Misurazione del flusso Cytometric di produzione di ROS nei macrofagi In risposta a FcγR cross-linking

Riepilogo

Questo studio dimostra l'uso di citometria a flusso per rilevare produzione reattiva dell'ossigeno specie (ROS) derivanti dall'attivazione della FcγR. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella funzione dei fagociti in risposta a complessi immuni, opsonized microrganismi o diretto FcγR cross-linking di segnalazione redox e antimicrobico.

Abstract

Il burst ossidativo o respiratorio è usato per descrivere il rapido consumo di ossigeno e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da parte dei fagociti in risposta a vari stimoli immuni. ROS generati durante l'attivazione del sistema immunitario esercita la potente attività antimicrobica principalmente attraverso la capacità di ROS di danneggiare il DNA e proteine, causando la morte dei microrganismi. Essere in grado di misurare la produzione di ROS riproducibile e con facilità è necessario al fine di valutare il contributo dei vari meccanismi e nuove molecole per questo meccanismo di difesa ospite. In questa carta, dimostriamo l'utilizzo di sonde fluorescenti e flusso cytometry per rilevare la produzione di ROS. Anche se ampiamente utilizzato, misure in fluorescenza di ROS sono notoriamente problematica, soprattutto per quanto riguarda la misura del ROS indotta da stimoli specifici e non mitogenici. Vi presentiamo una dettagliata metodologia per rilevare ROS generati a seguito di stimolazione specifica di FcγR cominciando con generazione del macrofago, adescamento, colorazione, FcγR cross-linking e termina con l'analisi cytometric di flusso.

Introduzione

Specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole reattive o i radicali liberi che sono sottoprodotti della respirazione aerobica (rivisto in ¹). Questi includono l'anione superossido, il perossido, perossido di idrogeno, radicale ossidrile e ioni dell'idrossile, tra gli altri. In condizioni fisiologiche normali, ROS sono prodotte principalmente dalla mitocondri e nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi e sono rapidamente disintossicati da vari enzimi e proteine quali superossido dismutasi e glutatione. Una produzione esagerata di ROS o un difetto nella capacità di rimuovere ROS può causare stress ossidativo, per cui le specie reattive dell'ossigeno promuovono il danno di proteine, lipidi e DNA che portano a stress cellulare o morte e Stati di malattia patologica. Tuttavia, attualmente è apprezzato che ROS può anche fungere da molecole di segnalazione (segnalazione redox), e modifica ROS-mediato di varie molecole e via intermedi può influire sul metabolismo cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza, infiammatoria segnalazione e invecchiamento². In cellule fagocitiche, ROS svolge un ruolo essenziale nel fornire attività antimicrobica durante il cosiddetto "scoppio respiratorio"^1,3,4,5,6. Durante la risposta dei fagociti agli stimoli esterni, componenti della NADPH ossidasi complessa (p40^phox, p47^phox, p67^phox) traslocano dal citosol alla membrana phagosomal contenente la gp91phox e p22phox subunità, e insieme alle azioni di Rac1/2, formano un enzima di NADPH ossidasi completamente funzionale e complesso. L'ossidasi di NADPH assemblato allora utilizza NADPH per ridurre l'ossigeno a superossido all'interno del vacuolo phagosomal. Gli anioni superossido possono direttamente causare danni o essere dismutated in perossido di idrogeno. Perossido di idrogeno e del superossido può reagire con altre molecole per generare i radicali ossidrile altamente reattivo. Danno è mediato dalla reazione di questi ROS con cluster ferro-zolfo sulle proteine o provocando ossidazione del DNA, infine conducendo alla limitato metabolismo microbico o morte del microbo⁵. L'importanza dell'enzima NADPH ossidasi complessa e ROS, prodotte durante lo scoppio respiratorio è illustrata clinicamente in pazienti con malattia granulomatosa cronica (CGD)^{7,8,9, 10}. gli individui con CGD possiedono mutazioni in gp91phox, risultante in una mancanza di produzione di ROS e suscettibilità alle infezioni ricorrenti con batteri e funghi che di solito non sono una preoccupazione con individui immunocompetent. Pertanto, se studiare ossidativo stress, segnalazione redox o difesa ospite, essere in grado di misurare la produzione di ROS in tempo reale è uno sforzo utile.

Analisi multiple sono state utilizzate per la produzione di ROS di misura o i risultati di stress ossidativo^11,12,13. Tra questi, uno dei più utilizzati è la sonda fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetato (₂DCFH -DA)¹⁴. Questa molecola è incolore e lipofilico. Diffusione di DCFH₂-DA attraverso la membrana cellulare permette di essere agito da esterasi intracellulari, che si deacetylates in DCFH_2, rendendolo cellulare impermeabile. Le azioni di più tipi di ROS (perossido di idrogeno, peroxynitrite, i radicali ossidrili, ossido nitrico e perossi radicali) su DCFH₂ si ossidano in DCF che è fluorescente (segnalati Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e può essere rilevato tramite un flusso citometro dotato di un filtro standard impostato per fluoresceina (canale FL1). Superossido non reagisce fortemente con DCFH₂ ma può reagire con un'altra sonda diidroetidio (DHE) per produrre il prodotto fluorescente 2-hydroxyethidium (così come altri prodotti di ossidazione di superossido-indipendente fluorescente)¹⁵. I prodotti fluorescenti di ossidazione DHE possono essere rilevati utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 518 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 605 nm (canale FL2). Anche se relativamente semplice da usare, l'utilizzo di queste sonde per il rilevamento di ROS richiede la conoscenza dei loro limiti e attenta incorporazione di macchiatura procedure e controlli nel dosaggio specifico viene eseguito al fine di avere validi sperimentale risultati e conclusioni. Il protocollo riportato di seguito viene illustrato l'utilizzo di un kit disponibile in commercio che impiegano questi 2 sonde progettate per misurare il ROS tramite flusso cytometry. Abbiamo macchia innescati derivate da midollo osseo macrofagi con queste sonde e indurre la produzione di ROS attraverso FcγR cross-linking. Presentiamo dati rappresentativi ottenuti usando questo protocollo e sottolineare le opportune precauzioni che devono essere intraprese per la sperimentazione di successo.

