter les deux réactifs de détection comme mutagènes possibles, chacune avec soin et dispose de gérer correctement.
3. Reconstituer l’inducteur ROS (Pyocyanine) dans 20 µL du DMF anhydre pour donner une solution stock de 50 mM.
4. Reconstituer l’inhibiteur de ROS (N-acétyl-L-cystéine) dans 123 µL d’eau déionisée pour obtenir une concentration de stock de 0,5 M.
5. 5 mL polystyrène tubes (tubes de cytométrie en flux) avec les contrôles expérimentaux et les conditions de l’étiquette. (Voir 4. Conditions d’essais et contrôles)
6. Préparer sérique DMEM (sans rouge de phénol) en ajoutant 0,1 % FBS à DMEM exempt de rouge de phénol.
7. Aliquote l’anticorps anti-BSA en petites parties aliquotes (selon l’utilisation) et les stocker à-80 ° C.
8. Préparer la solution mère de 100 mg/mL de BSA dans HBSS (Hanks balanced solution saline) ou PBS. Aliquote dans 100 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C.
9. Préparer une solution de 2 x des sondes ROS (2 x solution de sonde) : pour chaque 10 mL de sérum faible DMEM, ajoutez 4 µL de réactif de détection de stress oxydatif (colorant vert) et 4 µL de réactif de détection de superoxyde (colorant orange).
10. Préparer 2 x solutions de sonde contenant seulement réactif de détection de stress oxydatif (2 x solution de sonde, vert seulement), ou contenant seulement superoxyde réactif de détection (2 x solution de sonde, orange uniquement). Préparer seulement la quantité de réactif nécessaire pour l’expérience et toujours préparer la solution de 2 x immédiatement avant leur utilisation.
    Remarque : Pour préparer des petits volumes de 2 x solution de détection, utilisez un intermédiaire 01:10 dilution des réactifs de détection fois vert et Orange avant dilution finale en DMEM. Par exemple, pour préparer 1 mL d’un 2 x solution de détection, diluer 1 µL de chaque sonde dans 9 µL de DMEM (01:10 intermédiaire de dilution). Diluer 4 µL de cette 01:10 intermédiaire dilution dans 1 mL de DMEM.

4. analyse des conditions et des contrôles

1. Incluez les contrôles expérimentaux suivants pour la compensation du débit par cytométrie en flux pour chaque expérience :
   a) cellules non colorés et non stimulés.
   b) cellules colorées uniquement avec le réactif de détection du stress oxydatif (vert réactif) et traitement avec inducteur ROS.
   c) cellules colorées uniquement avec le réactif de détection de superoxyde (orange réactif) et traitement avec inducteur ROS.
2. Pour chaque souris ou replicate biologique, comprennent 6 conditions suivantes :
   a) cellules non colorés et non stimulées
   b) cellules colorées et non stimulées
   Vitrail c) cellules traitées avec inducteur positif
   d) teinté de cellules traitées avec inducteur positive et inhibiteur de ROS
   e) teintés cellules activées par réticulation FcγR
   f) cellules colorées activé par le biais de FcγR réticulation et traitement par inhibiteur de ROS
3. Calculer le montant de 2 x solution de sonde nécessaire dépend du nombre de souris et conditions (200 µL de la 2 x solution de sonde qui servira pour chaque condition exigeant une coloration).
   Remarque : Pour un dosage à l’aide de 6 souris, 5 conditions exigeant une coloration avec les sondes seront nécessaires par la souris. Cela porte le nombre total d’assignations à 30. Ainsi, le montant total de la solution de sonde x 2 nécessaire est au moins 6 mL (30 * 200 µL).

