Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking

Resumo

Este estudo demonstra o uso da citometria de fluxo para detectar a produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio resultantes da ativação do FcγR. Esse método pode ser usado para avaliar as mudanças no antimicrobial e redox função dos fagócitos em resposta aos complexos imunes, opsonized microorganismos ou direto FcγR cross-linking de sinalização.

Resumo

O burst oxidativo ou respiratório é usado para descrever o rápido consumo de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos fagócitos em resposta a vários estímulos imunes. ROS, gerados durante a ativação imune exerce potente atividade antimicrobiana, principalmente através da capacidade de ROS de danificar o DNA e proteínas, causando a morte de microorganismos. Ser capaz de medir a produção de ROS reproducibly e com facilidade é necessário a fim de avaliar a contribuição de vários caminhos e moléculas deste mecanismo de defesa do hospedeiro. Neste artigo, demonstramos a utilização de sondas fluorescentes e fluxo cytometry para detectar a produção de ROS. Apesar de amplamente utilizado, medição fluorescente de ROS é notoriamente problemática, especialmente com relação à medição de ROS induzida por estímulos específicos e não mitogênico. Apresentamos uma metodologia detalhada para detectar ROS gerada como resultado específico FcγR estimulação, começando com a geração de macrófagos, escorva, coloração, FcγR cross-linking e terminando com a análise de fluxo cytometric.

Introdução

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas reativas ou radicais livres que são subprodutos da respiração aeróbia (revisto em ¹). Estes incluem o anião superóxido, peróxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e íons de hidroxila, entre outros. Em condições fisiológicas normais, ROS são produzidos principalmente pelas mitocôndrias e oxidases de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e são rapidamente desintoxicados por diversas enzimas e proteínas como a superóxido dismutase e glutationa. Uma produção exagerada de ROS ou um defeito na capacidade de remover ROS pode resultar em estresse oxidativo, no qual espécies reactivas de oxigénio promovem os danos de proteínas, lipídios e DNA, levando ao estresse celular ou morte e Estados de doença patológica. No entanto, atualmente é apreciado que ROS também pode atuar como moléculas sinalizadoras (sinalização redox), e mediada por ROS modificação de várias moléculas e via intermediários pode influenciar o metabolismo celular, proliferação, sobrevivência, inflamatória sinalização e envelhecimento². Em células fagocíticas, ROS desempenha um papel essencial no fornecimento de atividade antimicrobiana durante a chamada "explosão respiratória"^1,3,4,5,6. Durante a resposta dos fagócitos a estímulos externos, componentes da oxidase NADPH complexo (p40^phox, p47^phox, p67^phox) translocar do citosol para a membrana phagosomal, que contém a gp91phox e p22phox subunidades, e juntamente com as ações do Rac1/2, formam um totalmente funcional NADPH oxidase complexo enzimático. A oxidase de NADPH montado então utiliza NADPH para reduzir o oxigênio ao superóxido dentro do vacúolo phagosomal. Ânions superóxido diretamente podem causar danos ou ser dismutated em peróxido de hidrogênio. Tanto o superóxido e o peróxido de hidrogênio podem reagir com outras moléculas para gerar radicais hidroxila altamente reativos. Dano é mediado por reação destas ROS com proteínas ferro-enxofre ou causando oxidação base de DNA, conduzindo finalmente ao metabolismo microbiano restrito ou morte do micróbio⁵. A importância da enzima oxidase NADPH complexa e ROS produzidos durante a explosão respiratória é ilustrado clinicamente em pacientes com doença granulomatosa crônica (CGD)^{7,8,9, 10}. indivíduos com CGD possuem mutações em gp91phox, resultando em uma falta de produção de ROS e susceptibilidade a infecções com bactérias e fungos que normalmente não são uma preocupação com os indivíduos imunocompetentes. Portanto, se estudar oxidativo estresse, sinalização redox ou defesa do hospedeiro, sendo capaz de medir a produção de ROS em tempo real é um esforço útil.

Vários ensaios têm sido utilizados para a produção de ROS de medida ou os resultados do stress oxidativo^11,12,13. Entre estes, um do mais amplamente utilizado é a sonda fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetato (Diniz Melo₂-DA)¹⁴. Esta molécula é lipofílico e incolor. Difusão de Diniz Melo₂-DA através da membrana celular permite a ser postas em prática por esterases intracelulares, que deacetylates-lo em Diniz Melo_2, tornando-se células impermeáveis. As ações de vários tipos de ROS (peróxido de hidrogênio, peroxinitrito, radicais hidroxila, óxido nítrico e radicais de peróxido) na Diniz Melo₂ -oxidam em DCF, que é fluorescente (relatado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e pode ser detectada usando um fluxo citômetro equipado com um filtro padrão definido para fluoresceína (FL1 canal). Superóxido pode reagir com outra sonda dihydroethidium (DHE) para produzir o produto fluorescente 2-hydroxyethidium (bem como outros produtos de oxidação de superóxido independente fluorescente)¹⁵, mas não reage fortemente com Diniz Melo₂ . Produtos de oxidação DHE fluorescentes podem ser detectados usando um comprimento de onda de excitação de 518 nm e um comprimento de onda de emissão de 605 nm (canal FL2). Embora relativamente simples de usar, a utilização de tais sondas para a deteção de ROS requer conhecimento de suas limitações e cuidadosa incorporação de coloração procedimentos e controles para o ensaio específico, sendo realizado a fim de ter válido experimental resultados e conclusões. O protocolo a seguir demonstra o uso de um kit disponível comercialmente, empregando estes 2 sondas projetadas para medir ROS por citometria de fluxo. Podemos manchar aprontados macrófagos derivados da medula óssea com estas sondas e induzir a produção de ROS através do cross-linking FcγR. Apresentamos dados representativos obtidos usando este protocolo e sublinhar as devidas precauções que devem ser empreendidas para experimentação bem sucedida.