Protocollo

Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale Animal Care e uso (IACUC) della Università della Florida centrale.

1. generazione del midollo osseo derivato macrofagi (BMDMs)

1. Preparazione di terreni di coltura
   1. Preparare il supporto di base D10F: A di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES) e β-mercaptoetanolo 0,05 mM.
      Nota: Anche se è meglio usare fresco D10F media, D10F base media può essere preparato fino a due settimane in anticipo per essere utilizzato per esperimenti multipli entro una settimana. Per un mouse, circa 175 mL di D10F base media è necessaria (25 mL per svuotare le ossa) e 150 mL per rendere macrofago differenziazione media
   2. Preparare il supporto di crescita LADMAC: minimo essenziale medio a Eagle (EMEM), aggiungere inattivato con calore 10% FBS e 2 mM L-glutammina. Preparare il fresco di media, il giorno che si prevede di iniziare le vostre culture.
      Nota: Un litro di media di sviluppo LADMAC si tradurrà in circa (19) aliquote di 50 mL di media LADMAC-condizionati.
   3. Preparare il completo supporto di DMEM: DMEM, aggiungere inattivato con calore 10% FBS e 1 x antibiotico antimicotico. Preparare il fresco di media, il giorno che bmdms saranno raccolte.
      Nota: Per un mouse, circa 100 mL di terreno completo DMEM sarà richiesto. Questo include i supporti utilizzati per le celle di adescamento.
2. Preparazione del medium condizionato LADMAC
   1. Crescere le cellule LADMAC alla confluenza in un piatto di 10 cm utilizzando 10 mL di mezzi di sviluppo LADMAC (definito al punto 1.1.2). Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO_2.
   2. Al confluency, staccare le cellule erogando con forza media sopra le cellule. Cellule di passaggio aggiungendo 1 mL di cellule indipendente in boccette di T-175 contenente 100 mL di coltura LADMAC. Incubare le cellule fino a quando è completamente confluenti a 37 ° C, 5% CO₂ (circa una settimana). In questo modo, un piatto di 10 cm può produrre palloni di dieci T-175 o circa 1 L di media condizionati.
   3. Una volta che le cellule sono pronte, raccogliere i media condizionati e centrifugare a 350 x g per 5 min agglomerare le cellule indesiderate. Filtrare i surnatanti raccolti attraverso un filtro di 0,2 mm e conservare 50ml aliquote a-80 ° C. Aliquote dei media LADMAC-condizionato possono essere mantenute a-80 ° C per mesi con una minima perdita di attività.
      Nota: Se sono previsti grandi esperimenti, preparare grandi lotti di media LADMAC-condizionato allo stesso tempo per garantire la coerenza. Se questo non è possibile, utilizzare aliquote derivate dallo stesso batch o sacco di media LADMAC-condizionati per ogni esperimento.
3. Preparazione del midollo osseo derivato macrofagi
   1. Il giorno dell'esperimento, è necessario preparare fresco macrofago differenziazione supporti aggiungendo 25% di media LADMAC condizionata in precedentemente preparato D10F mezzi di comunicazione (1 parte LADMAC condizionata in 3 parti D10F). Non preparare in anticipo questo media! Solo preparare tanto mezzi come necessario per la cultura BMDM.
   2. Giorno 1: isolare cellule del midollo osseo del topo secondo il protocollo descritto in precedenza¹⁶ con una modifica per irrigare il midollo osseo dai femori e tibie utilizzando supporti di base D10F. Utilizzare 2,5 mL di D10F media per svuotare ogni estremità delle ossa (4). Lavare le cellule del midollo osseo direttamente in un colino di cellula pre-bagnato 40 mm posizionato sopra un tubo da 50 mL. I rimanenti media (~ 5 mL) può essere utilizzati per risciacquare il filtro cella.
   3. Centrifugare raccolti del midollo osseo cellule a 350 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere le cellule in un totale di 30 mL di mezzi di differenziazione dei macrofagi (per topo).
   4. Preparare ed etichettare piastre di Petri sterile 10cm (6). Piastra 5 mL di mezzi di differenziazione del macrofago in ciascuno nella capsula di Petri. Aliquotare 5 mL di sedimento del midollo osseo cellule nei media di differenziazione del macrofago in ogni capsula di Petri per un volume totale di 10 mL per ogni piatto. Incubare per 5 giorni a 37 ° C, 5% CO_2.
   5. Giorno 5: aspirare media dalle cellule. Lavare una volta con 1-2 mL di PBS e aggiungere 10 mL di media di differenziazione del macrofago preparati al momento. Incubare per altri 3 giorni.
   6. Giorno 8: Procedere alla raccolta BMDMs, come descritto di seguito.