5. cellule préparation

1. Après amorçage les macrophages du jour au lendemain, aspirer le surnageant. Laver les cellules une fois avec du PBS.
2. Sérum de faim les cellules en remplaçant les médias avec le même volume de DMEM sérique. Pour chaque souris, une seule plaque goûterez avec d’IgG anti-BSA₁ tout en sérum de faim, tandis que l’autre sera laissé non traité. Ajoutez seulement DMEM sérique à plaques non traitées. Ajouter sérique DMEM contenant 2,5 µg/mL de murin d’IgG anti-BSA₁ à plaques traitées.
   Remarque : Une plaque sans traitement supplémentaire est nécessaire pour chacune des expériences pour les contrôles de compensation cytométrie en flux.
3. Incuber les boîtes pendant 4 h à 37 ° C, 5 % de CO₂.
4. Après le sérum de la faim, récolter les cellules en grattant doucement ou à l’aide de 0,2 mM EDTA dans du PBS. Collectionnez-les dans marqués 5 mL fond tubes ronds et centrifuger à 750 g pendant 5 min. assurer le suivi des cellules qui ont été traités avec murin anti-BSA IgG₁.
5. Laver les granulés de la cellule une fois avec 2 mL de PBS pour se débarrasser de toute anti-BSA résiduel provenant des cellules traitées.
6. Resuspendre culot cellulaire dans 600 µL de sérum faible DMEM.
7. De la suspension de cellules 600 µL, aliquote 200 µL dans les 5 mL préétiqueté bas tubes ronds comme suit :
   1. Des cellules non traitées, prendre 200 µL pour tubes portant la mention « non stimulées », 200 µL pour étiquetés « inducteur positive » tubes et 200 µL pour tubes portant la mention « inducteur positif + inhibiteur »
   2. De la d’IgG anti-BSA₁ cellules traitées, prendre 200 µL pour tubes portant la mention « FcγR réticulation/FcγR XL » et 200 µL pour tubes portant la mention « FcγR XL + inhibiteur »
   3. Des cellules non traitées pour être utilisée pour les contrôles de l’indemnisation, prendre 200 µL pour le tube portant la mention « non souillées enregistré non stimulées », 200 µL pour le « vert + inducteur » contrôle et 200 µL pour « orange + inducteur » contrôlent.
      Remarque : Si les cellules de 5.7.1 et 5.7.3 proviennent de la même souris, les cellules de la même « non souillées enregistré non stimulées » peuvent être utilisés pour le contrôle expérimental et l’indemnisation. Sinon, il faudra une supplémentaire de 200 µL de cellules d’un contrôle expérimental « non souillées enregistré non stimulées » pour un).
8. Garder les tubes sur la glace jusqu'à coloration et de stimulation. Au cours de la privation de sérum et de fixation de l’IgG_1, préparer les sondes, les stimuli spécifiques et inducteurs comme indiqué ci-dessous.
   Remarque : Si vous effectuez le test pour la première fois, si aucun modèle n’est disponible, ou aucune indemnisation après coup n’est disponible sur le cytomètre en flux et le logiciel correspondant, stimuler et tacher les commandes de compensation et exécuter ceux-ci sur le cytomètre en flux pour effectuer ajout manuel de compensation avant de stimuli à échantillons expérimentaux.