Protocolo

O protocolo para manuseio de animal foi aprovado pelo Comitê institucional Cuidado Animal e uso de (IACUC) da Universidade da Flórida Central.

1. geração de medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs)

1. Preparação de meios de cultura
   1. Preparar a mídia de base D10F: A de Dulbecco modificado águia médio (DMEM), adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) e β-Mercaptoetanol de 0,05 mM.
      Nota: Embora seja melhor usar fresco D10F mídia, mídia de base D10F pode ser preparada até para duas semanas antecipadamente a ser usado para várias experiências dentro de uma semana. Para um rato, cerca de 175 mL de D10F base mídia é necessária (25 mL para lavar os ossos) e 150 mL para fazer meios de diferenciação do macrófago
   2. Preparar a mídia de crescimento LADMAC: mínimo essencial médio a águia (EMEM), adicionar calor 10% inactivadas FBS e 2 mM L-glutamina. Preparar o fresco da mídia, no dia em que você planeja iniciar suas culturas.
      Nota: Um litro de mídia de crescimento LADMAC resultará em aproximadamente (19) alíquotas de 50 mL de mídia LADMAC-condicionado.
   3. Preparar a mídia DMEM completa: DMEM, adicionar calor 10% inactivadas FBS e 1 x antibiótico Antimicótico. Prepare o fresco da mídia, no dia que bmdms vão ser colhidos.
      Nota: Para um rato, cerca de 100 mL de mídia completa DMEM serão necessária. Isso inclui a mídia usada para aprontar as células.
2. Preparação de LADMAC condicionado médio
   1. Desenvolvem-se células LADMAC a confluência em um prato de 10 cm, usando 10 mL de meio de crescimento LADMAC (definido em 1.1.2). Incubar as células a 37 ° C, 5% CO_2.
   2. Na confluência, desanexe células pela dispensação vigorosamente mídia sobre as células. Células de passagem, adicionando 1 mL de células destacadas em frascos de T-175 contendo 100 mL de meio de crescimento LADMAC. Incube as células até completamente confluentes a 37 ° C, 5% CO₂ (cerca de uma semana). Desta forma, um prato de 10cm pode produzir frascos de dez T-175 ou aproximadamente 1 litro de mídia condicionados.
   3. Uma vez que as células estão prontas, recolha os meios condicionados e centrifugar a 350 x g por 5 min granular células indesejáveis. Filtrar os sobrenadantes coletados através de um filtro de 0,2 mm e armazenar alíquotas de 50 mL a-80 ° C. Alíquotas de mídia LADMAC-condicionado podem ser mantidas a-80 ° C durante meses com mínima perda de atividade.
      Nota: Se grandes experiências são antecipadas, prepare grandes lotes de mídia LADMAC-condicionado ao mesmo tempo para garantir a consistência. Se isto não for possível, use alíquotas derivadas do mesmo lote ou monte de mídia LADMAC-condicionado para cada experimento.
3. Preparação da medula óssea derivada de macrófagos
   1. No dia do experimento, prepare a mídia de diferenciação do macrófago fresco adicionando 25% da mídia LADMAC condicionado em previamente preparado D10F mídia (1 parte LADMAC condicionado em 3 partes, D10F). Não prepare essa mídia com antecedência! Apenas prepare tanto mídia conforme necessário para a cultura BMDM.
   2. Dia 1: isolar as células da medula óssea de rato de acordo com o protocolo descrito anteriormente¹⁶ com uma modificação para limpar a medula óssea de fêmures e tíbias usando a mídia de base D10F. Use 2,5 mL de mídia D10F para lavar cada extremidade dos ossos (4). Lave as células da medula óssea diretamente em um coador de celular pre-molhado 40mm colocado em cima de um tubo de 50 mL. Os restantes meios de comunicação (~ 5 mL) podem ser usados para lavar o filtro da célula.
   3. Centrifugar as células coletadas da medula óssea em 350 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em um total de 30 mL de mídia de diferenciação de macrófagos (por rato).
   4. Preparar e rotular (6) pratos de Petri estéril de 10 cm. Placa de 5 mL de mídia de diferenciação do macrófago em cada em placa de Petri. Alíquota 5 mL de células de medula ressuspensão em meios de diferenciação de macrófagos em cada placa de Petri para um volume total de 10 mL por prato. Incubar durante 5 dias a 37 ° C, 5% CO_2.
   5. Dia 5: Aspire mídia das células. Lave uma vez com 1 a 2 mL de PBS e adicionar 10 mL de mídia de diferenciação do macrófago preparados na hora. Incube por mais 3 dias.
   6. Dia 8: Proceda à colheita BMDMs, conforme descrito abaixo.