2. raccolta, semina e l'innesco di BMDMs

1. Dopo 7 giorni di crescita il BMDMs dei media di differenziazione del macrofago, eliminare il surnatante. Lavare i macrofagi aderenti una volta con 1-2 mL di PBS. Aspirare il PBS.
2. Dispensare 1 mL di 0,25% tripsina-EDTA in ogni macrofago piastra e lasciarli nell'incubatore 37 ° C per 5-10 minuti con frequente maschiatura per staccare le cellule. Dissociare tripsinizzati macrofagi pipettando su e giù per mezzo di una pipetta P1000 e raccogliere macrofagi in provette da 50 mL contenente 10-15 mL di multimediale DMEM completo. Lavare la piastra con i media DMEM completi ulteriori 2 mL per raccogliere eventuali restanti macrofagi.
   Attenzione: Non lasciare i macrofagi in tripsina per più di 10 min.
3. Centrifugare le provette 50ml a 350 x g per 5 min, scartare il surnatante. Delicatamente dissociare il pellet e risospendere le cellule in 10 mL di multimediale DMEM completo. Macrofagi di conteggio utilizzando un emocitometro in presenza di una vitalità tingono come trypan blu come segue:
   1. Per esempio, mix 90 µ l di Trypan blu con 10 µ l di cellule per un 01:10 diluizione.
   2. Di questa miscela, caricare 10 µ l in un emocitometro e contare la piazza centrale (griglia 5 x 5). Il conteggio totale delle cellule = conteggio x 10⁴ x volume (10) x fattore di diluizione (10 mL).
4. Regolare la sospensione cellulare per essere 1 milione/mL in completa DMEM media e piastra 4 mL di questa sospensione cellulare in ogni piatto di 6 cm.
   Nota: Un minimo di 3 piastre è richiesto per ogni esperimento. Un piatto di cellule sarà sinistra non stimolato, una seconda serie di cellule sarà stimolata attraverso il cross-linking di FcγRs e il terzo piatto di cellule verrà utilizzato per tutte le ulteriori controlli di flusso cytometric e sperimentale.
5. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO₂.
6. Il giorno seguente, aspirare il supernatante, lavare le cellule una volta con 1-2 mL di PBS. Aggiungere 4 mL di completo supporto contenente il mouse IFN-γ di 100 ng/mL per ogni piatto. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO₂.
7. Se lo si desidera, è possibile prendere un'aliquota delle cellule per valutare la generazione appropriata di BMDMs tramite flusso cytometry. Utilizzare 1 x 10⁶ cellule per test e preparare provette di polistirene FACs per le seguenti condizioni: controllo di isotipo, tinto con F4/80 (o in alternativa, tinto con CD11b).
8. Preparare il flusso cytometry macchiatura buffer aggiungendo 0,1% FBS in PBS 1X. Utilizzare solo questa quantità di FBS per non annullare gli effetti della deprivazione di siero nei passaggi successivi.
9. Aliquotare 1 x 10⁶ cellule per provetta e centrifugare a 750 x g per 5 min.
10. Lavare una volta di decantazione o aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 2 mL di buffer di citometria a flusso. Centrifuga a 750 x g per 5 min.
11. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 100 µ l di citometria a flusso macchiatura buffer. Aggiungere 1 µ l di anticorpo anti-CD16/32 Fc blocco ad ogni provetta. Incubare in ghiaccio per 5 min.
12. Senza lavaggio, aggiungere 2 µ l di anti-topo di FITC F4/80 o 1 µ l di anticorpo APC anti-topo CD11b i tubi "macchiati" e una quantità simile dell'anticorpo di controllo isotipo corrispondente ai tubi "isotype". Incubare in ghiaccio, al buio, per 30 min.
13. Lavare le cellule con l'aggiunta di 2 mL di PBS direttamente alle cellule. Centrifuga a 750 x g per 5 min.
14. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 150 µ l di PBS.
15. Acquisire campioni su un citometro a flusso utilizzando una condizione di arresto di 100 µ l o 10.000 eventi sul cancello di interesse e garantire quella FSC, SSC, FL1 (anti-topo di FITC F4/80) o FL4 (anti-topo APC CD11b) canali sono selezionati per i parametri da analizzare.
16. Utilizzando il software di citometria a flusso, aprire un complotto di dot per FSC (sull'asse x) vs SSC (sull'asse y) e disegnare un cancello intorno alle celle di interesse, escluse le cellule morte e detriti (le cellule morte e detriti sono eventi molto più piccoli rispetto alla popolazione delle cellule principali e appaiono sul lowe r a sinistra della trama).
17. Gating sulle cellule di interesse, aprire un grafico istogramma con FL1 (anti-topo di FITC F4/80) o FL4 (anti-topo di APC CD11b) sull'asse x.
18. Eseguire l'esempio di "isotype". Generare un cancello di marcatore, in modo che la maggioranza degli eventi di esempio "isotype" si trovano a sinistra del cancello (< 1% positivo). Applicare questo modello per il file di esempio macchiato.
19. Eseguire l'esempio "macchiato". Comporterà la generazione di successo di BMDMs > 95% espressione di FITC anti-topo F4/80 APC anti-mouse o CD11b (Figura 1A), mentre le condizioni di coltura non corretto possono provocare generazione sub-ottimale dei macrofagi (Figura 1B).
    Nota: Se la generazione BMDMs da genotipi multipli, prendere nota dell'espressione di questi indicatori per ogni batch di BMDM generato, nel caso che questo possa essere adito all'esclusione di un campione da analisi quando viene valutata la generazione di ROS in risposta allo stimolo.