6. réalisation de l’essai

1. Préparer 2 x solution positive inducteur en diluant la Pyocyanine au 1/100 dans le 2 x solution de sonde (préparée à l’étape 3.9) pour obtenir une concentration de 2 x 500 µm de pyocyanine (concentration finale sera 250 µM). Aussi, diluer au 1/100 de pyocyanine dans chacun des « 2 x solution de sonde, green uniquement » et « solution de sonde x 2, orange seulement » tubes préparés en 3.10.
   Remarque : Les deux conditions marquées par « inducteur positive » et « inducteur positif + inhibiteur » seront traitées avec l’inducteur positive. Planifier en conséquence lors du calcul de la quantité de 2 x positif inducteur solution à préparer. Par exemple : si vous effectuez le test avec 3 souris, 6 conditions (3 * 2) seront traitées avec inducteur positif, afin de préparer 6 * 200 µL = 1,2 mL de 2 x solution positive inducteur.
2. Préparer un 2 x solution de BSA en diluant la solution mère de BSA dans 2 x solution de sonde pour obtenir une concentration de 2 µg/mL (concentration finale sera à 1 µg/mL).
   Remarque : Les deux conditions marquées par « FcγR XL » et « FcγR XL + inhibiteur » seront traitées avec le 2 x solution de BSA. Planifier en conséquence lors du calcul de la quantité de solution à préparer. Par exemple : si la réalisation de l’essai à l’aide de la 3 souris, 6 (3 * 2) conditions seront traitées avec la solution BSA et donc 6 * 200 µL ou 1,2 mL de 2 x solution de BSA seront nécessaires.
3. Avant de commencer la stimulation spécifique (FcγR réticulation), assurez-vous que tous les réactifs et les cellules sont prêtes. Placer les tubes sur la glace dans l’ordre qu'ils seront stimulés.
4. Pour cytomètres avec un échantillonneur automatique, prendre note de l’époque qui le cytomètre prend pour analyser un échantillon et passer à la suivante, y compris n’importe quel mélange et sonde de lavage étapes (par exemple 3,5 min).
   Remarque : le moment est très critique avec ce test. Afin que toutes les conditions être bien contrôlée, la stimulation doit être effectué pour l’heure exacte (30 min) pour chaque condition. Stimuler les cellules dans l’ordre et d’intégrer le temps de latence entre l’acquisition d’échantillon par le cytomètre en flux. Par exemple, si le temps nécessaire pour le cytomètre à analyser un échantillon et de passer à la suivante est 3,5 min, stimuler les cellules dans l’ordre, qu'ils seront analysés toutes les 3,5 minutes.
5. Si vous effectuez la compensation manuelle à ce stade, stimuler les tubes de contrôle à utiliser pour la réparation (étape 5.7.3). Ajouter 200 µL de « 2 x solution de sonde, vert seulement » contenant l’inducteur (à partir de 6.1) dans les tubes marqués « green + inducteur » (étape 5.7.3). Ajouter 200 µL de « 2 x solution de sonde, orange seulement » contenant l’inducteur (étape 6.1) dans les tubes marqués « orange + inducteur » (étape 5.7.3).
6. Incuber les cellules pour 30 min à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans l’obscurité.
7. En utilisant le logiciel de cytométrie en flux, générer et étiqueter les 3 fichiers d’exemple pour le contrôle « non souillées enregistré, n’est pas traité », « green + inducteur », et « orange + inducteur » échantillons, en veillant à indiquer les canaux/paramètres sont analysés (FSC, SSC, FL1, FL2) et désiré arrêter conditions (100 µL, 3 min, etc.). Générer et étiqueter un ensemble similaire de fichiers pour échantillons expérimentaux.
8. Exécutez l’exemple « sans tache, non traités ». Ouvrir un terrain de dot à FSC (sur l’axe des abscisses) vs SSC (sur l’axe des ordonnées) et d’en tirer une barrière autour des cellules d’intérêt, à l’exclusion des cellules mortes et les débris (les cellules mortes et les débris sont des événements beaucoup plus petites que la population des cellules principales et apparaissent en bas à gauche de l’intrigue).
9. Cette barrière de « cellules », ouvrez une autre parcelle de dot de FL1 (axe x) vs FL2 (axe y). Dessiner une grille initiale quadrant. Ajuster les portes quadrant pour que les événements apparaissent sur le quadrant inférieur gauche de l’intrigue de vs FL2 FL1.
10. Exécuter l’exemple de « green + inducteur ». Ajuster la tension afin que les événements apparaissent sur les quadrants inférieurs gauche et droit du complot vs FL2 FL1. Applique cette matrice de compensation à tous les fichiers d’exemple 3.