2. a colheita, semeadura e injeção de BMDMs

1. Após 7 dias de crescente as BMDMs da mídia de diferenciação do macrófago, remova o sobrenadante. Lave os macrófagos aderentes uma vez com 1 a 2 mL de PBS. Aspire a PBS.
2. Distribuir 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA para cada macrófago placa e deixá-los na incubadora 37 ° C por 5-10 min com frequente tocando para separar as células. Dissociar os macrófagos trypsinized pipetando subindo e descendo com uma pipeta P1000 e coletar macrófagos em tubos de 50 mL contendo 10 a 15 mL de mídia DMEM completa. Lave a placa com mídia DMEM completa 2ml adicionais para colher qualquer restantes macrófagos.
   Cuidado: Não deixe os macrófagos em tripsina por mais de 10 min.
3. Centrifuga os tubos de 50 mL a 350 x g por 5 min. descartar o sobrenadante. Delicadamente, dissociar a pelota e ressuspender as células em 10 mL de mídia DMEM completa. Macrófagos de contagem usando um hemocytometer na presença de uma viabilidade da tintura como trypan azuis da seguinte forma:
   1. Por exemplo, misturar 90 µ l de Trypan azul com 10 µ l de células para uma 01:10 diluição.
   2. Dessa mistura, carregar 10 µ l em um hemocytometer e contar a praça central (grade de 5 x 5). A contagem total de células = contagem x 10⁴ x volume (10) x fator de diluição (10 mL).
4. Ajuste a suspensão de eritrócitos para ser 1 milhão/mL na mídia DMEM completa e placa de 4 mL da suspensão celular em cada prato de 6 cm.
   Nota: Um mínimo de 3 placas é necessário por experiência. Um prato de células será esquerda unstimulated, um segundo conjunto de células será estimulado através do cross-linking de FcγRs e o terceiro prato de células será usado para todos os adicionais experimentais e controles de fluxo cytometric.
5. Incube as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO₂.
6. No dia seguinte, Aspire o sobrenadante, lavagem de células, uma vez com 1 a 2 mL de PBS. Adicione 4 mL de mídia completa contendo 100-mouse ng/mL IFN-γ para cada placa. Incube as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO₂.
7. Se desejar, leve uma alíquota das células para avaliar a geração adequada de BMDMs por citometria de fluxo. Use 1 x 10⁶ células por teste e preparar tubos de poliestireno FACs para as seguintes condições: isotipo controle, manchado com F4/80 (ou alternativamente, manchado com CD11b).
8. Preparar a citometria de fluxo, manchando o tampão com a adição de 0,1% FBS em 1X PBS. Use somente esta quantidade de FBS para não anular os efeitos do soro-fome em etapas posteriores.
9. Alíquota 1 x 10⁶ células por tubo e centrifugar 750 x g por 5 min.
10. Lave uma vez por decantação ou aspiração sobrenadante e resuspending células em 2 mL de tampão de citometria de fluxo. Centrifugar a 750 x g por 5 min.
11. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 100 µ l de citometria de fluxo tampão de coloração. Adicione 1 µ l de anticorpo bloqueio do anti-rato CD16/32 Fc a cada tubo. Incube no gelo por 5 min.
12. Sem lavar, adicione 2 µ l de anti-rato FITC F4/80 ou 1 μl do anticorpo de CD11b anti-rato APC para os tubos "manchados" e uma quantidade similar do anticorpo correspondente controle isotipo para tubos "isotipo". Incube no gelo, no escuro, durante 30 min.
13. Lave as células, adicionando 2 mL de PBS diretamente para as células. Centrifugar a 750 x g por 5 min.
14. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 150 µ l de PBS.
15. Adquirir as amostras em um citômetro de fluxo, usando uma condição de parada de 100 µ l ou 10.000 eventos no portão de interesse e garantir que FSC, SSC, FL1 (FITC anti-rato F4/80) ou FL4 (APC anti-rato CD11b) canais são seleccionados para os parâmetros a serem analisados.
16. Usando o software de citometria de fluxo, abra uma trama de ponto para FSC (no eixo x) vs CCD (no eixo y) e desenhar um portão ao redor das células de interesse, excluindo as células mortas e os restos (as células mortas e os restos são eventos muito menores do que a população de célula principal e constar o lowe r à esquerda da trama).
17. Retenção sobre as células de interesse, abrir uma trama do histograma com FL1 (FITC anti-rato F4/80) ou FL4 (APC anti-rato CD11b) no eixo x.
18. Execute a amostra de "isotipo". Gerar um portão de marcador, assim que a maioria dos eventos de amostra "isotipo" está à esquerda do portão (< 1% positivo). Aplica este modelo para o arquivo de exemplo manchada.
19. Execute a amostra "manchada". Bem sucedida geração de BMDMs resultará em > 95% expressão de FITC anti-rato F4/80 ou APC anti-rato CD11b (figura 1A), enquanto as condições de cultura incorreta podem resultar em geração sub-ótimo de macrófagos (figura 1B).
    Nota: Se gerar BMDMs de vários genótipos, tome nota da expressão destes marcadores para cada lote de BMDM gerado, no caso que esta pode ser motivos para a exclusão de uma amostra de análise geração de ROS em resposta ao estímulo na avaliação.