3. reagenti e materiale di preparazione per la misura del ROS

1. Ricostituire il reagente di rilevamento liofilizzato lo sforzo ossidativo in 60 µ l di DMF anidro per produrre una soluzione stock di 5 mM. Mescolare delicatamente prima dell'uso.
   Nota: Si afferma nel manuale del kit di ROS-ID che la shelf life del reagente ricostituito è circa 1 settimana a-20 ° C. Aliquotare il reagente immediatamente dopo la ricostituzione in piccole fiale di prova di luce riduce al minimo l'ossidazione e massimizza la shelf life a-20 ° C.
2. Ricostituire il reagente di rilevamento liofilizzato superossido in 60 µ l di DMF anidro per produrre una soluzione stock di 5 mM. Mescolare delicatamente prima dell'uso.
   Attenzione: come indicato nel manuale del kit, trattare entrambi i reagenti di rilevamento come possibili agenti mutageni, gestire ciascuna con cura e smaltire correttamente.
3. Ricostituire l'induttore ROS (piocianina) in 20 µ l di DMF anidro per produrre una soluzione stock di 50 mM.
4. Ricostituire l'inibitore di ROS (N-acetil-L-cisteina) in 123 µ l di acqua deionizzata per produrre una concentrazione di stock di 0,5 M.
5. Etichetta 5 mL tondo polistirolo tubi (tubi di citometria a flusso) con i controlli sperimentali e le condizioni. (Vedi 4. Condizioni di test e controlli)
6. Preparare basso del siero DMEM (no rosso fenolo) aggiungendo 0,1% FBS di DMEM privo di rosso fenolo.
7. Aliquota dell'anticorpo anti-BSA in piccole aliquote (a seconda dell'utilizzo) e conservarli a-80 ° C.
8. Preparare la soluzione di riserva di 100 mg/mL BSA in HBSS (soluzione salina equilibrata Hanks') o PBS. Aliquota in 100 µ l aliquote e conservare a-20 ° C.
9. Preparare una soluzione di 2 x delle sonde ROS (2x di soluzione della sonda): per ogni 10 mL di siero basso DMEM, aggiungere 4 µ l di reagente di rivelazione di stress ossidativo (colorante verde) e 4 µ l di reagente di rivelazione di superossido (tintura arancia).
10. Preparare 2 x soluzioni sonda contenente solo reagente di rivelazione di stress ossidativo (2x di soluzione della sonda, solo verde), o contenenti solo superossido reagente di rivelazione (2x di soluzione della sonda, arancio solo). Preparare solo la quantità di reagente necessario per l'esperimento e sempre preparare la soluzione 2x immediatamente prima dell'uso.
    Nota: Per preparare volumi più piccoli di 2 x soluzione di rilevamento, utilizzare un intermedio 01:10 diluizione dei reagenti di rilevazione sia verde e arancione prima della diluizione finale in DMEM. Ad esempio, per preparare 1 mL di una soluzione di rilevamento di 2x, diluire 1 µ l di ciascuna sonda in 9 µ l di DMEM (01:10 intermedio della diluizione). Diluire 4 µ l di questa diluizione in 1 mL di DMEM intermedio di 01:10.

4. analizzare le condizioni e i controlli

1. Includono i seguenti controlli sperimentali per compensazione cytometric di flusso per ogni esperimento:
   ) le cellule non macchiate e non stimolate.
   b) cellule colorato solo con il reagente di rivelazione di stress ossidativo (reagente di verde) e trattate con induttore ROS.
   c) cellule colorato solo con il reagente di rivelazione di superossido (reagente di arancia) e trattate con induttore ROS.
2. Per ogni mouse o replicare biologico, sono le seguenti 6 condizioni:
   a) non macchiate e non stimolate le cellule
   b) cellule macchiate e non stimolate
   c) macchiato le cellule trattate con induttore positivo
   d) macchiato le cellule trattate con induttore positivo e inibitore ROS
   e) macchiato le cellule attivate attraverso il cross-linking di FcγR
   f) macchiate cellule attivate attraverso FcγR cross-linking e trattati con l'inibitore ROS
3. Calcolare la quantità di soluzione della sonda necessari: 2x basato sul numero di topi e condizioni (200 µ l di soluzione della sonda 2x saranno utilizzati per ogni condizione che richiedono la macchiatura).
   Nota: Per un'analisi usando 6 topi, saranno necessari 5 condizioni che richiedono la macchiatura con le sonde per topo. Questo porta il numero totale delle condizioni a 30. Così, la quantità totale di soluzione della sonda x 2 necessario è almeno 6 mL (30 * 200 µ l).

5. cella preparazione

1. Dopo priming i macrofagi durante la notte, aspirare il supernatante. Lavare le cellule una volta con PBS.
2. Siero di fame le cellule sostituendo media con lo stesso volume di basso del siero DMEM. Per ogni mouse, una piastra sarà trattata con anti-BSA IgG₁ mentre siero di fame, mentre l'altro sarà lasciato non trattato. Aggiungere solo basso del siero DMEM a piastre non trattati. Aggiungere basso del siero DMEM contenente 2,5 µ g/mL di murino di IgG anti-BSA₁ a piastre trattate.
   Nota: Una piastra supplementare non trattata è necessaria per ogni esperimento per i controlli di compensazione cytometric di flusso.
3. Incubare le piastre per 4 h a 37 ° C, 5% CO₂.
4. Dopo il siero di fame, raccogliere le cellule raschiando delicato o utilizzando 0,2 mM EDTA in PBS. Raccoglierli in 5ml con etichetta fondo tubi rotondi e centrifuga li a 750 x g per 5 min, tenere traccia di cui le cellule sono state trattate con murino di IgG anti-BSA₁.
5. Lavare il pellet cellulare una volta con 2 mL di PBS per sbarazzarsi di qualsiasi residuo anti-BSA da cellule trattate.
6. Risospendere le cellule in 600 µ l di siero basso DMEM.
7. Dalla sospensione di eritrociti 600 µ l, aliquotare 200 µ l nei 5 mL pre-etichettati giro tubi del fondo come segue:
   1. Da cellule non trattate, prendere 200 µ l per tubi etichettati "non stimolate", 200 µ l per tubi etichettati "positivo dell'induttore" e 200 µ l per tubi etichettati "induttore positivo + inibitore"
   2. Dalle IgG anti-BSA₁ cellule trattate, prendere 200 µ l per tubi etichettati "FcγR reticolazione/FcγR XL" e 200 µ l per tubi etichettati "FcγR XL + inibitore"
   3. Dalle cellule non trattate per essere utilizzato per controlli di compensazione, prendere 200 µ l per il tubo etichettato "senza macchia non stimolate", 200 µ l per il "verde + induttore" controllo e 200 µ l per "arancio + induttore" controllo.
      Nota: Se le celle da 5.7.1 e 5.7.3 sono derivate dal mouse stesso, le cellule stesse "senza macchia non stimolate" possono essere utilizzate per il controllo sperimentale e compensazione. Se non, un ulteriore 200 µ l di cellule saranno necessari per un controllo sperimentale "senza macchia non stimolate" per una).
8. Mantenere le provette su ghiaccio fino a colorazione e stimolazione. Durante deprivazione di siero e l'associazione di IgG_1, preparare le sonde, stimoli specifici e induttori come descritto di seguito.
   Nota: Se si esegue il test per la prima volta, se nessun modello è disponibile, o non c'è alcun risarcimento dopo--fatto disponibile sul citometro a flusso e software corrispondente, di stimolare e macchia controlli di compensazione ed eseguire questi sul citofluorimetro per eseguire Aggiunta di prima di compensazione manuale di stimoli per campioni sperimentali.