11. Exécuter l’exemple de « orange + inducteur ». Ajuster la tension afin que les événements apparaissent sur le haut et le bas gauche quadrants de l’intrigue de vs FL2 FL1. Applique cette matrice de compensation à tous les fichiers d’exemple 3.
12. Vérifier chaque fichier de compensation et de veiller à ce que les événements « non souillées enregistré, n’est pas traité » s’affichent sur le quadrant inférieur gauche, « green + inducteur » événements apparaissent sur les quadrants inférieurs gauche et droit, et « orange + inducteur » événements apparaissent sur le haut et le bas gauche quadrants de la vs FL1 FL2 intrigue. Appliquer la matrice de compensation à tous les fichiers d’exemple expérimental.
    1. Veiller à ce qu’une compensation appropriée est appliquée à tous les fichiers d’exemple de contrôle avant d’appliquer la matrice de compensation à tous les fichiers de l’échantillon expérimental. Reportez-vous à la Figure 2 pour données représentatives montrant sans compensation et échantillons correctement rémunérés.
       NOTE : Nombreux cytomètres de flux désignent FL1 comme la norme canal FITC/GFP (excitée par le laser bleu à 488 nm et détectée avec un jeu de filtres de 530/30) et LV2 comme le canal standard de PE (excitée par le laser bleu à 488 nm et détectée avec un jeu de filtres de 585/40). Nous utilisons cette même convention mais attention nouvel écoulement cytometry utilisateurs de consulter leur gestionnaire de core de cytométrie en flux pour s’assurer que leur cytomètre est configuré de la même manière et que les voies appropriées sont utilisées pour détecter ces sondes. Selon le modèle du cytomètre en flux et qui accompagne le logiciel, il peut être possible d’effectuer une compensation avant ou après que les échantillons ont été acquis. Si après le fait est possible, l’étape de compensation peut être effectuée que tous les échantillons expérimentaux ont été acquis par le cytomètre. Pour les cytomètres de flux avec une plage dynamique, où les ajustements de tension PMT ne sont pas nécessaires, une expérience indemnité peut également être effectuée un jour séparée et le modèle expérimental (y compris la matrice de rémunération) peut être enregistré afin de réduire le temps nécessaire pour effectuer compensation manuelle.
13. Une fois la compensation manuelle a été effectuée et on obtient un modèle expérimental, commencer le traitement d’échantillons expérimentaux. Avant de traiter avec l’inducteur positive ou la stimulation des cellules FcγR, marquer les tubes obtenir inhibiteur de ROS. Traiter ces cellules avec le ROS inhibiteur au moins 30 min avant l’inducteur positive ou FcγR stimulation.
14. Pour ajouter l’inhibiteur ROS, préparer une concentration finale de 5 mM en ajoutant 1 µL de l’inhibiteur à 200 µL de cellules resuspendues (sans anti-BSA IgG₁).
15. Traiter les cellules avec le stimulus (ou inducteur positive) et charger les cellules avec les sondes ROS comme suit :
    1. Pour les cellules non stimulées : ajouter 200 µL de 2 x solution de sonde sans n’importe quel stimulus à la 200 µL de la suspension cellulaire portant la mention « teinté, non stimulées ».
    2. Pour des contrôles positifs : ajouter 200 µL de 2 x solution positive inducteur (préparée à l’étape 6.1) dans 200 µL de la suspension de cellules portant la mention « inducteur positif » ou « inducteur positif + inhibiteur ».
    3. Pour les cellules stimulées par réticulation FcγR (excitation spécifique) : ajouter 200 µL de 2 x solution de BSA (préparée en 6.2) dans 200 µL de la suspension de cellules portant la mention « Fcγr XL » ou « FcγR XL + inhibiteur ».
       Remarque : N’oubliez pas d’intégrer le temps de latence entre l’analyse de l’échantillon en ajoutant relance chaque min x où x est le temps de latence entre l’acquisition d’un échantillon et de l’autre.
16. Incuber les cellules pour 30 min à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans l’obscurité. Analyse des échantillons dans l’ordre qu’ils ont été stimulés à l’aide d’un cytomètre en flux équipé avec un échantillonneur automatique. Utiliser des modèles d’analyse générés au cours des étapes initiales de compensation. Ne pas laver les cellules avant l’analyse.