3. reagentes e material de preparação para a medição de ROS

1. Reconstitua o reagente de detecção liofilizado de estresse oxidativo em 60 µ l de DMF anidro para produzir uma solução stock de 5 mM. Misture suavemente antes do uso.
   Nota: Afirma no manual do kit de ROS-ID que a vida de prateleira do reagente reconstituído é cerca de 1 semana a-20 ° C. Alíquotas imediatamente após reconstituição reagente em pequenos frascos de à prova de luz minimiza sua oxidação e maximiza a vida de prateleira a-20 ° C.
2. Reconstitua o reagente de detecção de superóxido liofilizado em 60 µ l de DMF anidro para produzir uma solução stock de 5 mM. Misture suavemente antes do uso.
   Cuidado: como indicado no manual do kit, tratar ambos os reagentes de detecção como possíveis agentes mutagénicos, cada um com cuidados e dispor de manipular corretamente.
3. Reconstitua o indutor de ROS (piocianina) em 20 µ l de DMF anidro para produzir uma solução stock de 50 mM.
4. Reconstitua o inibidor de ROS (N-acetil-L-cisteína) em 123 µ l de água desionizada para produzir uma concentração de 0,5 M das ações.
5. Etiqueta 5 mL redonda tubos de poliestireno (tubos de citometria de fluxo) com os controles experimentais e condições. (Ver 4. Condições de ensaio e controles)
6. Preparar o soro baixo DMEM (sem vermelho de fenol) com a adição de 0,1% FBS para DMEM livre de vermelho de fenol.
7. Alíquota do anticorpo anti-BSA em pequenas alíquotas (dependendo do uso) e armazená-los a-80 ° C.
8. Prepare uma solução stock de 100mg/mL BSA em HBSS (solução de sal de balanceamento de Hanks) ou PBS. Alíquota em 100 alíquotas µ l e loja a-20 ° C.
9. Preparar uma solução de 2 x das sondas ROS (2x solução sonda): para cada 10 mL de soro baixo DMEM, adicionar 4 µ l de reagente de detecção de estresse oxidativo (corante verde) e 4 µ l de reagente de detecção de superóxido (corante laranja).
10. Prepare 2 x soluções sonda contendo apenas reagente de detecção de estresse oxidativo (2x solução sonda, verde apenas), ou contendo apenas superóxido reagente de detecção (2x solução sonda, laranja somente). Preparar apenas a quantidade de reagente necessária para o experimento e sempre preparar a solução de 2x imediatamente antes da utilização.
    Nota: Para preparar volumes menores de 2 x solução de deteção, use um intermediário 01:10 diluição de tanto verde e laranja reagentes de detecção antes da diluição final em DMEM. Por exemplo, para preparar 1 mL de uma solução de deteção de 2x, diluir 1 µ l de cada sonda em 9 µ l de DMEM (01:10 intermediário diluição). Dilua 4 µ l do presente 01:10 intermediário diluição em 1 mL de DMEM.

4. condições e controles de ensaio

1. Inclua os seguintes controles experimentais para compensação do fluxo cytometric para cada experimento:
   a) imaculadas e unstimulated células.
   b) células coradas somente com o reagente de detecção de estresse oxidativo (reagente verde) e tratadocom com indutor de ROS.
   c) células manchadas só com o reagente de detecção superóxido (laranja reagente) e tratadocom com indutor de ROS.
2. Para cada rato ou replicar biológica, incluem as seguintes 6 condições:
   a) imaculadas e unstimulated células
   b) células manchadas e unstimulated
   c) manchado células tratadocom com indutor positivo
   d) manchadas de células tratadocom com indutor positivo e inibidor ROS
   e) células manchadas ativadas através do cross-linking FcγR
   f) células manchadas ativado através do cross-linking FcγR e tratadocom com inibidor ROS
3. Calcule a quantidade de 2 x solução sonda necessário baseado no número de ratos e condições (200 µ l do 2 x solução sonda será usado para cada condição que exigem coloração).
   Nota: Para um ensaio usando 6 ratos, o 5 condições que requerem manchar com as sondas serão necessários por rato. Isto traz o total número de condições para 30. Assim, a quantidade total de solução de sonda 2 x necessária é pelo menos de 6 mL (30 * 200 µ l).

5. célula preparação

1. Depois de aprontar os macrófagos durante a noite, aspirar o sobrenadante. Lave as células uma vez com PBS.
2. Soro de fome as células através da substituição de mídia com o mesmo volume de soro baixo DMEM. Para cada rato, um prato será tratado com anti-BSA IgG₁ enquanto soro morrendo de fome, enquanto o outro será deixado sem tratamento. Adicione apenas baixo soro DMEM placas não tratadas. Adicione soro baixo DMEM contendo 2,5 µ g/mL de IgG murino anti-BSA₁ para placas tratadas.
   Nota: Uma placa sem tratamento adicional é necessário para cada experimento para os controles de compensação do fluxo cytometric.
3. Incube as placas por 4 h a 37 ° C, 5% de CO₂.
4. Depois soro morrendo de fome, colhem as células por raspagem suave ou usando 0,2 mM EDTA em PBS. Recolhê-los em rotulado 5 mL redonda tubos e centrífuga-los a 750 x g durante 5 min. manter o controle de quais células foram tratadas com murino anti-BSA IgG₁.
5. Lave pelotas de célula uma vez com 2 mL de PBS para se livrar de qualquer anti-BSA residual das células tratadas.
6. Resuspenda o pellet celular em 600 µ l de soro baixo DMEM.
7. Da suspensão de célula 600 µ l, alíquota 200 µ l para o pre-rotulado 5ml fundo tubos redondos como segue:
   1. Partir de células não tratadas, tomar 200 µ l para tubos rotulados "unstimulated", 200 µ l para tubos rotulados "positivo indutor" e 200 µ l para tubos rotulados "indutor de positivo + inibidor"
   2. No de IgG anti-BSA₁ células tratadas, tomar 200 µ l para tubos rotulados "FcγR reticulação/FcγR XL" e 200 µ l para tubos rotulados "FcγR XL + inibidor"
   3. Partir de células não tratadas para ser usado para controles de compensação, levar 200 µ l para o tubo rotulado "inocente unstimulated", 200 µ l para o "verde + indutor" controle e 200 µ l para "laranja + indutor" de controle.
      Nota: Se as células de 5.7.1 e 5.7.3 derivam-se o mesmo mouse, as mesmo "inocente unstimulated" células podem ser usadas para o controle experimental e compensação. Se não, será necessário um adicional 200 µ l de células para um controle experimental "inocente unstimulated" para um).
8. Manter os tubos em gelo até coloração e estimulação. Durante a fome de soro e ligação de IgG_1, prepare as sondas, estímulos específicos e indutores conforme descrito abaixo.
   Nota: Se realizar o ensaio para a primeira vez, se o modelo não está disponível, ou nenhuma compensação após o fato está disponível no citômetro de fluxo e software correspondente, estimular e manchar os controles de compensação e executar esses sobre o citômetro de fluxo para executar compensação manual antes de adição de estímulos para amostras experimentais.