6. esecuzione del saggio

1. Preparare soluzione positiva induttore: 2x diluendo la piocianina 1: 100 in 2 x soluzione della sonda (preparata al punto 3.9) per ottenere una concentrazione di 2 x di 500 µM di piocianina (concentrazione finale sarà 250 µM). Inoltre, diluire 1: 100 piocianina in ciascuno dei "2 x soluzione della sonda, verde solo" e "soluzione della sonda x 2, orange solo" provette preparate in 3.10.
   Nota: Entrambe le condizioni etichettate con "induttore di positivo" e "induttore positivo + inibitore" saranno trattate con l'induttore positivo. Pianificare di conseguenza quando si calcola la quantità di soluzione di induttore positivo x 2 per preparare. Ad esempio: se si esegue il test con 3 topi, 6 condizioni (3 * 2) saranno trattate con induttore positivo, quindi preparare 6 * 200 µ l = 1,2 mL di soluzione positiva induttore: 2x.
2. Preparare una soluzione di BSA di 2x diluendo la soluzione di riserva di BSA in 2x soluzione della sonda per ottenere una concentrazione di 2 µ g/mL (concentrazione finale sarà 1 µ g/mL).
   Nota: Entrambe le condizioni etichettate con "FcγR XL" e "FcγR XL + inibitore" saranno trattate con la soluzione di BSA di 2x. Pianificare di conseguenza quando si calcola la quantità di soluzione da preparare. Ad esempio: se il dosaggio utilizzando 3 topi, 6 (3 * 2) condizioni saranno trattate con soluzione di BSA e così 6 * 200 µ l o 1,2 mL di soluzione di BSA: 2x saranno necessari.
3. Prima di iniziare la stimolazione specifica (FcγR reticolazione), assicurarsi che tutti i reagenti e le cellule sono pronte. Posizionare i tubi sul ghiaccio nell'ordine che saranno stimolati.
4. Per citometri a flusso con un autocampionatore, prendere nota del tempo che il citometro prende per analizzare un campione e passare a quella successiva, inclusi qualsiasi sonda fasi (ad esempio 3,5 min) di lavaggio e miscelazione.
   Nota: la sincronizzazione è molto critica per questo test. In ordine per ogni condizione di essere ben controllata, la stimolazione deve essere effettuato per l'ora esatta (30 min) per ogni condizione. Stimolare le cellule in ordine e incorporano il tempo di ritardo tra acquisizione di campione dal citometro a flusso. Ad esempio, se il tempo necessario per il citometro di analizzare un campione e passare a quella successiva è 3,5 min, stimolano le cellule nell'ordine che essi saranno analizzati ogni 3,5 min.
5. Se si esegue la compensazione manuale a questo punto, stimolare tubi di controllo da utilizzare per la compensazione (passo 5.7.3). Aggiungere 200 µ l di "2x soluzione della sonda, verde solo" contenente induttore (da 6,1) nelle provette contrassegnate "verde + induttore" (passaggio 5.7.3). Aggiungere 200 µ l di "2 x soluzione della sonda, arancio solo" contenente induttore (punto 6.1) nelle provette contrassegnate "orange + induttore" (passaggio 5.7.3).
6. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C, 5% CO₂ nel buio.
7. Utilizzando il software di citometria a flusso, generare ed etichettare 3 file di esempio per il controllo "senza macchia, non trattata", "verde + induttore", e "orange + induttore" campioni, avendo cura di indicare i canali/parametri per essere analizzato (FSC, SSC, FL1, FL2) e desiderato fermata condizioni (100 µ l, 3 min, ecc.). Generare ed etichettare un simile insieme di file per campioni sperimentali.
8. Eseguire l'esempio "senza macchia, non trattati". Aprire un complotto di dot per FSC (sull'asse x) vs SSC (sull'asse y) e disegnare un cancello intorno alle celle di interesse, escluse le cellule morte e detriti (le cellule morte e detriti sono eventi molto più piccoli rispetto alla popolazione delle cellule principali e vengono visualizzati nella parte inferiore sinistra della trama).
9. Utilizzando questo cancello di "cellule", aprire un altro appezzamento di puntino di FL1 (asse x) vs FL2 (asse y). Disegnare un cancello quadrante iniziale. Regolare i cancelli del quadrante in modo che gli eventi vengono visualizzati sul quadrante inferiore sinistro della trama FL1 vs FL2.