7. flow cytometry analyse des données et résultats escomptés

1. Dans le logiciel de cytométrie en flux, ouvrez les fichiers de l’analyse précédemment généré pour les échantillons expérimentaux (modèles ont été obtenues en étapes 6,7-6.12 des échantillons ont été exécutés à l’étape 6.16). Veiller à ce que la matrice de compensation d’exécuter la compensation manuelle a été correctement appliquée aux échantillons expérimentaux.
   Remarque : Pour les cytomètres et écoulement cytometry logiciel capable de compensation après le fait, si la matrice de rémunération n’était pas précédemment appliquée pour les fichiers d’exemple expérimental, appliquez-le à ce stade.
2. Semblable à une vérification de compensation manuelle correcte, s’assurer que les contrôles au sein des échantillons expérimentaux se comportent comme prévu.
   1. Veiller à ce que les événements « sans tache, non traités » apparaîtra sur le quadrant inférieur gauche du complot FL1 FL2 vs, que les événements « inducteur positive » montrent une fluorescence accrue dans la coin supérieur gauche, supérieur droit et inférieur droit quadrants de l’intrigue de FL2 vs FL1 et qui » inducteur positif + inhibiteur de ROS » événements montrent une réduction de fluorescence dans le coin supérieur gauche, supérieur droit et inférieur droit quadrants de la vs FL1 FL2 intrigue par rapport à la fluorescence observée avec l’échantillon « inducteur positive ».
   2. Si les contrôles au sein des échantillons expérimentaux ne montrent pas une augmentation de la fluorescence, vérifiez que toutes les étapes de test ont été effectués, vérifier la génération appropriée et amorçage des macrophages dérivés de la moelle osseuse (2,7 à 2.19) et répéter l’expérience. Si les contrôles au sein des échantillons expérimentaux montrent les tendances attendues, procéder pour analyser les échantillons expérimentaux stimulé par le FcγR (Figure 3 a).
3. Vérifier que le stimulus FcγR spécifique fonctionne correctement. Exécuter les exemples suivants d’une souris C57BL/6J WT : « non souillées enregistré non stimulés », « teinté, non stimulés », « colorés, stimulée par le FcγR », et « teinté, stimulée par la FcγR + ROS inhibiteur ». Ceux-ci correspondent aux échantillons 4. 2 a, 4. 2 b, 4.2e et 4.2f dans la section 4, respectivement.
   1. S’assurer que les événements « non souillées enregistré, non stimulés » apparaîtra sur le quadrant inférieur gauche de l’intrigue de vs FL2 FL1, que « teinté, non stimulés » événements apparaîtra également sur le quadrant inférieur gauche de l’intrigue de vs FL2 FL1, que les événements « colorées, stimulés par le FcγR » montrent une fluorescence accrue dans la coin supérieur gauche, supérieur droit et inférieur droit quadrants de l’intrigue de vs FL2 FL1 et qui « teinté, stimulée par la FcγR + ROS inhibiteur » événements affichera une diminution de fluorescence dans le coin supérieur gauche, en haut à droite et en bas à droite quadrants du vs FL1 FL2 tracé par rapport à l’échantillon « tachées, stimulée par le FcγR » (Figure 3 a).
   2. Si ces attentes ne sont pas remplies, par exemple, l’échantillon « tachées, stimulée par le FcγR » montre peu ou aucune fluorescence accrue par rapport à l’échantillon « teinté, non stimulées », ou l’échantillon « teinté, non stimulées » déjà ne montre nettement des niveaux accrus de fluorescence par rapport à l’échantillon « sans tache, non stimulées », vérifier que toutes les étapes de test ont été effectués correctement, vérifier la génération appropriée, d’amorçage et le traitement des BMDMs (2,7 à 2.19) et répéter l’expérience. Si ces attentes sont satisfaites, procéder à l’analyse du reste des échantillons expérimentaux.
      NOTE : Les cellules produisant des offices récepteurs qui réagissent avec la sonde verte (peroxyde d’hydrogène, peroxynitrite, les radicaux hydroxyles, oxyde nitrique, radicaux peroxy, etc) apparaîtra en haut à droite et inférieure droite quadrants du rondin FL1 (axe x) par rapport à un journal FL2 plot point (axe y). Les cellules produisant des offices récepteurs qui réagissent avec la sonde orange (principalement mais pas exclusivement le superoxyde) apparaîtra dans les deux supérieures quadrants du rondin FL1 (axe x) par rapport à un journal FL2 plot point (axe y).
4. Générer les histogrammes individuels, bloquées sur les cellules d’intérêt, pour l’analyse de la fluorescence de LV1 et LV2. En utilisant les échantillons « sans tache, non stimulées », générer un marqueur histogramme tel que tous les événements « sans tache, non stimulées » apparaissent à gauche de ce marqueur. Appliquer cette intrigue avec le marqueur au reste des échantillons expérimentaux (Figure 3 b).
5. Présenter les résultats de l’expérience dans le pourcentage des cellules positives pour chacune des sondes ROS ou par affichage de l’intensité de fluorescence moyenne (IMF) des échantillons stimulées par opposition à contrôle (Figure 3).