6. realizar o ensaio

1. Prepare 2 x solução positiva indutor, diluir a 1: 100 piocianina no 2 x solução de sonda (preparada no passo 3.9) para obter uma concentração de 2 x de 500 µM de piocianina (concentração final será de 250 µM). Além disso, dilua a piocianina 1: 100 em cada uma das "2 x solução de sonda, verde só" e "2 x sonda solução, laranja só" tubos preparados em 3.10.
   Nota: Ambas as condições marcadas com "indutor positiva" e "indutor de positivo + inibidor" serão tratadas com o indutor de positivo. Planejar de acordo ao calcular a quantidade de solução de indutor positivo 2 x para preparar. Por exemplo: se realizar o ensaio com 3 ratos, 6 condições (3 * 2) serão tratados com indutor positivo, então prepare-se 6 * 200 µ l = 1,2 mL de solução positiva indutor de 2x.
2. Preparar uma solução de BSA de 2x diluindo a solução estoque de BSA em 2 x solução sonda para obter uma concentração de 2 µ g/mL (concentração final será de 1 µ g/mL).
   Nota: Ambas as condições marcadas com "FcγR XL" e "FcγR XL + inibidor" serão tratadas com o 2 x solução de BSA. Planejar de acordo ao calcular a quantidade de solução para preparar. Por exemplo: se realizar o ensaio usando 3 ratos, 6 (3 * 2) condições serão tratadas com solução de BSA e então 6 * 200 µ l ou 1,2 mL de solução de BSA de 2x será necessária.
3. Antes de iniciar a estimulação específica (FcγR reticulação), certifique-se de que todos os reagentes e as células estão prontas. Coloque os tubos no gelo na ordem que eles serão estimulados.
4. Para citômetros com um mostruário, tome nota do tempo que o citômetro leva para analisar uma amostra e avançar para o próximo, incluindo qualquer mistura e sonda lavagem etapas (por exemplo 3,5 min).
   Nota: o sincronismo é muito crítico para este ensaio. Em ordem para todas as condições ser bem controlado, a estimulação precisa ser realizado para a hora exata (30 min) para cada condição. Estimular as células em ordem e incorporar o tempo de retardo entre aquisição de amostra pelo citômetro de fluxo. Por exemplo, se o tempo necessário para o citômetro de analisar uma amostra e avançar para o próximo é 3,5 min, estimulam as células na ordem que eles serão analisados cada 3,5 min.
5. Se realizando compensação manual neste ponto, estimule a tubos de controle a ser utilizado para compensação (etapa 5.7.3). Adicionar 200 µ l de "2 x solução de sonda, verde só" contendo indutor (de 6,1) para os tubos de marcado "verde + indutor" (passo 5.7.3). Adicionar 200 µ l de "2 x solução sonda, laranja só" contendo indutor (etapa 6.1) nos tubos marcados "laranja + indutor" (passo 5.7.3).
6. Incube as celulas por 30 min a 37 ° C, 5% de CO₂ no escuro.
7. Usando o software de citometria de fluxo, gerar rotular 3 arquivos de amostra para o controle "inocente, não tratada", "verde + indutor" e "laranja + indutor" amostras, certificando-se de indicar os canais/parâmetros a ser analisados (FSC, SSC, FL1 e FL2) e desejar parar condições (100 µ l, 3 min, etc.). Gerar e rotular um conjunto similar de arquivos para amostras experimentais.
8. Execute a amostra "imaculado, não tratada". Abra uma trama de ponto para FSC (no eixo x) vs CCD (no eixo y) e desenhar um portão ao redor das células de interesse, excluindo as células mortas e os restos (as células mortas e os restos são eventos muito menores do que a população de célula principal e aparecem no canto inferior esquerdo da trama).
9. Usando este portão de "células", abra outra trama do ponto do FL1 (eixo x) vs FL2 (eixo y). Desenhe um portão inicial quadrante. Ajuste os portões de quadrante para que os eventos aparecem no quadrante inferior esquerdo do enredo vs FL2 FL1.
10. Execute a amostra de "verde + indutor". Ajuste a tensão de modo que os eventos aparecem nos quadrantes inferiores esquerdos e direito da trama vs FL2 FL1. Aplica esta matriz de compensação a todos os 3 arquivos de amostra.