10. Eseguire l'esempio di "verde + induttore". Regolare la tensione in modo che gli eventi vengano visualizzati su quadranti inferiori destro e sinistro della trama FL1 vs FL2. Applicare questa matrice di incremento retributivo per tutti 3 file di esempio.
11. Eseguire l'esempio di "orange + induttore". Regolare la tensione in modo che gli eventi vengano visualizzati su superiore e inferiore sinistra quadranti della trama FL1 vs FL2. Applicare questa matrice di incremento retributivo per tutti 3 file di esempio.
12. Controllare ogni file di compensazione e assicurarsi che "senza macchia, non trattata" eventi appaiono sul quadrante inferiore sinistro, eventi "verde + induttore" appaiono sui quadranti inferiori destro e sinistro, e "orange + induttore" eventi vengono visualizzati su superiore e inferiore sinistra quadranti del vs FL1 FL2 trama. Applicazione della matrice di compensazione di tutti i file campione sperimentale.
    1. Assicurare che una compensazione adeguata viene applicata a tutti i file di esempio di controllo prima di applicare la matrice di incremento retributivo per tutti i file campione sperimentale. Fare riferimento alla Figura 2 per dati rappresentativi risultati non compensata e campioni correttamente compensati.
       Nota: Molti citometri designano FL1 come canale di FITC/GFP (eccitati dal laser blu 488 nm e rilevato con un set di filtri 530/30) e FL2 come il canale PE standard (eccitati dal laser blu 488 nm e rilevato con un set di filtri di 585/40) standard. Usiamo questa stessa convenzione ma attenzione nuovi utenti di citometria a flusso per consultarsi con loro manager di nucleo di citometria a flusso per garantire che loro citometro è configurato allo stesso modo e che i canali appropriati vengono utilizzati per rilevare queste sonde. A seconda del modello del citometro a flusso e software di accompagnamento, è possibile eseguire la compensazione prima o dopo i campioni sono stati acquisiti. Se è possibile la compensazione di dopo--fatto, il passaggio di compensazione può essere eseguito dopo tutti i campioni sperimentali sono stato acquistati dal citometro. Per citometri con una gamma dinamica, dove non sono necessarie regolazioni di tensione PMT, un esperimento di compensazione può essere eseguito anche su un giorno separata e può essere salvato il modello sperimentale (tra cui la matrice di compensazione) per ridurre il tempo necessario per eseguire compensazione manuale.
13. Una volta che è stata eseguita la compensazione manuale e si ottiene un modello sperimentale, iniziare il trattamento di campioni sperimentali. Prima di trattare con induttore positivo o la stimolazione di cellule FcγR, contrassegnare quali tubi fatti inibitore ROS. Trattare queste cellule con il ROS inibitore almeno 30 min prima del positiva induttore o stimolazione FcγR.
14. Per aggiungere l'inibitore ROS, preparare una concentrazione finale di 5 mM con l'aggiunta di 1 µ l di inibitore a 200 µ l di sedimento cellule (senza anti-BSA IgG₁).
15. Trattare le cellule con stimolo (o induttore positivo) e le celle di carico con le sonde ROS come segue:
    1. Per cellule non stimolate: aggiungere 200 µ l di soluzione della sonda in assenza di qualsiasi stimolo: 2x per la 200 µ l di sospensione cellulare etichettati "macchiati, non stimolata".
    2. Per i controlli positivi: aggiungere 200 µ l di soluzione positiva induttore (preparata al punto 6.1): 2x a 200 µ l di sospensione cellulare etichettati "induttore di positivo" o "induttore positivo + inibitore".
    3. Per le cellule stimolate da FcγR cross-linking (stimolo specifico): aggiungere 200 µ l di soluzione di BSA (preparata al punto 6.2): 2x a 200 µ l di sospensione cellulare etichettati "Fcγr XL" o "FcγR XL + inibitore".
       Nota: Ricordarsi di inserire il tempo di ritardo tra analisi dei campioni con l'aggiunta di stimolo ogni min x dove x è il tempo di ritardo tra acquisizione di un campione e l'altro.
16. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C, 5% CO₂ nel buio. Analizzare i campioni in ordine che sono stati stimolati con un citometro a flusso dotato con un autocampionatore. Utilizzare i modelli di analisi generati durante la procedura di compensazione iniziale. Non lavare le cellule prima dell'analisi.