8. surface de la cellule coloration en combinaison avec l’analyse en cytométrie en flux de production de ROS (facultatif)

Remarque : Cette étape fournit un protocole pour la coloration des macrophages avec un marqueur de surface cellulaire avant la stimulation de la mesure FcγR et ROS. Cela peut être utile dans l’évaluation de la production de ROS dans les populations de cellules mixtes. Il est important de choisir un anticorps de marqueur de surface macrophage conjugué à un fluor appropriée qui n’interfère pas avec la fluorescence des réactifs de détection superoxyde ou de stress oxydatifs. Dans le présent protocole, un anticorps de souris que F4/80 conjugué à l’Alexa fluor 647 est utilisé.

1. Générer des BMDMs, récolter et amorcer leur tel que décrit précédemment (sections 1 et 2).
   NOTE : Un minimum de trois plaques de 6 cm sont nécessaires afin d’effectuer tous les contrôles expérimentaux et les conditions décrites ci-dessous. Une plaque sera traitée avec anti-BSA IgG₁ tandis que le sérum de faim alors que les deux autres plaques seront laissés sans traitement.
   1. Comprend 4 contrôles expérimentaux qui seront utilisés pour la compensation du débit par cytométrie en flux (par expérience) :
      a) cellules non colorés et non stimulés.
      b) des cellules traitées avec le réactif de détection de stress oxydatif (réactif de vert) et la volute ROS.
      c) cellules traitées avec le réactif de détection de superoxyde (orange réactif) et la volute ROS.
      d) cellules colorées uniquement avec anti-souris que F4/80 conjugué à Alexa 647.
   2. Pour chaque souris ou replicate biologique, comprennent 3 conditions suivantes :
      a) colorées avec F4/80 et de la gauche non stimulées
      b) teinté avec F4/80 et activé par le biais de la FcγR
      c) teinté avec F4/80 et activé par le biais de la FcγR et traités par inhibiteur de ROS
2. Après amorçage les macrophages du jour au lendemain, aspirer le surnageant. Laver les cellules une fois avec 1 à 2 mL de PBS. Sérum de faim les cellules en remplaçant les médias avec le même volume de DMEM sérique. Pour chaque souris, une plaque sera traitée avec anti-BSA IgG₁ tout en sérum de faim, alors que les deux autres plaques va être traitée. Incuber les boîtes pendant 4 h à 37 ° C, 5 % de CO₂.
3. Après le sérum de la faim, récolter les cellules en grattant doucement ou à l’aide de 0,2 mM EDTA dans du PBS. Collecter chaque plaque dans marqués 5 mL fond tubes ronds et centrifuger à 750 g pendant 5 min. assurer le suivi des cellules qui ont été traités avec murin anti-BSA IgG₁.
4. Laver les granulés de la cellule une fois avec 1 à 2 mL de PBS pour se débarrasser de toute anti-BSA résiduel provenant des cellules traitées.
5. Parmi les granules cellulaires de la plaque qui n’a pas obtenu d’IgG anti-BSA₁ à 600 µL de sérum faible DMEM resuspendre. Ces cellules vont pas être soumis à la coloration surface cellulaire. Utilisez-les pour les contrôles de l’indemnisation. Aliquote 200 µL de cette suspension cellulaire en (3) 5 mL rond bas tubes étiquetés stress oxydatif a) sans tache, non stimulées b) vert réactif, inducteur ROS, réactif de détection de superoxyde c) orange + inducteur ROS.
6. Remettre un de la cellule pastilles de la plaque qui n’a pas eu d’anti-BSA IgG_1, dans 300 µL d’écoulement cytometry coloration tampon (PBS + 0,1 % FBS). Aliquotes de 100 µL de cette suspension cellulaire en (2) 5 mL autour des tubes du bas pour la coloration avec Alexa 647 anti-souris F4/80.
7. Remettre en suspension les granules cellulaires de la plaque qui a reçu d’IgG anti-BSA₁ à 300 µL de tampon de coloration cytométrie en flux. Aliquotes de 100 µL de cette suspension cellulaire en (2) 5 mL autour des tubes du bas pour la coloration avec Alexa 647 anti-souris F4/80.
8. Colorer les cellules, qui ont été aliquotés dans 8.6 et 8.7, 5 µl de Alexa 647 anti-souris F4/80 pendant 30 minutes sur la glace, dans l’obscurité.
9. Après coloration, cellules de lavage en ajoutant 2 mL de PBS et centrifuger à 750 g, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans chaque tube dans 200 µL de sérum faible DMEM sans rouge de phénol. Mettre de côté un tube non traité pour servir individuellement coloré FL4 contrôle. Préparer les sondes, inducteur, stimulation FcγR et inhibiteurs de ROS comme il est indiqué dans les sections 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 et 6.14.
   1. Pour les cellules ne reçoivent ne pas anti-BSA IgG₁, identifier les tubes par ce qui suit : a) aucun stimulus ou inducteur ROS b).
   2. Pour les cellules qui ont reçu des anti-BSA IgG₁, étiquette avec ce qui suit : un) XL Fc ou Fc b) XL + inhibiteur.
10. Stimuler les échantillons à utiliser d’indemnisation selon leurs traitements respectifs comme il est indiqué en 6,5 à 6,6, dans l’ordre dans lequel ils seront lus sur le cytomètre, intégrant le temps de latence entre l’acquisition d’un échantillon et la suivante.
11. Incuber les cellules pour 30 min à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans l’obscurité. Analyse des échantillons dans l’ordre qu’ils ont été stimulés à l’aide d’un cytomètre en flux équipé avec un échantillonneur automatique.
12. Effectuer une compensation manuelle telle que décrite dans l’analyse de données et de 6,7-6.12 tel que décrit à l’article 7.
13. En utilisant le logiciel de cytométrie de flux, générer et étiqueter les 4 exemples de fichiers pour le contrôle « non souillées enregistré, n’est pas traité », « vert + inducteur », « orange + inducteur » et « F4/80 taché » échantillons, en veillant à indiquer les voies et les paramètres pour être analysé (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) et les conditions de l’arrêt souhaité (100 µL, 3 min, etc.).
14. Exécuter les exemples et générer des parcelles de dot pour effectuer une compensation manuelle.
    1. Pour souiller surface cellulaire, générer deux parcelles supplémentaires : LV1 (axe x) vs FL4 (axe y) et LV2 (axe x) vs FL4 (axe y). Ajuster la tension pour s’assurer qu’une compensation appropriée est appliquée comme indiqué dans la Figure 7 a. Une fois que toute la rémunération a été correctement effectuée, appliquer la matrice de compensation à tous les fichiers d’exemple expérimental.
15. Une fois la compensation manuelle a été effectuée et on obtient un modèle expérimental, commencer le traitement d’échantillons expérimentaux comme indiqué dans 6.13-6.15.3 et acquérir des échantillons sur un cytomètre en flux comme décrit dans 6.16.