11. Execute a amostra de "laranja + indutor". Ajuste a tensão, de modo que os eventos aparecem na parte superior e inferior esquerda quadrantes da trama vs FL2 FL1. Aplica esta matriz de compensação a todos os 3 arquivos de amostra.
12. Verifique cada arquivo de compensação e certifique-se que "inocente, não tratada" eventos aparecem no quadrante inferior esquerdo, "verde + indutor" eventos aparecem nos quadrantes direito e esquerdos mais baixo e eventos "laranja + indutor" aparecem na parte superior e inferior esquerda quadrantes do vs FL1 FL2 enredo. Aplica a matriz de compensação para todos os arquivos de amostra experimental.
    1. Certifique-se de que a compensação adequada é aplicada a todos os arquivos de amostra de controle antes de aplicar a matriz de compensação para todos os arquivos de amostra experimental. Consulte a Figura 2 para dados representativos mostrando descompensada e amostras corretamente compensadas.
       Nota: Muitos cytometers designar FL1 como o padrão canal FITC/GFP (animado pelo azul laser 488 nm e detectado com um conjunto de filtro de 530/30) e FL2 como o canal padrão de PE (animado pelo azul laser 488 nm e detectado com um conjunto de filtro de 585/40). Nós usamos esta mesma convenção mas cuidado novo fluxo cytometry os usuários a consultar com seu gerente de núcleo de citometria de fluxo para assegurar que seus citômetro é configurado da mesma forma e que os canais apropriados são usados para detectar estas sondas. Dependendo do modelo do citômetro de fluxo e que acompanha o software, é possível efetuar a compensação antes ou depois que as amostras foram adquiridas. Se possível compensação após o fato, a etapa de compensação pode ser realizada após todas as amostras experimentais foram adquiridas pelo citômetro. Para cytometers com um alcance dinâmico, onde não são necessários ajustes de tensão de PGTO, um experimento de compensação também pode ser realizado em um dia separado e o modelo experimental (incluindo a matriz de compensação) pode ser salvo para reduzir o tempo necessário para executar compensação manual.
13. Uma vez que a compensação manual foi realizada e um modelo experimental é obtido, inicie o tratamento das amostras experimentais. Antes de tratar com indutor positiva ou estimulação de células FcγR, marca quais tubos obter inibidor ROS. Trate essas células com o ROS inibidor pelo menos 30 min antes do indutor positiva ou estimulação FcγR.
14. Para adicionar o inibidor ROS, prepare uma concentração final de 5 mM, acrescentando 1 µ l do inibidor a 200 µ l de células ressuspensa (sem anti-BSA IgG₁).
15. Tratar as células com o estímulo (ou indutor positivo) e carregar as células com as sondas ROS como segue:
    1. Para células unstimulated: Adicionar 200 µ l de solução de sonda sem qualquer estímulo de 2x a 200 µ l de suspensão de células rotulado "manchadas, unstimulated".
    2. Para controles positivos: Adicionar 200 µ l de 2 x solução positiva indutor (preparado na etapa 6.1) a 200 µ l de suspensão de células rotulados "indutor de positivo" ou "indutor de positivo + inibidor".
    3. Para as células estimuladas pelo FcγR do cross-linking (estímulo): Adicionar 200 µ l de 2 x solução de BSA (preparado em 6.2) a 200 µ l de suspensão de células rotulado "Fcγr XL" ou "FcγR XL + inibidor".
       Nota: Lembre-se de incorporar o tempo de retardo entre a análise da amostra adicionando estímulo cada min x onde x é o tempo de retardo entre a aquisição de uma amostra e o próximo.
16. Incube as celulas por 30 min a 37 ° C, 5% de CO₂ no escuro. Analise as amostras na ordem em que foram estimulados usando um citômetro de fluxo equipado com um mostruário. Use os modelos de análise gerados durante as etapas iniciais de compensação. Não lave as células antes da análise.