7. flusso cytometry dati analisi e risultati attesi

1. All'interno del software di citometria a flusso, aprire i file di analisi generato in precedenza per i campioni sperimentali (modelli sono stati generati in passi 6.7-6.12 e campioni sono stati analizzati nel passaggio 6,16). Assicurarsi che la matrice di compensazione da eseguire la compensazione manuale è stato correttamente applicata ai campioni sperimentali.
   Nota: Per citometri a flusso e flusso cytometry software capace di compensazione dopo il fatto, se la matrice di compensazione non è stato precedentemente applicata ai file campione sperimentale, applicarlo a questo punto.
2. Simile alla verifica corretta compensazione manuale, garantire che i controlli all'interno di campioni sperimentali si comportano come previsto.
   1. Garantire che gli eventi "senza macchia, non trattati" apparirà sul quadrante inferiore sinistro della trama FL1 vs FL2, che gli eventi di "positivo induttore" mostrano aumento della fluorescenza in alto a sinistra, superiore destra e inferiore destra quadranti della FL1 vs FL2 trama e che" induttore positivo + inibitore ROS"eventi mostrano una riduzione della fluorescenza in alto a sinistra, superiore destra e inferiore destra quadranti della FL1 vs FL2 trama rispetto alla fluorescenza osservata con il campione"induttore positivo".
   2. Se i controlli all'interno di campioni sperimentali non mostrano alcun aumento della fluorescenza, verifica che tutte le fasi di analisi sono state eseguite, verificare la generazione appropriato e l'innesco dei macrofagi derivate da midollo osseo (2.7-2.19) e ripetere l'esperimento. Se i controlli all'interno di campioni sperimentali mostrano le tendenze previste, procedere per analizzare campioni sperimentali stimolati attraverso la FcγR (Figura 3A).
3. Verificare che lo stimolo di FcγR specifiche funzioni in modo appropriato. Eseguire gli esempi seguenti da un mouse C57BL/6J WT: "senza macchia, stimolate", "macchiato, stimolate", "macchiato, stimolati attraverso la FcγR", e "macchiato, stimolato attraverso il FcγR + ROS inibitore". Questi corrispondono ai campioni 4.2 a, 4.2 b, 4.2 e e 4.2f nella sezione 4, rispettivamente.
   1. Garantire che gli eventi "senza macchia, stimolate" apparirà sul quadrante inferiore sinistro della trama FL1 vs FL2, che eventi "macchiato, stimolate" apparirà anche il quadrante inferiore sinistro della trama FL1 vs FL2, che eventi "macchiato, stimolati attraverso la FcγR" Visualizza aumento della fluorescenza in alto a sinistra, superiore destra e inferiore destra quadranti della FL1 vs FL2 trama e che "macchiato, stimolato attraverso il FcγR + ROS inibitore" eventi mostrerà è diminuito di fluorescenza nell'alto a sinistra, in alto a destra e in basso a destra quadranti della FL1 vs FL2 trama rispetto al campione "macchiati, stimolati attraverso la FcγR" (Figura 3A).
   2. Se queste aspettative non sono soddisfatte, ad esempio, l'esempio di "macchiati, stimolati attraverso la FcγR" Mostra minimo o nessun aumento della fluorescenza rispetto al campione "macchiati, non stimolate", o il campione "macchiati, non stimolate" già Mostra marcatamente i livelli aumentati di fluorescenza rispetto al campione "senza macchia, non stimolate", verifica che tutte le fasi di analisi sono state eseguite correttamente, verificare la generazione appropriato, adescamento e al trattamento delle BMDMs (2.7-2.19) e ripetere l'esperimento. Se queste aspettative sono soddisfatte, procedere all'analisi del resto dei campioni sperimentali.
      Nota: Cellule che producono ROS che reagiscono con la sonda verde (perossido di idrogeno, peroxynitrite, i radicali ossidrili, ossido nitrico, perossi radicali, ecc.) apparirà nella parte superiore destra e inferiore destra quadranti di un log FL1 (asse x) contro un log FL2 trama dot (asse y). Cellule che producono ROS che reagiscono con la sonda arancia (in gran parte ma non esclusivamente superossido) apparirà nei due quadranti superiori di un log FL1 (asse x) contro un log FL2 trama dot (asse y).
4. Generare i singoli istogrammi, gated su celle di interesse, per l'analisi di fluorescenza FL1 e FL2. Usando i campioni "senza macchia, non stimolati", generare un indicatore di istogramma, tale che tutti gli eventi "senza macchia, non stimolati" vengono visualizzati a sinistra di questo marcatore. Questa trama si applicano con il marcatore al resto dei campioni sperimentali (Figura 3B).
5. Presentare i risultati dell'esperimento come la percentuale di cellule positive per ciascuna delle sonde ROS o mostrando l'intensità media di fluorescenza (MFI) dei campioni stimolati contro controllo (Figura 3).

8. superficie cellule macchiando in combinazione con l'analisi cytometric di flusso di produzione di ROS (opzionale)

Nota: Questo passaggio fornisce un protocollo per la macchiatura di macrofagi con un marcatore di superficie cellulare prima della stimolazione della misura FcγR e ROS. Questo può essere utile per valutare la produzione di ROS in popolazioni di cellule miste. È importante scegliere un anticorpo per indicatore superficie coniugato a un fluor appropriato che non interferisce con la fluorescenza dai reagenti di rilevazione stress o superossido ossidativi del macrofago. In questo protocollo, viene utilizzato un anticorpo per mouse che F4/80 coniugato di Alexa fluor 647.