Résultats

En utilisant le protocole décrit au sein, nous présentons des données représentatives démontrant la détection cytométrie en flux de production de ROS résultant de la stimulation du WT C57BL/6J BMDMs à travers le FcγR. Comme prévu, nous observons des changements minimes dans la fluorescence LV1 ou LV2 au-dessus des niveaux de fond dans les cellules non stimulées (Figure 3 a, compare contre « teinté, non stimulées » dot « sans tache, non stimulées » parcelles). Nous obse...

Discussion

DHFC₂-DA et détection DHE de ROS est une technique largement utilisée^14,15. Facilité d’utilisation et l’adaptabilité de ces sondes ROS pour les formats microplaques cinétiques, analyse de fluorescence microscopie ou flux de cytométrie de flux a contribué à leur popularité. Toutefois, dans nos études des fonctions de médiation FcγR macrophage, il semblait être un protocole standard pour la réalisation de cet essai pour cytométrie de F...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BSA IgG1	Innovative Research	IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400626
Anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647	BD Biosciences	565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC	BioLegend	123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647	BioLegend	101218
beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV	Fisher	BP1600-100
C57BL/6J	Jackson labs	Stock No.000664
CM-H2DCFDA	Molecular Probes	C6827	Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE)	Molecular Probes	D11347	Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x	Corning	10-013-CV
DMEM no phenol red	Gibco	31053-028
DMF Anhydrous	Acros Organics	61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400506
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
L glutamine	Gibco	25030-081
LADMAC cells	ATCC	CRL-2420
MEM	Corning	10-010-CV
mouse IFN-g	GoldBio	1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine	EMD Milipore	106425	Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler	Acea	2060R
Pyocyanin (ROS inducer)	Cayman chemical	10009594	Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit	ENZO	ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056