7. flow cytometry análise de dados e resultados esperados

1. Dentro do software de citometria de fluxo, abra os arquivos de análise gerada anteriormente para as amostras experimentais (modelos foram gerados nas etapas 6,7-6,12 e amostras foram executadas na etapa 6,16). Certifique-se de que a matriz de compensação da realização de compensação manual foi corretamente aplicada a amostras experimentais.
   Nota: Para citômetros e software de citometria de fluxo capaz de compensação após o fato, se a matriz de compensação não foi aplicada anteriormente para os arquivos de amostra experimental, aplicá-la neste momento.
2. Semelhante a verificação correta compensação manual, certifique-se de que os controles dentro das amostras experimentais se comportar conforme o esperado.
   1. Certifique-se de que os eventos de "imaculados, não tratados" aparecerá no quadrante inferior esquerdo do enredo FL1 vs FL2, que os eventos de "indutor positivo" mostram aumento da fluorescência no canto superior esquerdo, superior direito e inferior direito quadrantes da trama FL1 vs FL2 e que" indutor de positivo + inibidor ROS"eventos mostram uma redução na fluorescência no canto superior esquerdo, superior direito e inferior direito quadrantes do FL1 vs FL2 enredo em comparação com a fluorescência observado com a amostra de"indutor positiva".
   2. Se controles dentro das amostras experimentais não mostram qualquer aumento da fluorescência, verificar que todas as etapas do ensaio foram realizadas, verifique se a geração apropriada e escorva de macrófagos derivados da medula óssea (2.7-2.19) e repetir a experiência. Se controles dentro das amostras experimentais mostram as tendências esperadas, proceda para analisar amostras experimentais estimulada através do FcγR (Figura 3A).
3. Verifique se que o estímulo FcγR específico está funcionando adequadamente. Executar os exemplos a seguir de um rato C57BL/6J WT: "inocente, unstimulated", "manchado, unstimulated", "manchado, estimulados através da FcγR", e "manchada, estimulada através do FcγR + ROS inibidor". Elas correspondem às amostras 4.2 a, 4.2b, 4.2 e e 4.2f na seção 4, respectivamente.
   1. Certifique-se de que os eventos "inocente, unstimulated" aparecerá no quadrante inferior esquerdo do enredo vs FL2 FL1, que eventos "manchada, unstimulated" também aparecerá no quadrante inferior esquerdo do enredo vs FL2 FL1, que eventos "manchada, estimulado através da FcγR" Mostrar aumento da fluorescência no canto superior esquerdo, superior direito e inferior direito quadrantes da trama vs FL2 FL1 e que "manchada, estimulada através do FcγR + ROS inibidor" eventos mostrará diminuição da fluorescência no canto superior esquerdo, superior direito e inferior direito quadrantes da trama FL1 vs FL2 em comparação com a amostra "manchadas, estimulados através da FcγR" (Figura 3A).
   2. Se essas expectativas não são atendidas, por exemplo, a amostra "manchadas, estimulados através da FcγR" mostra mínima ou nenhum aumento da fluorescência, quando comparado com a amostra "manchadas, unstimulated", ou "manchadas, unstimulated" amostra já marcadamente aumento dos níveis de fluorescência em comparação com a amostra "imaculado, unstimulated", verificar que todas as etapas do ensaio foram realizadas corretamente, verifique se a geração apropriada, preparação e manipulação de BMDMs (2.7-2.19) e repetir a experiência. Se essas expectativas forem atendidas, proceda à análise do resto das amostras experimentais.
      Nota: Células produzindo ROS que reagem com a sonda verde (peróxido de hidrogênio, peroxinitrito, radicais hidroxila, óxido nítrico, os radicais peróxido, etc.) irão aparecer no canto superior direito e inferior direito quadrantes de um log FL1 (eixo x) contra um log FL2 trama do ponto do (eixo y). Células produzindo ROS que reagem com a sonda laranja (principalmente mas não exclusivamente superóxido) aparecerá nos dois superiores quadrantes de um log FL1 (eixo x) contra um log FL2 trama do ponto do (eixo y).
4. Gere histogramas individuais, condomínio fechadas sobre as células de interesse, para análise da fluorescência FL1 e FL2. Usando as amostras "imaculadas, unstimulated", gere um marcador de histograma, tal que todos os eventos de "imaculados, unstimulated" aparecem à esquerda deste marcador. Aplica este enredo com o marcador para o resto das amostras experimentais (Figura 3B).
5. Apresente os resultados do experimento como a porcentagem de células positivas para cada uma das sondas ROS ou mostrando a intensidade de fluorescência média (IFM) das amostras estimuladas versus controle (Figura 3).

8. célula de coloração da superfície em combinação com a análise de fluxo cytometric da produção de ROS (opcional)

Nota: Este passo fornece um protocolo para a coloração de macrófagos com um marcador de pilha-superfície antes da estimulação da medição FcγR e ROS. Isto pode ser útil na avaliação de produção de ROS em populações de células mistas. É importante escolher um anticorpo para marcador de superfície de macrófagos conjugada com um apropriado fluor que não interfere com a fluorescência dos reagentes de detecção oxidativos estresse ou superóxido. Neste protocolo, um anticorpo para mouse que F4/80 conjugada com Alexa fluor 647 é usado.