1. Generare BMDMs, raccolto e prima di loro come precedentemente descritto (sezioni 1 e 2).
   Nota: Un minimo di tre lastre di 6 cm sono necessari al fine di eseguire tutti i controlli sperimentali e condizioni come descritto di seguito. Una piastra sarà trattata con anti-BSA IgG₁ mentre il siero di fame mentre le altre due piastre saranno lasciate non trattato.
   1. Include 4 controlli sperimentali che saranno utilizzati per la compensazione di flusso cytometric (ogni esperimento):
      ) le cellule non macchiate e non stimolate.
      b) cellule trattate con il reagente di rivelazione di stress ossidativo (reagente di verde) e induttore ROS.
      c) cellule trattate con il reagente di rivelazione di superossido (reagente di arancia) e induttore ROS.
      d) le cellule colorate solo con anti-topo coniugata F4/80 a Alexa 647.
   2. Per ogni mouse o replicare biologico, sono le seguenti 3 condizioni:
      a) macchiato con F4/80 e sinistra non stimolate
      b) macchiato con F4/80 e attivato attraverso il FcγR
      c) macchiato con F4/80 e attivato attraverso il FcγR e trattati con l'inibitore ROS
2. Dopo priming i macrofagi durante la notte, aspirare il supernatante. Lavare le cellule una volta con 1-2 mL di PBS. Siero di fame le cellule sostituendo i media con lo stesso volume di basso del siero DMEM. Per ogni mouse, una piastra sarà trattata con anti-BSA IgG₁ mentre siero morendo di fame, mentre le altre due piastre sarà essere trattata. Incubare le piastre per 4 h a 37 ° C, 5% CO₂.
3. Dopo il siero di fame, raccogliere le cellule raschiando delicato o utilizzando 0,2 mM EDTA in PBS. Raccogliere ogni piatto in 5ml con etichetta fondo tubi rotondi e centrifuga li a 750 x g per 5 min, tenere traccia di cui le cellule sono state trattate con murino di IgG anti-BSA₁.
4. Lavare il pellet cellulare una volta con 1-2 mL di PBS per sbarazzarsi di qualsiasi residuo anti-BSA da cellule trattate.
5. Risospendere uno dei pellet cellulare dalla piastra che non fatto di IgG anti-BSA₁ a 600 µ l di siero basso DMEM. Queste cellule saranno non essere sottoposti a marcatura di superficie delle cellule. Usare questi per controlli di compensazione. Aliquot 200 µ l di sospensione cellulare in (3) 5 mL rotondo fondo tubi etichettati) senza macchia, non stimolate b) verde stress ossidativo reagente + induttore ROS, reagente di rivelazione di superossido c) arancione + induttore ROS.
6. Risospendere uno della cella pellet dalla piastra che non fatto anti-BSA IgG_1, a 300 µ l di citometria a flusso macchiatura buffer (PBS + 0.1% FBS). Aliquotare e 100 µ l di sospensione cellulare in (2) 5 mL tondo tubi del fondo per la macchiatura con Alexa 647 anti-topo F4/80.
7. Risospendere il pellet di cellule dalla piastra che ha ricevuto di IgG anti-BSA₁ a 300 µ l di tampone macchiatura cytometry di flusso. Aliquotare e 100 µ l di sospensione cellulare in (2) 5 mL tondo tubi del fondo per la macchiatura con Alexa 647 anti-topo F4/80.
8. Macchia le cellule, che sono state aliquotate in 8.6 e 8.7, con 5 µ l di Alexa 647 anti-topo F4/80 per 30 min in ghiaccio, al buio.
9. Dopo la colorazione, lavare le cellule con l'aggiunta di 2 mL di PBS e centrifugare a 750 x g, aspirare il supernatante e Risospendere ciascun tubo in 200 µ l di siero basso DMEM senza rosso fenolo. Mettere da parte un tubo non trattato singolarmente macchiato FL4 controllo. Preparare la sonde, induttore, FcγR stimolo e inibitori ROS come indicato nei paragrafi 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 e 6.14.
   1. Per le cellule non ricevono anti-BSA IgG₁, etichettare provette con il seguente: un) nessun stimolo o induttore b) ROS.
   2. Per le cellule che hanno ricevuto anti-BSA IgG₁, etichettare con il seguente: un) Fc XL o b) Fc XL + inibitore.
10. Stimolare i campioni per essere utilizzati per la compensazione secondo i loro rispettivi trattamenti come indicato in 6.5-6.6, nell'ordine in cui verranno letti sul citofluorimetro, incorporando il tempo di ritardo tra l'acquisizione di un campione e la successiva.
11. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C, 5% CO₂ nel buio. Analizzare i campioni in ordine che sono stati stimolati con un citometro a flusso dotato con un autocampionatore.
12. Eseguire la compensazione manuale come descritto in 6.7-6.12 e analisi dei dati come descritto nella sezione 7.
13. Utilizzando il software di citometria a flusso, generare ed etichettare 4 file di esempio per il controllo "senza macchia, non trattata", "verde + induttore", "arancio + induttore" e "F4/80 macchiato" campioni, avendo cura di indicare i canali/parametri per essere analizzato (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) e le condizioni di arresto desiderata (100 µ l, 3 min, ecc.).
14. Eseguire gli esempi e generare trame dot per eseguire la compensazione manuale.
    1. Per la marcatura di superficie di cella, generare due ulteriori piazzole: FL1 (asse x) vs FL4 (asse y) e FL2 (asse x) vs FL4 (asse y). Regolare le tensioni per assicurarsi che una compensazione adeguata è applicata come mostrato nella figura 7A. Una volta che tutte le compensazioni sono stata eseguita correttamente, è possibile applicare la matrice di compensazione a tutti i file di esempio sperimentale.
15. Una volta che è stata eseguita la compensazione manuale e si ottiene un modello sperimentale, iniziare il trattamento di campioni sperimentali come indicato in 6.13-6.15.3 e acquisire campioni su un citometro a flusso, come descritto in 6.16.

Risultati

Utilizzando il protocollo delineato all'interno, vi presentiamo dati rappresentativi dimostrando rilevamento di cytometric di flusso della produzione di ROS derivando dallo stimolo di WT C57BL/6J BMDMs attraverso il FcγR. Come previsto, osserviamo i cambiamenti minimi nella fluorescenza FL1 o FL2 sopra i livelli di sfondo in cellule non stimolate (Figura 3A, Confronta vs "macchiati, non stimolate" dot "senza macchia, non stimolate" trame). Si osserva un marcato aumento nella fluorescenza FL...

Discussione

₂DCFH -DA e rilevazione basata su DHE di ROS è una tecnica ampiamente usato^14,15. Facilità d'uso e l'adattabilità di queste sonde ROS per micropiastra cinetica formati, analisi di cytometric di flusso o microscopia di fluorescenza ha contribuito alla loro popolarità. Tuttavia, nei nostri studi di funzioni FcγR-mediata del macrofago, ci non sembrano essere un protocollo standard per l'esecuzione di questo test per analisi citofluorimetrica delle ce...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BSA IgG1	Innovative Research	IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400626
Anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647	BD Biosciences	565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC	BioLegend	123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647	BioLegend	101218
beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV	Fisher	BP1600-100
C57BL/6J	Jackson labs	Stock No.000664
CM-H2DCFDA	Molecular Probes	C6827	Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE)	Molecular Probes	D11347	Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x	Corning	10-013-CV
DMEM no phenol red	Gibco	31053-028
DMF Anhydrous	Acros Organics	61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400506
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
L glutamine	Gibco	25030-081
LADMAC cells	ATCC	CRL-2420
MEM	Corning	10-010-CV
mouse IFN-g	GoldBio	1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine	EMD Milipore	106425	Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler	Acea	2060R
Pyocyanin (ROS inducer)	Cayman chemical	10009594	Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit	ENZO	ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056