1. Gerar BMDMs, colheita e prime-los conforme descrito anteriormente (seções 1 e 2).
   Nota: Um mínimo de três placas de 6 cm são necessários para executar todos os controles experimentais e condições, conforme descrito abaixo. Uma placa será tratada com anti-BSA IgG₁ enquanto não tratada soro enquanto as outras duas placas serão deixadas a morrer de fome.
   1. Inclui 4 controles experimentais que serão utilizados para a compensação do fluxo cytometric (por experiência):
      a) imaculadas e unstimulated células.
      b) células tratadocom com o reagente de detecção de estresse oxidativo (reagente verde) e o indutor de ROS.
      c) as células tratadocom com o reagente de detecção de superóxido (laranja reagente) e indutor de ROS.
      d) células coradas somente com anti-rato que F4/80 conjugada com Alexa 647.
   2. Para cada rato ou replicar biológica, incluem as seguintes 3 condições:
      a) corados com F4/80 e esquerda unstimulated
      b) manchado com F4/80 e ativado através do FcγR
      c) manchado com F4/80 e ativado através do FcγR e tratados com inibidor ROS
2. Depois de aprontar os macrófagos durante a noite, aspirar o sobrenadante. Lave as células uma vez com 1 a 2 mL de PBS. Soro de fome as células, substituindo os meios de comunicação com o mesmo volume de soro baixo DMEM. Para cada rato, um prato será tratado com anti-BSA IgG₁ enquanto o soro a morrer de fome, enquanto os outros dois pratos vai ser tratada. Incube as placas por 4 h a 37 ° C, 5% de CO₂.
3. Depois soro morrendo de fome, colhem as células por raspagem suave ou usando 0,2 mM EDTA em PBS. Recolher cada placa em rotulado 5 mL redonda tubos e centrífuga-los a 750 x g durante 5 min. manter o controle de quais células foram tratadas com murino anti-BSA IgG₁.
4. Lave pelotas de célula uma vez com 1 a 2 mL de PBS para se livrar de qualquer anti-BSA residual das células tratadas.
5. Resuspenda um dos rolos da chapa que não conseguiu de IgG anti-BSA₁ em 600 µ l de soro baixo DMEM celular. Estas células serão não ser submetido a coloração da superfície celular. Usá-las para controles de compensação. Alíquota 200 µ l da suspensão celular em (3) 5 mL redondo fundo tubos etiquetados) um imaculado, unstimulated b) verde estresse oxidativo reagente indutor de ROS, reagente de detecção de superóxido c) laranja + indutor de ROS.
6. Ressuspender dentre a célula pelotas da placa que não conseguiu anti-BSA IgG_1, em 300 µ l de citometria de fluxo, manchando o tampão (PBS + 0,1% FBS). Alíquota 100 µ l de suspensão celular em (2) 5 mL redonda tubos para coloração com Alexa 647 anti-rato F4/80.
7. Resuspenda as pelotas de célula da placa que recebeu de IgG anti-BSA₁ em 300 µ l de buffer coloração de citometria de fluxo. Alíquota 100 µ l de suspensão celular em (2) 5 mL redonda tubos para coloração com Alexa 647 anti-rato F4/80.
8. Manche as células, que foram aliquotadas em 8.6 e 8.7, com 5 µ l de Alexa 647 anti-rato F4/80 por 30 min no gelo, no escuro.
9. Depois da coloração, lavagem de células, adicionando 2 mL de PBS e centrifugar a 750 x g, aspirar o sobrenadante e ressuspender cada tubo em 200 µ l de soro baixo DMEM sem vermelho de fenol. Reserve um tubo não tratado para servir como controle de FL4 isoladamente manchada. Prepare-se sondas, indutor, FcγR estímulo e inibidores ROS conforme indicado nas seções 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 e 6.14.
   1. Para células não recebendo anti-BSA IgG₁, Rotule os tubos com o seguinte: um) sem estímulo ou indutor b) ROS.
   2. Para as células que receberam anti-BSA IgG₁, etiqueta com o seguinte: um) Fc XL ou b) Fc XL + inibidor.
10. Estimule as amostras para ser usado para a compensação de acordo com seus respectivos tratamentos, conforme indicado em 6.5-6.6, na ordem em que eles serão lidos sobre o citômetro de fluxo, incorporando o tempo de retardo entre a aquisição de uma amostra e o próximo.
11. Incube as celulas por 30 min a 37 ° C, 5% de CO₂ no escuro. Analise as amostras na ordem em que foram estimulados usando um citômetro de fluxo equipado com um mostruário.
12. Realize a compensação manual como descrito em 6,7-6,12 e análise de dados conforme descrito na seção 7.
13. Usando o software de citometria de fluxo, gerar e rotular os 4 arquivos de exemplo para o controle "inocente, não tratada", "verde + indutor", "laranja + indutor" e "F4/80 manchado" amostras, certificando-se de indicar os canais/parâmetros para ser analisado (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) e condições de parada desejada (100 µ l, 3 min, etc.).
14. Executar os exemplos e gerar lotes do ponto para realizar compensação manual.
    1. Para a coloração da superfície celular, gerar duas parcelas adicionais: FL1 (eixo x) vs FL4 (eixo y) e FL2 (eixo x) vs FL4 (eixo y). Ajuste as tensões para garantir que a compensação adequada é aplicada como mostrado na Figura 7A. Uma vez que todas as compensações foi executada corretamente, aplica a matriz de compensação para todos os arquivos de amostra experimental.
15. Uma vez que a compensação manual foi realizada e um modelo experimental é obtido, iniciar o tratamento das amostras experimentais, conforme indicado em 6.13-6.15.3 e adquirir amostras em um citômetro de fluxo, conforme descrito em 6.16.

Resultados

Usando o protocolo descrito dentro, apresentamos dados representativos, demonstrando a deteção de cytometric do fluxo de produção de ROS, resultante da estimulação da WT C57BL/6J BMDMs através da FcγR. Como esperado, observamos alterações mínimas na fluorescência FL1 ou FL2 acima dos níveis de fundo nas células unstimulated (Figura 3A, comparar "manchadas, unstimulated" vs "imaculado, unstimulated" ponto parcelas). Observamos um aumento na fluorescência FL1 e FL2, quando as c?...

Discussão

₂-[NULL] de Diniz Melo e detecção baseada em DHE de ROS é uma técnica amplamente utilizada^14,15. Facilidade de uso e a adaptabilidade destas sondas ROS para formatos de microplacas cinética, análise de fluorescência microscopia ou fluxo cytometric contribuiu para sua popularidade. No entanto, em nossos estudos de funções de macrófagos mediada por FcγR, lá não parecem ser um protocolo padrão para a realização deste ensaio para análise d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BSA IgG1	Innovative Research	IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400626
Anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647	BD Biosciences	565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC	BioLegend	123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647	BioLegend	101218
beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV	Fisher	BP1600-100
C57BL/6J	Jackson labs	Stock No.000664
CM-H2DCFDA	Molecular Probes	C6827	Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE)	Molecular Probes	D11347	Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x	Corning	10-013-CV
DMEM no phenol red	Gibco	31053-028
DMF Anhydrous	Acros Organics	61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400506
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
L glutamine	Gibco	25030-081
LADMAC cells	ATCC	CRL-2420
MEM	Corning	10-010-CV
mouse IFN-g	GoldBio	1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine	EMD Milipore	106425	Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler	Acea	2060R
Pyocyanin (ROS inducer)	Cayman chemical	10009594	Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit	ENZO	ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056